稳定转染红色荧光蛋白基因的人脑胶质瘤起始细胞可自发融合宿主骨髓间充质干细胞并诱导恶性转化

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.1782

中国组织工程研究 ›› 2019, Vol. 23 ›› Issue (25): 3944-3950.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.1782

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稳定转染红色荧光蛋白基因的人脑胶质瘤起始细胞可自发融合宿主骨髓间充质干细胞并诱导恶性转化

韩辉¹，代兴亮²，程宏伟²，兰青¹

¹苏州大学附属第二医院神经外科，江苏省苏州市 215004；²安徽医科大学第一附属医院神经外科，安徽省合肥市 230022

修回日期:2019-03-19 出版日期:2019-09-08 发布日期:2019-09-08
通讯作者: 兰青，教授，主任医师，博士生导师，苏州大学附属第二医院神经外科，江苏省苏州市 215004
作者简介:韩辉，男，主要从事神经外科方面的研究。
基金资助:
国家自然科学基金项目(81702457)，项目负责人：代兴亮；苏州市科技计划项目(SYS201723)，项目负责人：代兴亮

Human glioma-initiating cells stably transfected with red fluorescent protein gene can spontaneously fuse with host-derived bone marrow mesenchymal stem cells and induce malignant transformation

Han Hui¹, Dai Xingliang², Cheng Hongwei², Lan Qing¹

¹Department of Neurosurgery, the Second Af?liated Hospital of Soochow University, Suzhou 215004, Jiangsu Province, China; ²Department of Neurosurgery, the First Affiliated Hospital of Anhui Medical University, Hefei 230022, Anhui Province, China

Revised:2019-03-19 Online:2019-09-08 Published:2019-09-08
Contact: Lan Qing, Professor, Chief physician, Doctoral supervisor, Department of Neurosurgery, the Second Af?liated Hospital of Soochow University, Suzhou 215004, Jiangsu Province, China
About author:Han Hui, Department of Neurosurgery, the Second Af?liated Hospital of Soochow University, Suzhou 215004, Jiangsu Province, China
Supported by:
the National Natural Science Foundation of China, No. 81702457 (to DXL); Suzhou Science and Technology Project, No. SYS201723 (to DXL)

摘要/Abstract

摘要：

文章快速阅读：

文题释义：
双色荧光示踪动物模型：将稳定转染红色荧光蛋白基因的人脑胶质瘤起始细胞接种于Balb/c背景的表达绿色荧光蛋白的裸小鼠皮下、腹腔和颅内，建立肿瘤细胞表达红色荧光蛋白，宿主来源肿瘤间质细胞表达绿色荧光蛋白的双色荧光示踪的小鼠肿瘤模型，借助此模型可以充分研究肿瘤细胞与宿主间质细胞之间相互作用关系，比如细胞融合。
肿瘤间质细胞：实体肿瘤中不仅包含肿瘤细胞，还包含一大群所谓的“非肿瘤细胞”，即肿瘤间质细胞，它们包括骨髓间充质细胞、成纤维细胞、胶质细胞、内皮细胞、巨噬细胞等，这群细胞在肿瘤的发生、进展过程中发挥重要作用。最近的研究发现，这些肿瘤间质细胞不仅具有促进、调节肿瘤进展的作用，其自身也具有恶性转化的潜能，但是机制不明确。文章通过双色荧光示踪技术发现肿瘤间质细胞与胶质瘤起始细胞融合并恶性转化，这为肿瘤间质细胞在肿瘤微环境中的作用提供了新的理解。

