ciRS-7可调控宫颈癌干细胞的干性及机制

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.1690

中国组织工程研究 ›› 2019, Vol. 23 ›› Issue (13): 2009-2015.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.1690

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ciRS-7可调控宫颈癌干细胞的干性及机制

程海燕¹，龙贺明²，谢晓英¹，李峰¹

赣南医学院第一附属医院，¹妇产科，²肿瘤内科，江西省赣州市 341000

修回日期:2019-01-16 出版日期:2019-05-08 发布日期:2019-05-08
通讯作者: 程海燕，硕士，主治医师，赣南医学院第一附属医院妇产科，江西省赣州市 341000
作者简介:程海燕，女，1984年生，江西省新余市人，汉族，2011年南昌大学医学院毕业，硕士，主治医师，主要从事妇产科方面的研究。
基金资助:
江西省卫生厅科技计划(20175374)，项目负责人：程海燕

ciRS-7 regulates the stemness of cervical cancer stem cells: effects and mechanisms

Cheng Haiyan¹, Long Heming², Xie Xiaoying¹, Li Feng¹

¹Department of Obstetrics and Gynecology, ²Department of Internal Medicine-Oncology, First Affiliated Hospital of Gannan Medical College, Ganzhou 341000, Jiangxi Province, China

Revised:2019-01-16 Online:2019-05-08 Published:2019-05-08
Contact: Cheng Haiyan, Department of Obstetrics and Gynecology, First Affiliated Hospital of Gannan Medical College, Ganzhou 341000, Jiangxi Province, China
About author:Cheng Haiyan, Master, Attending physician, Department of Obstetrics and Gynecology, First Affiliated Hospital of Gannan Medical College, Ganzhou 341000, Jiangxi Province, China
Supported by:
the Scientific Research Plan of Jiangxi Health Department, No. 20175374 (to CHY)

摘要/Abstract

摘要：

文章快速阅读：

文题释义：
circRNA：为长度数百至数千个碱基的RNA，属于非编码RNA，具有有限的编码蛋白质能力。circRNA广泛存在于各组织细胞中，其在多种疾病中表达失调。越来越多的研究表明circRNA在肿瘤细胞增殖、侵袭和转移等过程中具有重要作用，目前在肿瘤中的研究逐渐成为热点。
肿瘤干细胞：是近几年在肿瘤细胞中发现的，具有胚胎干细胞类似的特性即自我分化和多能性。虽然肿瘤干细胞仅具有一小部分，但是它被认为是肿瘤发生的源头，是肿瘤侵袭和转移的动力，同时与肿瘤的复发、耐药和放疗抵抗密切相关，在肿瘤的恶性生物学行为中发挥关键作用。

摘要
背景：研究表明ciRS-7参与多种肿瘤的发生发展，而其在宫颈癌干细胞领域的研究较少。
目的：观察ciRS-7在宫颈癌组织及宫颈癌干细胞中的表达水平，并探讨其对宫颈癌干细胞干性的影响及作用机制。
方法：①qRT-PCR检测ciRS-7在宫颈癌组织和正常宫颈组织中表达，并分析其与临床参数的关系；②分离培养原代宫颈癌细胞，流式细胞仪筛选出CD44⁺宫颈癌干细胞。qRT-PCR检测ciRS-7在CD44⁺宫颈癌干细胞中的表达；③经脂质体分别转染ciRS-7 siRNA(si-ciRS-7)和阴性对照siRNA (si-NC) 48 h后，MTS实验、软琼脂克隆形成实验、Transwell实验检测宫颈癌干细胞增殖能力、肿瘤球形成能力、转移能力，qRT-PCR检测各组宫颈癌干细胞中miR-7表达，Western blot检测各组宫颈癌干细胞中PTEN、p-PI3k和p-Akt蛋白表达；④将敲减ciRS-7的宫颈癌干细胞注射到BALB/c裸鼠皮下，观察抑制ciRS-7表达对宫颈癌干细胞体内成瘤能力的影响。

