角膜炎模型大鼠白细胞介素10及环氧酶2的表达

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2015.49.025

摘要/Abstract

摘要：

背景：研究白细胞介素10、环氧酶2与模型大鼠角膜炎发生发展的关系，对角膜炎的治疗有重大意义。
目的：检测白细胞介素10及环氧酶2在大鼠模型角膜炎中的表达情况，分析白细胞介素10、环氧酶2与模型大鼠角膜炎发生发展的关系。
方法：随机选取26只健康大鼠，不限雌雄，大鼠左眼选为实验组，采用角膜表面镜片术法建立角膜炎感染模型；右眼作为正常对照组。建模后第1，3，7及14天摘取角膜组织，观察大鼠左右眼角膜组织病理学变化，并采用免疫组织化学及反转录聚合酶链式反应(RT-PCR)法，检测白细胞介素10及环氧酶2在不同程度角膜炎的角膜组织中的表达情况。
结果与结论：①组织病理学观察显示角膜炎病灶有严重组织坏死及中性粒细胞浸润，PAS染色结果显示菌丝主要存在于角膜基质层。②白细胞介素10在对照组大鼠角膜中基本不表达，感染角膜炎后，白细胞介素10的表达先上升后下降，各时间点有显著性差异(P < 0.01)。③环氧酶2在对照组大鼠角膜中基本不表达，感染角膜炎后，环氧酶2的表达逐渐升高，第14天降低，各时间点有显著性差异(P < 0.01)。PAS染色及病变组织培养实验证明建立大鼠模型角膜炎成功。结果显示白细胞介素10在角膜炎病变后期有表达，推测其可能参与角膜炎后期的组织损伤修复；环氧酶2的表达位于角膜炎组织，是角膜炎病变的敏感炎症因子。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：肾移植；肝移植；移植；心脏移植；组织移植；皮肤移植；皮瓣移植；血管移植；器官移植；组织工程

关键词: 实验动物模型, 基因病毒载体及相关因子动物模型, 角膜炎, 白细胞介素10, 环氧酶2

Abstract:

BACKGROUND: Investigating the relationship between interleukin-10, cyclooxygenase-2 expression levels and the occurrence and development of keratitis is of great significance for the treatment of keratitis.
OBJECTIVE: To detect the expression of interleukin-10 and cyclooxygenase 2 in keratitis rat models and analyze the relationship between interleukin-10, cyclooxygenase-2 expression and the occurrence and development of keratitis in rats.
METHODS: Twenty-six healthy rats of either gender were randomly selected to establish keratitis rat models. The left eyes of rats were chosen as experimental group to establish keratitis models using epikeratophakia. The right eyes of rats were set as control group. At the 1th, 3rd, 7th and 14th days after modeling, the pathological changes of rat corneal tissue were observed in both eyes. The expression of interleukin-10 and cyclooxygenase 2 in the corneal tissue with different degrees of keratitis was determined using immunohistochemistry and reverse transcription-polymerase chain reaction (RT-PCR).
RESULTS AND CONCLUSION: Histopathological observation showed that there were severe tissue necrosis and neutrophil infiltration in keratitis foci. PAS staining showed that the mycelium was mainly present in the corneal stroma. In the control group, the expression of interleukin-10 was hardly detected in rat cornea. After keratitis infection, the expression of interleukin 10 increased at first and then decreased, and there was significant difference between different time points (P < 0.01). In the control group, the expression of cyclooxygenase-2 was hardly detected in rat cornea. After keratitis infection, the expression of cyclooxygenase 2 was increased gradually and then decreased at the 14th day. There was significant difference between different time points (P <
0.01). PAS staining and pathologic tissue culture experiment suggest that rat models of keratitis were successfully established. These results show that the expression of interleukin-10 appeared in the late period of keratitis lesions, which indicate that interleukin-10 may be involved in the tissue damage repair in the late period of keratitis. The expression of cyclooxygenase-2 locates in the keratitis tissue and cyclooxygenase-2 is a sensitive inflammatory cytokine of keratitis.

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中图分类号:

R318

陆霞，潘旭斌，谢玉涛，季秋娣. 角膜炎模型大鼠白细胞介素10及环氧酶2的表达[J]. 中国组织工程研究, 2015, 19(49): 8015-8020.

Lu Xia, Pan Xu-bin, Xie Yu-tao, Ji Qiu-di. Expression of interleukin-10 and cyclooxygenase 2 in keratitis rat models[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2015, 19(49): 8015-8020.