摘要
背景：异种移植瘤中宿主来源间质细胞恶性转化已有报道，但是对恶变的机制知之甚少。
目的：旨在使用双色荧光示踪的体内模型研究宿主来源肿瘤间质细胞的恶性转化，并探讨可能的机制。
方法：将稳定转染红色荧光蛋白基因的人脑胶质瘤起始细胞(glioma-initiating cells transfected with red fluorescent protein gene，GICs-RFP)接种到表达绿光荧光蛋白的裸鼠体内，建立具有2种荧光的动物模型；通过激光共聚焦观察移植瘤的荧光表达；流式细胞仪检测和分选各种荧光细胞，包括绿色荧光蛋白细胞、红色荧光蛋白细胞和表达这2种荧光的融合细胞；体外亚克隆得到具有恶性肿瘤细胞特征的同时表达绿色荧光蛋白/红色荧光蛋白两种荧光的融合细胞；体外鉴定细胞来源、表面标记物和恶性特征，裸鼠皮下移植验证融合细胞致瘤特性。实验经苏州大学动物实验伦理委员会批准，批准号为ECSU-201800090。
结果与结论：GICs-RFP在绿色荧光蛋白裸小鼠的体内致瘤率均为100%(14/14)；动物移植瘤模型中均可观察到融合细胞，分选、克隆到的融合细胞不仅共表达绿色荧光蛋白和红色荧光蛋白，而且共表达GICs-RFP标记物Nestin和骨髓间充质干细胞标记物CD44、CD105和CD29；融合细胞在体外表现出高度增殖活性，较GICs-RFP更具侵袭和迁移特征；融合细胞(1×10⁵个/只)在无胸腺裸小鼠的致瘤率为100%(4/4)。提示GICs-RFP自发融合宿主骨髓间充质干细胞并诱导恶性转化，为肿瘤异质性的细胞来源提供了新的双色荧光示踪的证据。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程
ORCID: 0000-0002-8468-4942(兰青)

关键词: 荧光蛋白示踪, 细胞融合, 恶性转化, 胶质瘤起始细胞, 荧光裸小鼠, 肿瘤微环境, 动物模型, 间充质干细胞, 肿瘤干细胞

Abstract:

BACKGROUND: Malignant transformation of host-derived stromal cells in xenograft tumors has been reported, but little is known about the mechanisms of malignant transformation.

OBJECTIVE: To investigate the malignant transformation of host-derived tumor stromal cells and to explore the possible mechanisms in an in vivo model of two-color fluorescent tracing.

METHODS: Human glioma-initiating cells stably transfected with red fluorescent protein gene (GICs-RFP) were inoculated into nude mice expressing enhanced green fluorescent protein (EGFP). An in vivo model of two-color fluorescence tracer was established. The fluorescent expression of transplanted tumors was observed by confocal laser scanning. Flow cytometry was used to detect and classify various fluorescent cells, including EGFP cells, RFP cells and EGFP/RFP fusion cells. The fusion cells co-expressed EGFP/RFP and had malignant proliferation characteristics because of in vitro subcloning. Origin, surface markers and malignant features of the cells were identified in vitro. The tumorigenicity of fusion cells was verified by subcutaneous transplantation in nude mice. The study was approved by the Animal Ethics Committee of Soochow University (approval No. ECSU-201800090).

RESULTS AND CONCLUSION: The tumorigenic rates of GICs-RFP in EGFP nude mice were 100% (14/14). Fusion cells were observed in the transplanted tumors of all the animal models. The fusion cells not only co-expressed EGFP and RFP, but also co-expressed GICs-RFP marker Nestin and bone marrow mesenchymal stem cell markers CD44, CD105 and CD29. Fusion cells showed high proliferative activity and more invasive and migratory characteristics in vitro as compared with GICs-RFP. The tumorigenicity of fusion cells (1×10⁵ cells per mouse) in thymus-free nude mice was 100% (4/4). These results indicate that GICs-RFP spontaneously fuses with host-derived bone marrow mesenchymal stem cells and induces malignant transformation, which provides new evidence for two-color fluorescence tracing of heterogeneous tumor cell sources.

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

Key words: fluorescent protein tracing, cell fusion, malignant transformation, glioma-initiating cells, fluorescent nude mice, tumor microenvironment, animal model, mesenchymal stem cells, tumor stem cells

中图分类号:

R441
R364

韩辉，代兴亮，程宏伟，兰青. 稳定转染红色荧光蛋白基因的人脑胶质瘤起始细胞可自发融合宿主骨髓间充质干细胞并诱导恶性转化[J]. 中国组织工程研究, 2019, 23(25): 3944-3950.