结果与结论：①ciRS-7在宫颈癌组织中的表达显著高于正常宫颈组织，且与肿瘤大小及淋巴结转移相关(P < 0.05)，同时ciRS-7在宫颈癌干细胞中的表达显著升高(P < 0.05)；②与阴性对照组比较，si-ciRS-7组宫颈癌干细胞增殖减慢、肿瘤球形成能力下降、转移能力减弱、miR-7表达升高、PTEN抑癌蛋白表达升高、p-PI3k和p-Akt促癌蛋白表达降低，差异均有显著性意义(P < 0.05)；③si-ciRS-7组裸鼠成瘤体积显著小于阴性对照组(P < 0.05)；④结果表明，ciRS-7在宫颈癌组织和宫颈癌干细胞中高表达，ciRS-7可能通过上调miR-7的表达，调控PTEN/PI3K/AKT信号通路实现对宫颈癌干细胞干性的抑制作用。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程
ORCID: 0000-0002-6271-4789(程海燕)

关键词: 宫颈癌, 肿瘤干细胞, 环状RNAs, ciRS-7, RNA干扰, 细胞干性, 宫颈组织, 肿瘤球

Abstract:

BACKGROUND: Studies have shown that ciRS-7 is involved in the development of a variety of tumors, but there are few studies concerning the effect of ciRS-7 in cervical cancer stem cells.
OBJECTIVE: To study the expression levels of ciRS-7 in cervical cancer tissues and cervical cancer stem cells, and to explore its effect on the stemness of cervical cancer stem cells and the relevant mechanism.
METHODS: (1) qRT-PCR was used to detect the expression of ciRS-7 in cervical cancer tissues and normal cervical tissues, and its relationship with clinical parameters was analyzed. (2) Primary cervical cancer cells were isolated and cultured, and CD44⁺ phenotype of cervical cancer stem cells was screened by flow cytometry. qRT-PCR was then used to detect the expression of ciRS-7 in the cervical cancer stem cells. (3) After transfection of ciRS-7 siRNA (si-ciRS-7) and control (si-NC) for 48 hours, MTS was used to detect the proliferation of cervical cancer stem cells in each group. Soft agar cloning assay was used to detect the tumor formation ability of each group. Transwell assay was used to detect the metastatic ability of cervical cancer stem cells. The expression of miR-7 in cervical cancer stem cells was detected by qRT-PCR. The expressions of PTEN, p-Pi3k and p-Akt in cervical cancer stem cells were detected by western blot. (4) Cervical cancer stem cells with ciRS-7 knockdown were subcutaneously injected into BALB/c nude mice, to observe the effect of ciRS-7 on the tumorigenic ability of cervical cancer stem cells.
RESULTS AND CONCLUSION: (1) The expression of ciRS-7 in cervical cancer tissues was significantly higher than that in normal cervical tissues, and it was correlated with tumor size and lymph node metastasis (P < 0.05). Meanwhile, the expression of ciRS-7 significantly elevated in cervical cancer stem cells (P < 0.05). (2) In the si-ciRS-7 cell group, the cell proliferation was slowed down, the tumor-forming ability was decreased, the ability to metastasis was weakened, the expression of miR-7 was increased, the expression of PTEN was increased, and the expression of p-Pi3k and p-Akt was decreased as compared with the negative control group (P < 0.05). The tumor-forming volume in the si-ciRS-7 cell group was significantly smaller than that in the negative control group (P < 0.05). In conclusion, ciRS-7 is highly expressed in cervical cancer tissues and cervical cancer stem cells. ciRS-7 may promote the stemness of cervical cancer stem cells by inhibiting the expression of miR-7 and regulating PTEN/PI3K/AKT signaling pathway.

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

Key words: Uterine Cervical Neoplasms, Neoplastic Stem Cells, RNA Interference, Tissue Engineering

中图分类号:

程海燕，龙贺明，谢晓英，李峰. ciRS-7可调控宫颈癌干细胞的干性及机制[J]. 中国组织工程研究, 2019, 23(13): 2009-2015.