图/表（结果） 8

2.1 造模成功动物数量及过程实验选取大鼠26只，实验过程无脱失，全部进入结果分析。
2.2 模型创新性/材料、方法的改进以往大部分研究在造模时一般都是将大鼠的两只眼睛都进行感染，在与其他大鼠作为对照，但是本次研究为同体对照，将同一只大鼠的一只眼睛感染造模，另一只眼睛作为对照，增加了数据的可信度。
2.3 模型稳定性本次研究之前，作者翻阅了众多相关的研究资料，资料中显示角膜炎大鼠模型具有较高的稳定性，且使用其进行角膜炎的相关实验均取得了较好的成果，因此本次研究也使用了这种模型。
2.4 大鼠模型角膜炎感染情况建模后，大鼠状况良好，接种感染24 h后，拆除缝合线，去除角膜接触镜，露出角膜病灶组织。术后第1天，大鼠角膜出现水肿，表面粗糙不光滑；第3天，大鼠角膜水肿，表明粗糙，周围组织充血，溃疡出现；第7天，大鼠角膜水肿加重，溃疡程度加重，分泌物较多，表面凹凸不平；第14天，大鼠角膜溃疡大部分消退，中央区浑浊(图1)。

2.5 病变组织培养及染色观察结果建模1 d后，取角膜组织进行涂片镜检，并培养。结果显示，未能分离培养出细菌，分离培养出真菌，菌落呈棉花状白色，显微镜下观察菌丝呈短棒状或者链状(图2)。

2.6 组织病理学观察结果
2.6.1 PAS染色观察显微镜下观察病变角膜组织，角膜炎溃疡灶存在紫红染色，主要存在于角膜基质层(图3)。

2.6.2 苏木精-伊红染色观察建模后1d，大鼠角膜出现水肿，基质内有中性粒细胞浸润；第3天，中性粒细胞浸润增多；第7天，炎症达到高峰，溃疡坏死区增大，中性粒细胞明显浸润；第14天，上皮修复，基质水肿消退，中性粒细胞浸润减少(图4)。

2.6.3 免疫组织化学观察结果显示，白细胞介素10和环氧酶2在对照组基本不表达，白细胞介素10主要位于基质内，感染后第1天开始表达(图5)，到第3天表达量逐渐显著上升，第7天表达量下降，第14天仍有表达，各时间点差异有显著性意义(P < 0.01)，见表5，6；环氧酶2主要位于基质中，感染后第1天开始表达，第3天到第7天表达量逐渐显著上升，第7天达到最大值，第14天表达量下降，各时间点有显著性差异(P < 0.01)，见表7，8，见图5。

2.7 RT-PCR结果提取角膜组织总RNA(图6)，28S比18S为2∶1，说明RNA较完整，检测A260/A280的比值为1.9，浓度为1 g/L。

2.7.1 白细胞介素10在角膜组织中的表达选用β-actin基因为内参基因，β-actin基因PCR产物大小为317 bp，以验证PCR系统无问题。
如图7结果显示，白细胞介素10在对照组中不表达，感染后1天开始表达，到第3天表达量逐渐显著上升至最大，第7天表达量下降，第14天仍有表达，各时间点差异有显著性意义(P < 0.01)。

2.7.2 环氧酶2在角膜组织中的表达如图8结果显示，环氧酶2在对照组中不表达，感染后1天开始表达，第3天到第7天表达量逐渐显著上升，第7天达到最大值，第14天表达量下降，各时间点差异有显著性意义(P < 0.01)。

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引言

材料方法

1.1 造模动物及材料实验于2014年3月至2015年6月在江苏省无锡市第四人民医院实验室完成。
实验动物：选取26只健康清洁级大鼠，雌雄不限，体质量240-260 g，通过裂隙灯检查大鼠双眼角膜正常，来自解放军第三军医大学第三附属医院动物室。维持12 h光照/黑暗昼夜节律(光照20：00-8：00，黑暗8：00-20：00)，室温(22±2) ℃，给予标准自由进食，按照国家健康协会制定的实验动物指南处理所有动物。
1.2 造模方法
1.2.1 建立角膜炎大鼠模型制备角膜接触镜，置于体积分数75%的乙醇中浸泡消毒备用。选取大鼠左眼为实验组，建立角膜炎感染模型。在眼科显微镜下，用无菌原道刮除左眼角膜中央的上皮组织，随后将角膜表面刮痕，在角膜表面涂抹角膜炎感染菌落，最后覆盖角膜接触镜，缝合眼睑。右眼为正常对照组。
1.2.2 造模成功的检测标准造模完成之后拆线发现感染情况较好，组织刮取物行菌落培养证实大鼠真菌性角膜炎，说明造模成功。眼睑拆线后，刮去少许角膜组织，涂片观察，并培养，每天裂隙灯观察角膜病变情况并拍照。

