高龄小鼠沉默信息调节因子1基因敲除后膝骨关节炎模型的建立

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2015.49.005

中国组织工程研究 ›› 2015, Vol. 19 ›› Issue (49): 7895-7901.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.2015.49.005

• 骨及关节损伤动物模型 Animal models of bone and joint injuries • 上一篇下一篇

高龄小鼠沉默信息调节因子1基因敲除后膝骨关节炎模型的建立

于斐，雷鸣，曾晖，李明华，肖德明

北京大学深圳医院，广东省深圳市 518036

收稿日期:2015-09-05 出版日期:2015-11-30 发布日期:2015-11-30
通讯作者: 肖德明，博士，主任医师，北京大学深圳医院，广东省深圳市 518036
作者简介:于斐，男，1989年生，山东省高青县人，汉族，北京大学医学部在读硕士，主要从事骨关节炎、骨科生物材料方面的研究。
基金资助:
国家自然科学基金面上项目(81272032)；深圳市卫人委资助项目(201302064)；深圳市科创委资助项目(JCY20130402114702130)

Construction of elderly SIRT1 gene knockout mouse models of knee osteoarthritis

Yu Fei, Lei Ming, Zeng Hui, Li Ming-hua, Xiao De-ming

Peking University Shenzhen Hospital, Shenzhen 518036, Guangdong Province, China

Received:2015-09-05 Online:2015-11-30 Published:2015-11-30
Contact: Xiao De-ming, M.D., Chief physician, Peking University Shenzhen Hospital, Shenzhen 518036, Guangdong Province, China
About author:Yu Fei, Studying for master’s degree, Peking University Shenzhen Hospital, Shenzhen 518036, Guangdong Province, China
Supported by:
the National Natural Science Foundation of China, No. 81272032; a grant from Health and Family Planning Committee of Shenzhen of China, No. 201302064; a grant from Science and Technology Innovation Committee of Shenzhen of China, No. JCY20130402114702130

摘要/Abstract

摘要：

背景：国内外学者对骨关节炎的发病机制和治疗方法进行了大量的研究，近期发现沉默信息调节因子1(SIRT1)基因在骨关节炎的发病中有着重要的意义，但对其研究尚少，用于该基因研究的骨关节炎模型也鲜有报道。
目的：建立特异性的高龄SIRT1基因敲除小鼠膝骨关节炎模型，以期为骨关节炎的研究提供便利条件。
方法：采用随机对照分组的方法，将小鼠分为4组，即SIRT1+/+小鼠假手术组(A组)、SIRT1+/+小鼠骨关节炎模型组(B组)、SIRT1-/-小鼠假手术组(C组)及SIRT1-/-小鼠骨关节炎模型组(D组)，每组6只。行单侧膝关节前交叉韧带横断加内侧半月板切除建立骨关节炎模型，荧光定量聚合酶链反应检测SIRT1基因敲除情况；苏木精-伊红染色、番红O-固绿双染色观察膝关节软骨形态结构改变，Mankin评分评价膝骨关节炎程度。
结果与结论：SIRT1-/-小鼠SIRT1 mRNA表达量明显低于SIRT1+/+小鼠(P < 0.01)，说明SIRT1基因敲除成功。染色结果显示，B、D两组膝关节软骨破坏明显，Mankin评分明显高于A、C两组(P < 0.01)，并且SIRT1基因敲除后Mankin评分升高更明显(P < 0.05)。提示软骨组织特异性SIRT1基因敲除膝骨关节炎小鼠动物模型建立成功。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：肾移植；肝移植；移植；心脏移植；组织移植；皮肤移植；皮瓣移植；血管移植；器官移植；组织工程

关键词: 实验动物模型, 骨及关节损伤动物模型, 高龄, SIRT1, 基因敲除, 膝骨关节炎, 前交叉韧带, 半月板, Mankin评分, 国家自然科学基金

Abstract:

BACKGROUND: Scholars in China and countries outside China conducted a lot of researches on the pathogenesis and treatment of osteoarthritis, and recently found that SIRT1 gene has an important significance in the pathogenesis of osteoarthritis. However, little is reported on SIRT1 gene, and there are few studies on animal models of knee osteoarthritis used for SIRT1 research.
OBJECTIVE: To establish specific SIRT1 gene knockout mouse models of knee osteoarthritis, in order to provide favorable conditions for the study of osteoarthritis.
METHODS: Mice were randomly divided into four groups according to the method of randomized controlled grouping: SIRT1+/+ control group (Group A, n=6); SIRT1+/+ osteoarthritis model group (Group B, n=6); SIRT1-/- control group (Group C, n=6); SIRT1-/- osteoarthritis model group (Group D, n=6). Unilateral knee anterior cruciate ligament transection and medial meniscectomy were conducted to establish mouse models of osteoarthritis. SIRT1 gene knockout was determined by quantitative fluorescence polymerase chain reaction. Knee cartilage morphological changes were observed by hematoxylin-eosin and safranin O-fast green double staining. The degree of knee osteoarthritis was evaluated by Mankin score.

中国组织工程研究杂志出版内容重点：肾移植；肝移植；移植；心脏移植；组织移植；皮肤移植；皮瓣移植；血管移植；器官移植；组织工程

中图分类号:

R318

于斐，雷鸣，曾晖，李明华，肖德明. 高龄小鼠沉默信息调节因子1基因敲除后膝骨关节炎模型的建立[J]. 中国组织工程研究, 2015, 19(49): 7895-7901.

Yu Fei, Lei Ming, Zeng Hui, Li Ming-hua, Xiao De-ming. Construction of elderly SIRT1 gene knockout mouse models of knee osteoarthritis[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2015, 19(49): 7895-7901.

图/表（结果） 4

2.1 实验动物数量分析实验中根据SIRT1基因是否通过Tamoxifen的诱导进行敲除分为SIRT1+/+小鼠组和SIRT1-/-小鼠组。由于采取自体对照，同一小鼠仅行单侧骨关节炎造模，对侧行假手术又分为SIRT1+/+小鼠假手术组(A组)，SIRT1+/+小鼠骨关节炎模型组(B组)，SIRT1-/-小鼠假手术组(C组)，SIRT1-/-小鼠骨关节炎模型组(D组)。实验中所用SIRT1+/+小鼠和SIRT1-/-小鼠各10只，由于在手术过程中对小鼠行麻药注射时因小鼠个体体质差异造成小鼠死亡，手术后饲养过程中小鼠出现正常死亡，以及1只小鼠用于取膝关节大体标本进行股骨下端和胫骨头的观察，同时为了确保实验中数据的可靠性，最终SIRT1+/+小鼠和SIRT1-/-小鼠各有6只进行后续实验，并通过自体对照最大限度减少小鼠的使用。
2.2 模型创新性及造模方法的改进本实验采用单侧膝关节前交叉韧带横断加内侧半月板切除建立高龄SIRT1基因条件性敲除小鼠膝骨关节炎模型，造成单侧膝关节不稳定，改进了以往实验中仅使用单条韧带切断或者单侧半月板切除，联合两种手术方式造成关节不稳模型，并结合SIRT1基因在高龄小鼠软骨组织中的敲除，既可以减少仅切断单条韧带造模时所用的时间，又使得小鼠在手术后关节不稳维持在其可承受范围内，最大程度的模拟老年人正常生活方式并维持手术对建立模型的作用，通过适当延长手术后小鼠的存活时间，模拟老年骨关节炎患者的患病状态。
2.3 模型更接近人类及临床实践根据杰克逊实验室文献可知^[20]，本实验中所用的15月龄小鼠与人类56-69岁相当，符合55岁以上人群中骨关节炎的好发年龄^[21]。SIRT1基因与衰老关系密切，通过条件性敲除SIRT1基因，实现了在15月龄敲除软骨组织中的SIRT1基因，既防止了SIRT1基因过早敲除对小鼠机体及模型建立的影响，又防止了SIRT1基因全身敲除对小鼠机体及模型建立的影响，从而能够更好的模拟老年阶段骨关节炎的发生情况，骨关节炎模型稳定，具有一定的转化医学意义。
2.4 SIRT1基因敲除小鼠(SIRT1-/-小鼠)繁殖与基因型鉴定情况 1只SIRT1co/co雄鼠和1只Col2-CreERT2雌鼠合笼繁殖4周后每对产仔8-10只，3周龄离乳，在耳部打钉进行标记，饲养至15月龄，注射Tamoxifen完毕7 d后建立骨关节炎模型，饲养至18月龄进行荧光定量PCR，结果显示SIRT1+/+小鼠SIRT1 mRNA表达量为8.336 67±1.799 02，SIRT1-/-小鼠SIRT1 mRNA表达量为2.086 62±1.086 19，差异有显著性意义(P < 0.01，图1)，证实SIRT1-/-小鼠关节软骨中SIRT1敲除成功。