Cheng Haiyan, Long Heming, Xie Xiaoying, Li Feng. ciRS-7 regulates the stemness of cervical cancer stem cells: effects and mechanisms[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2019, 23(13): 2009-2015.

图/表（结果） 1

2.1 ciRS-7在宫颈癌组织和正常宫颈组织中的表达 qRT-PCR检测ciRS-7在40例宫颈癌组织中的表达及与临床参数的关系。结果显示：ciRS-7在宫颈癌组织中的表达高于正常宫颈组织，见图1A，且在肿瘤T>4 cm及淋巴结转移的组织中高表达(P < 0.05)，见图1B，C。

2.2 宫颈癌干细胞的分选 利用流式细胞仪将新鲜肿瘤组织原代分离培养的肿瘤球进行分选，结果筛选出CD44⁺细胞约占全部细胞的3.01%。Western blot检测肿瘤干细胞标记基因Nanog、Sox2蛋白在CD44⁺细胞中的表达显著高于CD44^-细胞，见图2。qRT-PCR检测结果显示ciRS-7在CD44⁺细胞中的表达为7.21±0.53，显著高于在CD44^-细胞中的表达(1.02±0.07)，差异有显著性意义(P < 0.05)。

2.3 MTS检测抑制ciRS-7表达对宫颈癌干细胞增殖的影响 与阴性对照组相比，si-ciRS-7组细胞增殖能力明显减慢，差异有显著性意义(P < 0.05)，见图3。

2.4 软琼脂克隆实验检测抑制ciRS-7表达对宫颈癌干细胞克隆形成能力的影响 si-ciRS-7组肿瘤克隆球形成明显小于阴性对照组，见图4。

2.5 Transwell小室检测抑制ciRS-7表达对宫颈癌干细胞转移能力的影响 si-ciRS-7组和阴性对照组细胞穿膜数分别为21.31±4.87，63.51±9.24。si-ciRS-7组细胞转移能力明显低于阴性对照组，差异有显著性意义(P < 0.05)，见图5。

2.6 抑制ciRS-7表达对宫颈癌干细胞体内成瘤能力的影响 si-ciRS-7组裸鼠瘤体体积显著低于阴性对照组，差异有显著性意义(P < 0.05)，见图6。

2.7 抑制ciRS-7表达对宫颈癌干细胞中miR-7表达的影响 采用qRT-PCR测定si-ciRS-7组和阴性对照组宫颈癌干细胞中miR-7表达水平，分别为7.65±1.01，1.00±0.02，两组比较差异有显著性意义(P < 0.05)。

2.8 抑制ciRS-7表达对宫颈癌干细胞中PTEN、p-PI3k和p-Akt蛋白表达的影响 与阴性对照组相比，si-ciRS-7组PTEN抑癌蛋白表达显著升高，p-PI3k和p-Akt促癌蛋白表达显著降低，见图7。

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引言

材料方法

1.1 设计 细胞学实验。

1.2 时间及地点 实验于2016年10月至2018年10月在赣南医学院第一附属医院临床试验中心完成。

1.3 材料

1.3.1 实验试剂 Ⅳ型胶原酶及表皮生长因子(美国Sigma公司)；TRIzol、反转录及qRT-PCR试剂盒等(日本TaKaRa公司)；MTS增殖检测试剂盒及聚偏二氟乙烯膜(美国Promega公司)；RIPA高效裂解液(北京索莱宝科技有限公司)；BCA蛋白浓度检测试剂盒(美国Thermo公司)；抗体(美国Abcam公司)，包括Nanog兔抗人ab21624、Sox2兔抗人ab92494、PTEN兔抗人ab32199、p-PI3K兔抗人ab191606、p-AKT鼠抗人ab81283、GAPDH鼠抗人ab9484。