1.2.3 组织病理学检测建模后第1，3，7及14天分别随机选取5只大鼠，无菌条件下摘取其角膜组织，将角膜组织分为2份，一份制备病理学免疫组织化学观察，另一份置于无菌的EP管内，-80 ℃冰箱保存，RT-PCR备用。
角膜组织于固定液固定24 h后，进行乙醇梯度脱水，二甲苯透明，石蜡包埋，切片，厚度2 μm，用于染色及免疫组织化学观察，并烘干。
1.2.4 RT-PCR 目的基因序列片段来自Genebank，引物由上海英潍捷基贸易有限公司合成，序列见表1。

称取50 mg角膜组织置于灭菌的EP管中，加入500 μL TRIZOL，静置5 min，充分裂解；置于冰上将角膜组织研磨至浆状，离心，提取RNA，-80 ℃冰箱保存。使用分光光度计检测RNA在260 nm、280 nm的吸光度，计算RNA的纯度(A260/A280)及浓度(g/L)=A260×40×稀释倍数/ 1 000。
反转录反应体系，反应条件65 ℃水浴、5 min，后置于4 ℃。见表2，3。

应体系如下，反转录条件：42 ℃，30 min；95 ℃，5 min；4 ℃。
PCR反应体系，将表4中的PCR反应液加入到表3反转录结束的PCR反应中，混匀。

PCR反应条件：94 ℃，3 min；95 ℃，30 s；55 ℃(白细胞介素10引物)，55 ℃(环氧酶2引物)，30 s；72 ℃， 40 s；共38个循环(白细胞介素10引物)，35个循环(环氧酶2引物)72 ℃，10 min。
DNA电泳及分析，利用凝胶成像系统拍照，Quantity One定量分析软件分析，检测目的基因的相对吸光度，得到白细胞介素10及环氧酶2的相对表达量。
1.3 主要观察指标 ①大鼠模型角膜炎感染情况。②病变组织培养及染色观察结果。③组织病理学观察结果。④RT-PCR结果。
1.4 统计学分析本次研究的统计分析软件是SPSS 22.0，结果用x(_)±s表示，采用t 值检验组内和组间的差异，用χ2检验计数资料间的差异，当P < 0.05 时认为有差异显著性意义。

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讨论

3.1 造模方法创新及稳定性以往大部分研究在造模时一般都是将大鼠的两只眼睛都进行感染，在与其他大鼠作为对照，但是本次研究将一只大鼠的两只眼睛作为对照，一只眼睛感染造模，另一只眼睛作为对照，增加了数据的可信度。在本次研究之前，作者翻阅了众多相关的研究资料，资料中显示角膜炎大鼠模型具有较高的稳定性，且使用其进行角膜炎的相关实验均取得了较好的成果，因此本次研究也使用了这种模型。
3.2 白细胞介素10及环氧酶2在角膜炎角膜组织中的表达天然免疫系统在角膜炎的发病过程中有着重要作用，主要包括淋巴细胞、粒细胞等[^12-14]。这些免疫细胞受细胞因子、趋化因子等调控，在组织中产生化脓作用[15]，免疫系统的反应能力决定机体的抗感染能力。目前，缺乏有效的药物及治疗手段，严重影响患者的视功能。本研究通过大鼠模型，了解角膜炎的发病情况，探讨其发病机制。
本研究中，选取白细胞介素10作为检测基因，因为白细胞介素10是免疫系统中的复调控因子，能够抑制单核细胞的吞噬及中性粒细胞的呼吸氧爆发作用。结果显示，白细胞介素10参与整个病变过程，白细胞介素10在对照组中不表达，感染后1d开始表达，到第3天表达量逐渐显著上升至最大，同时病理学表明角膜组织严重破坏，角膜炎后期表达量下降，炎症消退，推测白细胞介素10可能抑制保护因子的分泌，减弱炎症因子的吞噬，参与角膜炎后期的组织损伤修复。环氧酶2是一类炎症因子，催化前列腺素的合成。环氧酶2在生理或静息状态的组织中几乎不表达。环氧酶2参与眼组织的发育、眼部炎症及肿瘤的发生。本实验结果显示，环氧酶2在对照组中不表达，感染后1天开始表达，第3天到第7天表达量逐渐显著上升，第7天达到最大值，同时病变达到最高，角膜组织溃疡严重，中性粒细胞明显浸润，第14天表达量下降，炎症消退。认为环氧酶2参与角膜炎的发生和发展过程，与炎症病变有相关性，是角膜炎病变的敏感炎症因子。
综上所述，采用多种分子生物学技术，验证白细胞介素10及环氧酶2在不同程度角膜炎的角膜组织中的表达，进一步说明白细胞介素10及环氧酶2可能参与角膜炎的发生和发展过程，推测白细胞介素10可能参与角膜炎后期的组织损伤修复，环氧酶2是角膜炎病变的敏感炎症因子。

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