Han Hui, Dai Xingliang, Cheng Hongwei, Lan Qing. Human glioma-initiating cells stably transfected with red fluorescent protein gene can spontaneously fuse with host-derived bone marrow mesenchymal stem cells and induce malignant transformation[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2019, 23(25): 3944-3950.

图/表（结果） 7

2.1 双色荧光示踪动物模型体内细胞的融合 GICs-RFP是作者所在实验室从人脑胶质母细胞瘤组织标本中原代培养并克隆到的一株具高侵袭的胶质瘤起始细胞^[21]，可稳定转染红色荧光蛋白基因载体后，经嘌呤霉素筛选和流式分选得到几乎100%表达红色荧光蛋白的GICs-RFP。实验小鼠为本实验室自建的全身表达绿色荧光蛋白的裸小鼠。多模式小动物活体成像仪下可以观察到GICs-RFP细胞移植到荧光裸小鼠颅内、皮下和腹腔后的致瘤效果，见图1，在激光扫描共聚焦显微镜下，可见大量绿色的宿主来源绿色荧光蛋白细胞浸润到表达红色荧光蛋白的实体肿瘤中，参与了肿瘤细胞间质的组成，并可见少数共表达绿色荧光蛋白和红色荧光蛋白的融合细胞，见图1。

2.2 融合细胞的分离和单克隆 无菌条件下取颅内移植瘤肿瘤组织进行原代培养，2周左右后，在部分原代细胞集落中可见共表达绿色荧光蛋白和红色荧光蛋白的细胞克隆，部分细胞甚至为双细胞核细胞，流式细胞仪检测显示共表达细胞约占原代细胞群1.08%，见图2A。在激光扫描共聚焦显微镜下，这些细胞为既高表达红色荧光蛋白，又高表达绿色荧光蛋白的有核活细胞，称其为融合细胞(fusion cells，FCs)，见图2B。利用自制毛细吸管显微镜下挑取单细胞做克隆，克隆后的细胞在显微镜下每天观察，确认是单个细胞分裂来源的克隆，见图3A，B。从颅内、腹腔和皮下移植瘤中克隆得到3个共表达绿色荧光蛋白/红色荧光蛋白的克隆细胞株，分别命名为FC1，FC2和FC3，3株细胞形态各异，颅内来源的FC1为多角形，腹腔来源的FC2为少突触的圆形，皮下来源的FC3为纤维型，见图3C。

2.3 融合细胞的生物学特征 通过人鼠特异性引物行反转录聚合酶链反应检测，GICs-RFP为人源对照，绿色荧光蛋白裸小鼠骨髓冲洗细胞作为鼠源对照，3株融合细胞均共转录人鼠β-actin基因，证实融合细胞包含人源和鼠源基因组成分并转录，见图4A；结合荧光蛋白示踪的方法，来源于人GICs-RFP的红色荧光蛋白基因和来源于鼠的绿色荧光蛋白基因共同表达于融合细胞，证实了融合细胞不仅包含人源和鼠源基因成分，并且有明确的转录和表达。由此从基因组和蛋白水平证实FC1，FC2和FC3为人/鼠自发融合细胞。

2.4 融合细胞的细胞增殖能力 这三株细胞在体外均展示出无限增殖的永生化特征，CCK-8增殖曲线示3株融合细胞的增殖特征与GICs-RFP没有明显差异，见图4B。

2.5 融合细胞的细胞侵袭和迁移能力 Transwell侵袭实验证实3株细胞均表现出显著的侵袭特性，其中FC1和FC3侵袭能力较GICs-RFP更强(P < 0.001，P < 0.05)，见图5A，B。划痕实验评估细胞运动性，结果提示FC1，FC2和FC3三株细胞运动型均较GICs-RFP更强，差异有显著性意义(P < 0.001，P < 0.05，P < 0.05)，见图5C，D。