1.3.2 实验动物 雌性4周龄BALB/c裸鼠5只，体质量25 g左右，购自北京维通利华实验动物技术有限公司。

1.3.3 临床样本 纳入标准：首次手术病理证实为宫颈癌，具备完整的病历资料，术前未接受化疗、放疗等任何抗肿瘤治疗，未合并其他肿瘤及威胁生命健康的疾病。筛选出2017年1月至2018年6月期间入住赣南医学院第一附属医院的宫颈癌患者40例，年龄32-66岁，中位年龄54岁，年龄≤45岁19例、>45岁21例；肿瘤大小：T≤4 cm 23例、T>4 cm 17例；病理类型：腺癌12例，鳞癌28例；分化程度：高分化者18例，低分化者22例；无淋巴结转移者22例，有淋巴结转移者18例。另选择由于子宫良性病变等原因切除的正常宫颈组织，患者年龄35-70岁，与宫颈癌患者具有可比性。收集宫颈癌组织及正常宫颈组织后立即冻存于液氮中。该实验遵循赫尔辛基宣言，由赣南医学院第一附属医院伦理委员会审核批准，签署知情同意书。

1.4 方法

1.4.1 qRT-PCR检测ciRS-7在宫颈癌组织和正常宫颈组织中的表达 宫颈癌组织和正常宫颈组织用PBS洗涤2次后加入1 mL TRIzol裂解液，冰上裂解10 min移至EP管中，加入200 μL氯仿震荡混合数次，静置5 min后12 000 r/min、4 ℃离心30 min，吸取上层水相层溶液与等体积的异丙醇混匀，12 000 r/min，4 ℃离心15 min，体积分数为85%乙醇洗涤沉淀，适量DEPC水溶解RNA。按照说明书以总RNA反转录cDNA作为模板进行qRT-PCR。ciRS-7引物F：5'-ACG TCT CCA GTG TGC TGA-3'，R：5'-CTT GAC ACA GGT GCC ATC-3'，内参GAPDH引物F：5'-GGA GCG AGA TCC CTC CAA AAT-3'，R：5'-GGC TGT TGT CAT ACT TCT CAT GG-3'。分析各样品的循环阈值(threshold cvcle，Ct)，采用2^-??Ct法计算ciRS-7的相对表达量。

1.4.2 肿瘤细胞分离和宫颈癌干细胞的培养 于无菌环境将新鲜宫颈癌组织用含有抗真菌和抗生素的缓冲液冲洗，将组织剪碎后放入含有1 g/L Ⅳ型胶原酶的无血清DMEM-F12培养基中，37 ℃摇床上消化1 h，用含体积分数为10%胎牛血清的DMEM-F12培养基终止消化后，微米孔径尼龙细胞无菌过滤器过滤组织碎块，2 000 r/min离心5 min，将细胞重悬在含有表皮生长因子的无血清DMEM-F12培养基中，2周左右时开始形成细胞球，流式细胞仪分选出CD44⁺宫颈癌干细胞，在无血清培养基中悬浮扩大培养。

1.4.3 细胞转染及裸鼠移植瘤模型的构建 将ciRS-7 siRNA及其阴性对照siRNA与脂质体2000混合后转染宫颈癌干细胞，48 h后更换含1.0 mg/L G418的新鲜培养基培养，48 h更换1次，筛选至所有细胞均可观察到绿色荧光。将构建成功的稳转细胞株分别注射到裸鼠右侧腋下，每组5只裸鼠，注射量为每只8×10⁶个(100 μL)。每4 d测量瘤体积1次，4周后处死裸鼠，所有操作均符合动物伦理学要求。

1.4.4 MTS实验检测宫颈癌干细胞增殖情况 每孔3×10³个宫颈癌干细胞接种于96孔培养板，24 h后转染ciRS-7 siRNA及其阴性对照siRNA，每组6个复孔。在转染后第0，24，48，72小时，每孔加入20 μL MTS工作液，37 ℃细胞培养箱孵育2 h，酶标扫描仪检测490 nm处各孔吸光度值，以时间为横坐标，吸光度值为纵坐标，绘制细胞生长曲线。