2.5 骨关节炎造模后小鼠膝关节大体标本造模后小鼠膝关节关节面产生变化，手术组股骨下端及胫骨头处关节面粗糙，半月板损毁严重，未进行手术一侧膝关节表面光滑，半月板毁损较轻。通过对比可以看出SIRT1基因敲除组小鼠造模及未造模侧关节面均比SIRT1基因未敲除小鼠膝关节的关节面粗糙，并且半月板毁损程度更重(图2)。

2.6 骨关节炎造模后小鼠膝关节软骨组织学观察 A组软骨组织4层结构可分辨清楚，关节表面软骨平整无缺损，软骨细胞散在均匀分布，排列较整齐，染色均匀，软骨区域番红O染色明显，潮线完整平滑无血管通过。D组膝关节表面软骨毁损严重，形态不规则，发生糜烂、缺损，软骨变薄，甚至裸露软骨下骨，软骨细胞成簇分布，总数减少，染色深浅不一，软骨区域番红O失染甚至无染色，潮线弯曲不规则并且有血管通过。B组与D组、A组与C组相比，关节软骨退变的表现较轻(图3，4)。

4组小鼠膝关节Mankin评分结果A，B，C，D组分别为(2.500 0±0.547 72)，(7.500 0±0.547 72)，(3.166 7±0.752 77)，(10.166 7±1.722 40)分，B组与A组、D组与C组Mankin评分比较差异有显著性意义(P < 0.01)，D组与B组Mankin评分比较差异有显著性意义(P < 0.05，见图5)，C组与A组相比Mankin评分也略微升高，说明造模成功，并且SIRT1基因敲除后可以加重骨关节炎的进程。

参考文献

[1] Zhang W,Nuki G,Moskowitz RW,et al.OARSI recommendations for the management of hip and knee osteoarthritis:part Ⅲ: changes in evidence following systematic cumulativeupdate of research published through January 2009.Osteoarthritis Cartilage. 2010;18(4):476-499.

[2] Milner J.Cellular regulation of SIRT1.Curr Pharm Des. 2009; 15(1):39-44.

[3] Lafont JE.Lack of oxygen in articular cartilage:consequences for chondrocyte biology. Int J Exp Pathol. 2010;91(2):99-106.

[4] Fujita N,Matsushita T,Ishida K,et al.Potential involvement of SIRT1 in the pathogenesis of osteoarthritis through the modulation of chondrocyte gene expressions. J Orthop Res. 2011;29(4):511-515.

[5] Takayama K,Ishida K,Matsushita T,et al.SIRT1 regulation of apoptosis of human chondrocytes. Arthritis Rheum. 2009; 60(9):2731-2740.

[6] Yuan Z,Zhang X,Sengupta N,et al.SIRT1 regulates the function of the Nijmegen breakage syndrome protein. Mol Cell. 2007,27(1):149-162.

[7] Liao S,Guay C,Toczylowski T,et al.Analysis of MRE11's function in the 5'-->3' processing of DNA double-strand breaks. Nucleic Acids Res. 2012;40(10):4496-4506.

[8] Lee SY,Lee H,Kim ES,et al.WRN translocation from nucleolus to nucleoplasm is regulated by SIRT1 and required for DNA repair and the development of chemoresistance. Mutat Res. 2015;774:40-48.

[9] Mongkhon JM, Thach M, Shi Q,et al.Sorbitol-modified hyaluronic acid reduces oxidative stress, apoptosis and mediators of inflammation and catabolism in human osteoarthritic chondrocytes. Inflamm Res. 2014;63(8): 691-701.

[10] Tran D,Bergholz J,Zhang H,et al.Insulin-like growth factor-1 regulates the SIRT1-p53 pathway in cellular senescence. Aging Cell. 2014;13(4):669-678.

[11] Cohen HY,Miller C,Bitterman KJ,et al.Calorie restriction promotes mammalian cell survival by inducing the SIRT1 deacetylase.Science. 2004; 305(5682):390-392.