2.6 融合细胞表面标志物的鉴定 免疫细胞化学结果提示3株细胞均共表达胶质细胞标记物Nestin和CD105，见图6。流式细胞检测实验显示3株细胞高表达骨髓间充质干细胞标记物CD44、CD105和CD29，融合细胞FC1、FC2、FC3的阳性率分别为：CD44为92.1%、85.5%和76.1%，CD105为92.8%、86.6%和76.4%，CD29为91.9%、96.2%和78.9%；但不表达CD45、CD31、CD34和CD11b，融合细胞FC1、FC2、FC3的阳性率分别为：CD45为3.63%、4.99%和3.81%，CD31为1.55%、1.76%和2.03%，CD34为2.22、1.50%和4.22%，CD11b为3.00%、3.27%和2.99%，见图7，提示融合细胞来源于宿主骨髓间充质间质细胞。

2.7 融合细胞小鼠体内致瘤能力 融合细胞皮下移植，3株融合细胞滞留率均为100%(4/4)，表现出极强的增殖能力。苏木精-伊红染色可见融合细胞(FC1)呈现出较高的恶性特征，见图8。

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引言

胶质瘤是最常见的原发性脑肿瘤^[1-2]。胶质瘤患者预后极差，确诊患者即使行手术且术后进行化疗，其中位生存期也只有约15个月^[3]。通过手术、放疗、化疗、单抗治疗等综合治疗，胶质瘤患者无症状生存期虽有所延长，但是总的中位生存期仍没有明显延长^[4]。

研究发现，胶质瘤微环境中除了胶质瘤细胞之外，还存在多种间质细胞和肿瘤基质成分，这共同被称为肿瘤间质^[5]，这种说法来源于Paget关于“种子和土壤”的观点^[6]。这些肿瘤间质细胞中又包括本身原有细胞和被招募来的其他部位的细胞^[8]；但其中被募集来的细胞中很大一部分是来源于骨髓间充质干细胞，而这些细胞在肿瘤形成中的作用目前仍然没有达成共识^[7]。

为了阐明肿瘤间质的角色，Yang等^[9]开创了一种新的方法，即通过将表达绿色荧光蛋白的C57小鼠的荧光基因嵌入到裸鼠体内，建立了表达绿色荧光蛋白的裸鼠，用其来研究肿瘤微环境，为肿瘤微环境的研究做出了贡献。Suetsugu等^[10]的研究表明肿瘤间质细胞主要是肿瘤相关巨噬细胞和癌症相关成纤维细胞以及血管，可以陪同癌细胞的增殖一起传代下去。作者最近的研究表明，这些伴随肿瘤生长的肿瘤相关巨噬细胞和癌相关成纤维细胞已经从“附庸”变成了“同伙”，并具有恶性特征^[11-12]。

在异种移植瘤实验的研究中，宿主间质细胞的恶性转化早已引起人们广泛关注，至今也还在吸引着人们的眼球，其中包括患者肿瘤组织移植和肿瘤细胞系的移植均被发现有此现象^[13-19]。目前，很多团队用各种方法证明这一现象，包括细胞形态学、染色体分析、免疫组织化学分析等，然而这些研究方法也都显示出许多局限性。作者既往研究采用的双色荧光示踪模型在研究肿瘤微生态环境中肿瘤-宿主相互作用方面具有优势。基于自建的双色荧光蛋白示踪的小鼠模型，作者前期研究发现了肿瘤间质细胞的恶性转化，还使用转染并稳定表达红色荧光蛋白的胶质瘤起始细胞(glioma-initiating cells transfected with red fluorescent protein gene，GICs-RFP)，接种到全身表达绿色荧光蛋白的小鼠的皮下、腹腔和颅内，建立双色荧光示踪肿瘤模型模型，进而从移植瘤中分选、克隆得到了具有恶性增殖特性的但却仅仅表达绿色荧光蛋白的宿主来源间质细胞^[11-12^，^20]，但是对于间质细胞恶性转化的机制仍不明确。

实验基于自建的双色荧光蛋白基因示踪的胶质瘤起始细胞异种移植小鼠模型，探索细胞融合在间质细胞恶性转化中可能的细胞机制。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