1.4.5 软琼脂克隆形成实验检测宫颈癌干细胞克隆形成能力 20%无血清培养基与1.2%无菌软琼脂1∶1混匀后，均匀铺至培养皿中冷却至固态做为底层胶；同时将20%无血清培养基与0.6 %高压灭菌的软琼脂1∶1充分混匀做为上层胶。取转染48 h后的各组宫颈癌干细胞以每孔1×10⁵个细胞、100 μL培养基与37 ℃预热的上层胶充分混匀后，铺至固态的底层胶上，放至培养箱中培养，每天显微镜下观察并拍照。

1.4.6 Transwell小室检测宫颈癌干细胞转移能力 无血清培养基洗涤转染48 h后的各组宫颈癌干细胞3次，以每孔1×10⁵个细胞、100 μL无血清培养基接种于Transwell小室的上室，下室加500 μL完全培养基作为趋化因子，放至培养箱中培养，显微镜下观察下室穿过10个细胞时终止培养，取出聚碳酸酯微孔膜，PBS洗3次，甲醇固定15 min，苏木精染色。随机计数显微镜下5个视野穿过的细胞，取其均值代表细胞转移能力。

1.4.7 qRT-PCR检测宫颈癌干细胞miR-7的表达水平 取转染48 h后的各组宫颈癌干细胞，用PBS洗涤2次后加入1 mL TRIzol裂解液，冰上裂解10 min移至EP管中，加入200 μL氯仿震荡混合数次，静置5 min后12 000 r/min、4 ℃离心30 min，吸取上层水相层溶液与等体积的异丙醇混匀，12 000 r/min，4 ℃离心15 min，体积分数为85%乙醇洗涤沉淀，适量DEPC水溶解RNA。按照说明书以总RNA反转录cDNA作为模板进行qRT-PCR。miR-7引物F：5'-CCA CGT TGG AAG ACT AGT GAT TT-3'，R：5'-TAT GGT TGT TCT GCT CTC TGT CTC-3'，内参GAPDH引物F：5'-GGA GCG AGA TCC CTC CAA AAT-3'，R：5'-GGC TGT TGT CAT ACT TCT CAT GG-3'。分析各样品的循环阈值(threshold cvcle，Ct)，采用2^-??Ct法计算miR-7的相对表达量。

1.4.8 Western blot检测宫颈癌干细胞PTEN、p-PI3k和p-Akt蛋白表达 转染48 h后的各组宫颈癌干细胞，RIPA超声裂解30 min后4 ℃、14 000 r/min离心20 min，上清移至新的EP管中，BCA试剂盒检测蛋白浓度，煮沸变性冷却后，样品进行SDS-PAGE电泳，350 mA湿转2 h，8%脱脂牛奶室温封闭1 h，稀释一抗Nanog(1∶200)、Sox2 (1∶1 000)、PTEN(1∶10 000)、p-PI3K(1∶1 000)、p-Akt(1∶5 000)、GAPDH(1∶1 000)，室温孵育2 h或4 ℃过夜，TBST洗3次后，兔二抗和鼠二抗(稀释比均为1∶8 000)室温孵育1 h，ELC化学发光法曝光条带。

1.5 主要观察指标 ①qRT-PCR检测宫颈癌组织和正常宫颈组织中ciRS-7表达；②MTS检测宫颈癌干细胞增殖能力；③软琼脂克隆形成实验检测宫颈癌干细胞干性；④Transwell实验检测宫颈癌干细胞转移能力；⑤Western blot检测宫颈癌干细胞PTEN、p-PI3k和p-Akt蛋白表达。

1.6 统计学分析 采用SPSS 19.0软件进行统计分析。数据均为正态计量资料，以x(_)±s表示，采用两独立样本t 检验或配对样本t 检验分析两组间的差异，P < 0.05为差异有显著性意义。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

讨论

宫颈癌是妇科最致命的恶性肿瘤之一，流行病学统计数据显示每年全球新发病例超过50多万，死亡病例超过23万，而在中国2015年统计显示约有10万病例和3万死亡病例，宫颈癌在发展中国家的发病率和死亡率显著高于发达国家^[11-12]。一方面由于人乳头病毒感染、性生活过早及慢性宫颈炎症等因素使得宫颈癌的发病率仍在不断上升^[13-14]，另一方面由于宫颈癌早期缺乏典型的临床症状，患者确诊时往往发生转移，虽然医疗技术不断进步，但是宫颈癌患者5年生存率仍较低^[2-3]。肿瘤转移是90%患者死亡的原因，研究显示淋巴结转移的数量及两侧转移与预后呈负相关，淋巴结转移患者的5年生存率(41.1%)明显低于无淋巴结转移患者(91.9%)^[15-16]。越来越多的研究报道肿瘤干细胞是肿瘤起始、恶性转移和复发等促进肿瘤恶性行为的原始细胞，其具有胚胎干细胞多能性和自我更新能力^[4^，^17]。肿瘤干细胞已成为当前肿瘤治疗和干预的重要关注点。因此研究调控宫颈癌干细胞干性的机制，寻找潜在靶点是改善宫颈癌患者预后的有效途径。

circRNA是20世纪70年代通过电子显微镜在细胞中新发现的，具有有限编码蛋白质能力，长度为数百至数千个碱基的RNA，属于超过人类转录本90%的非编码RNA家族成员之一^[18-19]。circRNA结构为稳定共价闭合的连续环，广泛保守的存在各组织细胞中，3万多个circRNA利用高通量测序技术已被确定，circRNA的表达失调与神经系统疾病、动脉粥样硬化血管疾病风险等密切相关^[20-21]，近年来发现circRNA充当促癌因子和抑癌因子在肿瘤的发生发展中也发挥重要作用，circRNA8924在宫颈癌组织中高表达，促进肿瘤细胞增殖、侵袭和转移^[22]；hsa_circ_0014717在结直肠癌组织和细胞系中下调，与患者的TNM分期、远处转移和较差的总体存活率显著相关，在体外抑制肿瘤细胞增殖和集落形成，在体内抑制异种移植肿瘤生长^[23]。circRNA调控肿瘤干细胞的研究较少，Wu等^[24]报道circRNA hg19_circ_0005033可促进喉癌干细胞的增殖、迁移、侵袭和化疗耐药；Circ008913在HaCaT细胞中高表达，通过miR-889调节DAB2IP/ZEB1，参与亚砷酸盐诱导的人类角质形成细胞在癌变过程中获得肿瘤干细胞样特性^[25]。circRNA在宫颈癌干细胞领域的研究尚未见报道。circRNA ciRS-7又称Cdr1as，为目前在肿瘤中研究较广泛的circRNA，ciRS-7在三阴乳腺癌中高表达，维持肿瘤细胞的高转移和侵袭特性^[26]；ciRS-7在食管鳞状细胞癌中上调，并且与患者的不良临床病理参数显著相关，ciRS-7的过表达促进肿瘤细胞的增殖、迁移和侵袭^[27]。ciRS-7在宫颈癌中的表达情况未知，实验采用qRT-PCR检测发现ciRS-7在宫颈癌组织中的表达显著高于正常宫颈组织，且与肿瘤大小及淋巴结转移显著相关，提示ciRS-7可能与宫颈癌的增殖和转移相关，因此ciRS-7是否与宫颈癌干细胞的干性相关引起研究者的关注。