材料方法

1.1 设计 细胞生物学实验和动物实验。

1.2 时间及地点 于2017年11月至2018年10月在苏州大学附属第二医院完成。

1.3 材料

1.3.1 胶质瘤起始细胞GICs-RFP 高侵袭性胶质瘤起始细胞GICs-RFP由作者所在实验室自建，并可稳定转染表达红色荧光蛋白基因^[21]。参考文献[22]，转入携带有红色荧光蛋白基因的质粒载体培养得到GICs-RFP球。取荧光裸小鼠脱臼处死，体积分数75%乙醇浸泡10 min，在超净工作台内把小鼠腹部朝上放在预先消毒好的玻璃皿中。眼科剪打开双后肢，钝性分离双股骨，离断干骺端，用1 mL注射器吸取培养基冲洗骨髓腔，反复多次冲洗，冲洗液细胞计数后直接培养，无需裂解红细胞也无需离心，细胞为小鼠骨髓冲洗细胞。

1.3.2 绿色荧光蛋白裸小鼠 全身所有细胞(除毛发和无核红细胞)表达绿色荧光蛋白的6-8周龄C57BL/6J雌性小鼠和BALB/c雄性裸小鼠，各10只，均购于南京大学模式动物研究所，动物许可证：SYXK(苏)2017-0043。按照之前作者所在团队报道的连续回交的近交繁育方法^[22]，进行传代繁殖超过10代。

另外，4只6-8周龄BALB/c裸鼠也购于南京大学模式动物研究所，用于致瘤实验。

实验经苏州大学动物实验伦理委员会批准，批准号为ECSU-201800090。

1.4 方法

1.4.1 建立双色荧光示踪动物模型 GICs-RFP经干细胞分散酶消化后制成单细胞悬液，接种到绿色荧光蛋白裸小鼠右前肢腋下(1×10⁵，150 μL)、腹腔(1×10⁵，150 μL)和借助立体定向仪接种到颅内尾状核(1×10⁵，10 μL)。观察肿瘤长到1 cm³左右或者肿瘤颅内接种的小鼠消瘦后(25-30 d)，在小动物活体成像仪(Kodak，美国)下，分别在465 nm和535 nm的激发光下观察肿瘤。取下移植瘤做连续冰冻切片，经DAPI染液标记细胞核后在激光扫描共焦显微镜(Leica，Germany)下观察。

1.4.2 移植瘤组织培养和间质细胞的单克隆培养

1.4.3 三株细胞体外生长特性

肿瘤细胞生长曲线：取对数生长期的细胞计数，96孔板中每孔种1 000个细胞，做6个复孔。细胞贴壁后，每孔加入10 μL CCK-8(日本Dojindo)，在培养箱内孵育2 h。用酶标仪(Tecan)测定在450nm处的吸光度值，绘制生长曲线。

划痕实验：处于对数期生长的细胞消化后种到六孔板中；24 h后细胞贴壁，用200 μL移液尖尖端在6孔板底端制造划痕，换含1%血清(Gibco，美国)培养基继续培养，分别在0，8，16和24 h时观察并记录相同位置的划痕宽度变化，计算划痕愈合率。愈合率=(0 h划痕宽度-不用时间点划痕宽度)/0 h划痕宽度。

Transwell实验：用Transwell小室(Corning，NY，USA)进行侵袭实验。首先，上室加入120 μL含无血清培养基(Hyclone公司)的细胞悬液(3×10⁴细胞)；下室加入800 μL含体积分数10%胎牛血清的DMEM培养基(Hyclone公司)，37 ℃温箱培养22 h；最后，取出小室，用棉签擦去小室上表面的细胞和基质胶，用40 g/L多聚甲醛固定30 min，用0.1%结晶紫染色。显微镜下随机20倍视野计数穿膜细胞数。

1.4.4 反转录聚合酶链反应 对数生长期细胞加Trizol(美国赛默飞世尔公司)裂解提取总RNA，测吸光度值，计算浓度。按照反转录试剂盒(Fermentas公司)说明书进行反转录反转录聚合酶链反应的反应体系20 μL：2×Taq Mix 10 μL，RNase-free H₂O 7 μL，Primer F 1 μL，Primer R 1 μL，cDNA 1 μL。反应条件为：95 ℃，30 s；56 ℃，30 s；72 ℃，30 s；30个循环。每个反应3个复孔。

1.4.5 免疫细胞化学染色 取对数增殖期细胞，制成细胞悬液，铺于预先包被多聚赖氨酸的小圆玻片上，培养12 h用40 g/L多聚甲醛固定。参照之前报道的方法行免疫细胞化学染色，一抗(Abcam公司，Nestin 1∶300；CD105 1∶200)，加二抗及DAB显色(碧云天，上海)。

1.4.6 流式细胞仪检测 分别取适当数量的3株细胞和阳性对照的骨髓间充质干细胞，抗体孵育后经流式细胞仪(BD FACSArial)检测，结果以Image J软件分析。流式检测相关抗体为Anti-CD105抗体(ab156756)；Anti-CD44抗体(ab40983)；Anti-CD29抗体(ab95623)；Anti-CD45抗体(ab23910)；Anti-CD34抗体(ab187282)；Anti-CD11b抗体(ab133357)；Anti-CD31抗体(ab9498)；Goat Anti-Rabbit IgG H&L (Alexa Fluor® 647)。

1.4.7 致瘤实验 取1×10⁵个融合细胞，分别接种4只6-8周龄BALB/c裸鼠前肢背部的皮下。观察3组小鼠的致瘤率，并在接种肿瘤细胞35 d后统一处死，对肿瘤组织行苏木精-伊红染色。

1.5 主要观察指标 胶质瘤起始细胞的融合情况。

1.6 统计学分析 细胞增殖实验和划痕愈合率数据统计及作图由Graphpad prism 7.0软件处理，数据用x(_)±s表示，行t 检验比较两组均数差异，检验水准α=0.05。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

讨论

肿瘤微环境是由多种不同类型的细胞和细胞外基质组成的一个复杂的群体，所有这些组成成分共同构成了整个肿瘤^[23]；在这个群体中，除了肿瘤细胞外还包括了大量的“非肿瘤”物质，即间质细胞^[7^，^24-25]，大多数的人认为这些间质细胞成分在肿瘤的发生发展中起到促进肿瘤进展的作用，比如癌相关成纤维细胞、肿瘤相关巨噬细胞、内皮细胞和骨髓间充质干细胞^[26]。当患者肿瘤组织或肿瘤细胞系移植到裸小鼠体内致瘤时，形成的肿瘤间质细胞组分就将会被来源于宿主的细胞所浸润甚至替代。浸润的细胞由两部分组成，一部分是肿瘤临近位置的细胞，另一部分就是来自于的外周血或骨髓的细胞^[27-31]。有研究报道指出，对肿瘤间质重构中肿瘤内部的间质细胞与肿瘤外部的间质组织进行比较，结果发现了基因表达的差异，但是没有验证其致瘤性的差异。既往研究已证实宿主来源间质细胞会引起纤维肉瘤样肿瘤改变^[32]，虽然受到多方质疑，但是有许多研究团队在新鲜肿瘤样本和已建系的细胞株的实验研究中都得到同样的结果，证明了这一观点的真实性。从双色荧光示踪模型中的观察中发现，在异种移植瘤中宿主来源的间质细胞的比例达到一半以上，如图1冰冻切片。而且在对移植瘤组织原代培养过程中发现很容易区分肿瘤和宿主细胞，这为分选克隆得到共表达绿色荧光蛋白/红色荧光蛋白的细胞提供了新思路。

此次实验建立的双色荧光示踪的肿瘤模型是在转基因小鼠技术基础上完成的。其中包括免疫力正常，表达绿色荧光蛋白绿色荧光的C57BL/6J小鼠和具有免疫功能缺陷的BALB/c小鼠。就整合了这2种鼠的优点，将荧光小鼠与免疫缺陷小鼠杂交，经过复杂的繁殖过程，筛选得到了具有免疫缺陷的荧光小鼠。GICs-RFP细胞是作者所在课题组建立的带有红色荧光蛋白的胶质瘤祖细胞细胞系，其用于双色荧光示踪研究。