肿瘤干细胞为肿瘤中极少的一部分高度异质性的细胞，对其分离培养有一定的难度，目前分离肿瘤干细胞的方法主要为无血清悬浮培养和基于肿瘤干细胞表面免疫学分子标记物流式分选法^[28]，其中CD44为宫颈癌干细胞表面免疫学分子标记物之一^[29]，实验采用无血清悬浮培养和基于CD44流式筛选两种方法结合筛选出占总细胞3.01%的CD44⁺细胞，为了验证CD44⁺细胞是否为宫颈癌干细胞，采用Western blot检测Nanog和Sox2蛋白在CD44⁺细胞中的表达水平，Nanog和Sox2是维持肿瘤干细胞干性所必须的转录因子，是肿瘤干细胞的标记物^[30]，结果显示CD44⁺细胞中Nanog和Sox2蛋白的表达显著高于CD44^-细胞，说明CD44⁺细胞为宫颈癌干细胞，扩大培养后作为工具细胞进行后续实验。为进一步研究ciRS-7高表达是否与宫颈癌干细胞的干性相关，在体外采用MTS实验、软琼脂克隆形成实验及Transwell小室实验分别检测转染ciRS-7对宫颈癌干细胞增殖、克隆形成和转移能力的影响，结果表明干扰ciRS-7的表达显著抑制宫颈癌干细胞的增殖、克隆形成和转移能力。成瘤性是肿瘤干细胞最具标志的干性，是检测肿瘤干细胞干性的金标准^[28]，实验将成功构建的敲减ciRS-7的宫颈癌干细胞系注射到裸鼠体内，结果显示敲减ciRS-7组成瘤体积较小，敲减ciRS-7显著抑制宫颈癌干细胞体内成瘤能力。体内和体外实验均表明干扰ciRS-7的表达具有抑制宫颈癌干细胞干性的生物学功能，其作用机制仍需进一步探讨。

circRNA含有非编码RNA家族另一成员miRNA的反应元件，可以作为竞争性内源RNA(ceRNA)与miRNA相互作用调节靶基因mRNA的表达^[31]。ciRS-7具有超过70个miR-7结合位点，充当miR-7的ceRNA抑制miR-7的活性^[9]。研究报道ciRS-7特异性靶向miR-7以减少其表达，通过NF-κB轴促进非小细胞肺癌细胞的增殖、迁移和侵袭^[32]；ciRS-7的过表达消除了miR-7对食管癌的抑制作用，包括体外肿瘤细胞增殖、迁移和侵袭以及体内肿瘤生长和肺转移，同时ciRS-7作为miR-7的ceRNA重新激活其下游HOXB13介导的NF-κB/p65途径^[9]。miR-7在卵巢癌、肝癌等肿瘤中低表达，为肿瘤抑制因子^[33-35]。在胃癌中ciRS-7过表达阻断了miR-7诱导的肿瘤抑制作用，并通过拮抗miR-7介导的PTEN/PI3K/AKT信号途径导致更具侵袭性的致癌表型^[36]；PTEN/PI3K/AKT信号通路是调控肿瘤干细胞干性的重要信号通路之一^[37]，综上提示干扰ciRS-7的表达抑制宫颈癌干细胞干性可能是通过miR-7介导的PTEN/PI3K/AKT信号通路，采用Western Blot检测ciRS-7 siRNA转染的宫颈癌干细胞中PTEN/PI3K/AKT信号通路PTEN、p-PI3k和p-Akt蛋白的表达，发现干扰ciRS-7的表达增加PTEN抑癌蛋白的表达，抑制p-PI3k和p-Akt促癌蛋白的表达，表明ciRS-7可能通过调控PTEN/PI3K/AKT信号通路促进宫颈癌干细胞的干性。

综上所述，ciRS-7在宫颈癌组织和宫颈癌干细胞中表达上调，干扰ciRS-7显著抑制宫颈癌干细胞增殖、软琼脂克隆形成、转移及体内成瘤能力。该过程可能是干扰ciRS-7表达、上调miR-7的表达，通过调控PTEN/PI3K/AKT信号通路实现对宫颈癌干细胞干性的抑制作用。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

ciRS-7可调控宫颈癌干细胞的干性及机制

ciRS-7 regulates the stemness of cervical cancer stem cells: effects and mechanisms

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