GICs-RFP细胞移植到绿色荧光蛋白裸小鼠皮下，腹腔和颅内的移植瘤中克隆到了生物学特征类似的恶性转化了的融合细胞，其具有类似GICs-RFP生长特性和倍增时间，而且展示出了比GICs-RFP更强的侵袭特性和迁移特性，在裸鼠颅内移植具有100%致瘤性，且比GICs-RFP平均致死时间还短，病理可见融合细胞更具浸润生长和转移特性。免疫细胞化学的结果显示共表达GICs-RFP的标记Nestin和MSC的标记物CD105，流式细胞检测实验显示三株细胞表达骨髓间充质干细胞标记物CD44、CD105和CD29，但不表达CD45、CD31、CD34和CD11b，由此可推测融合细胞来源于GICs-RFP和浸润而来的宿主骨髓间充质干细胞。

借助双色荧光示踪的实验方法，体外用GICs-RFP与裸小鼠骨髓冲洗细胞进行共培养，3 d后发现数量极少的共表达绿色荧光蛋白和红色荧光蛋白融合细胞的存在，推测原因可能是是细胞发生融合后增殖水平不稳定，GICs-RFP增值速度相对于融合细胞更快或者融合细胞不增值从而被挤占，还有可能就是细胞融合后基因组重组发生错误，从而导致细胞无法分裂进而死亡。在显微镜下观察共表达细胞数量最多时，实验以流式细胞仪检测，融合细胞占总的细胞群的比例不会超过3%，平均水平在1%左右。但是这极少比例的融合细胞对肿瘤的发生发展的作用是不是也是极少的呢？至少作者认同这一观点。在颅内、腹腔和皮下移植瘤中克隆得到了3株共表达细胞，从它们的体外生物学恶性特征和体内致瘤特征上，认为融合细胞展示出了比亲本GICs-RFP更加恶性的特征。Tome等^[33]的研究指出通过荧光示踪的方法证明癌细胞之间基因水平会发生转移，即Ki-ras基因从高具有转移能力的肿瘤细胞系转移到无转移能力的细胞系从而显著提高了后者的转移能力。

Goldenberg等^[18]报道了肿瘤细胞与宿主来源的间质细胞之间会出现基因的水平转移，而且还证明了这两种细胞发生融合后导致间质细胞的恶性转化。作者也观察到这一现象，即单细胞克隆的融合细胞在体外连续培养后会逐渐丢失来源于GICs-RFP的基因成分，由共表达红色荧光蛋白和绿色荧光蛋白的细胞变成仅表达绿色荧光蛋白的细胞，连续传代约40代后，绿色荧光蛋白的表达也逐渐丢失，这似乎与Goldenberg的报道不谋而合，也使观察到的现象得到合理的解释，但是仍缺少进一步的证据。

在活细胞工作站下，体外GICs-RFP与裸小鼠骨髓冲洗细胞共培养的动态观察发现了一些有趣的过程，为融合细胞的发生机制和过程提供的可能的解释。①直接融合；②纳米突触隧道传递；③细胞内化；④囊泡传递。entosis实际上是细胞的一种凋亡的形式^[34-36]，所观察到的细胞间的囊泡传递过程中，已有大量的报道证明了囊泡里的物质包括蛋白、mRNA，以及各种因子和DNA物质等^[37-39]，这种囊泡融合的信息传递形式可能是肿瘤及各种细胞间的“交通工具”，已有许多研究报道了此类细胞间的沟通形式^[40-43]。由此推测通过细胞融合、轴突接触传递、细胞内化或囊泡运输等形式，肿瘤细胞与肿瘤间质细胞互相交换遗传物质，包括恶性基因，而且这些基因的水平传递可能不是整个基因组水平的，从而导致融合细胞展示出了更加恶性的体内外特征。

因此，用荧光蛋白基因示踪技术不仅证明了GICs-RFP具有与宿主间质细胞自发融合的能力，而且促使融合细胞更加具有恶性特征，为肿瘤异质性的细胞来源提供了新的双色荧光示踪的证据。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

稳定转染红色荧光蛋白基因的人脑胶质瘤起始细胞可自发融合宿主骨髓间充质干细胞并诱导恶性转化

Human glioma-initiating cells stably transfected with red fluorescent protein gene can spontaneously fuse with host-derived bone marrow mesenchymal stem cells and induce malignant transformation

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