[12] van der Kraan PM,van den Berg WB.Osteoarthritis in the context of ageing and evolution. Loss of chondrocyte differentiation block during ageing. Ageing Res Rev. 2008; 7(2):106-113.

[13] Rodgers JT,Lerin C,Cerhart-Hines Z,et al.Metabolic adaptations through the PGC-1 alpha and SIRTI pathways. FEBS Lett. 2008;582(1):46-53.

[14] Ren T, Huang C, Cheng M. Dietary blueberry and bifidobacteria attenuate nonalcoholic fatty liver disease in rats by affecting SIRT1-mediated signaling pathway. Oxid Med Cell Longev. 2014;2014:469059.

[15] Laiguillon MC,Courties A,Houard X,et al.Characterization of diabetic osteoarthritic cartilage and role of high glucose environment on chondrocyte activation: toward pathophysiological delineation of diabetes mellitus-related osteoarthritis. Osteoarthritis Cartilage. 2015; pii: S1063-4584 (15)01147-4.

[16] Kostopoulou F,Gkretsi V,Malizos KN,et al.Central role of SREBP-2 in the pathogenesis of osteoarthritis. PLoS One. 2012;7(5):e35753.

[17] Li H,Rajendran GK,Liu N, et al.SIRT1 modulates the estrogen- insulin-like growth factor-1 signaling for postnatal development of mammary glandin mice.Breast Cancer Res. 2007;9(1):R1.

[18] Nakamura E,Nguyen MT,Mackem S.Kinetics of tamoxifen- regulated Cre activity in mice using a cartilage-specific CreER(T) to assay temporal activity windows along the proximodistal limb skeleton. Dev Dyn. 2006;235(9): 2603-2612.

[19] Wang J,Dong FF,Li XF,et al.Effects of Yiqi Huayu prescription on knee cartilage degeneration in HIF-1 gene knockout Mice. China J Orthop Trauma. 2013;26(6):486-492.

[20] Maximum Lifespan As a Biomarker of Aging-The Jackson Laboratory.http://research.jax.org/faculty/harrison/gerlvLifespan1.html.

[21] Zhang W,Nuki G,Moskowitz RW,et al.OARSI recommendations for the management of hip and knee osteoarthritis:part Ⅲ: changes in evidence following systematic cumulativeupdate of research published through January 2009. Osteoartliritis Cartilage. 2010;18(4):476-499.

[22] Lawrence RC,Felson DT,Helmick CQ, et al.Estimates of the prevalence of arthritis and other rheumatic conditions in the United States.Part II. Arthritis Rheum. 2008;58(1):26-35.

[23] Helmick CG,Felson DT,Lawrence RC, et al.Estimates of the prevalence of arthritis and other rheumatic conditions in the United States. Part I. Arthritis Rheum. 2008;58(1):15-25.

[24] de Oliveira RM,Pais TF,Outeiro TF.SIRTuins:common targets in aging and in neurodegeneration.Curr Drug Targets. 2010; 11(10):1270-1280.

[25] Lei M,Wang JG,Xiao DM,et al.Resveratrol inhibits interleukin 1β-mediated inducible nitric oxide synthase expression in articular chondrocytes by activating SIRT1 and thereby suppressing nuclear factor-κB activity. Eur J Pharmacol.2012; 674(2-3):73-79.

[26] Huh YH,Ryu JH,Chun JS.Regulation of type II collagen expression by histone deacetylase in articular chondrocytes. J Biol Chem. 2007;282(23):17123-17131.

[27] Liu FC,Hung LF,Wu WL,et al.Chondroprotective effects and mechanisms of resveratrol in advanced glycation end products- stimulated chondrocytes. Arthritis Res Ther. 2010; 12(5):R167.

[28] Hong EH,Lee SJ,Kim JS,et al.Ionizing radiation induces cellular senescence of articular chondrocytes via negative regulation of SIRT1 by p38 kinase. J Biol Chem. 2010;285(2): 1283-1295.

[29] Lei M,Liu SQ,Liu YL.Resveratrol protects bone marrow mesenchymal stem cell derived chondrocytes cultured on chitosan-gelatin scaffolds from the inhibitory effect of interleukin- 1beta.Acta Pharmacol Sin. 2008;29(11): 1350-1356.

[30] Elmali N,Esenkaya I,Harma A,et al.Effect of resveratrol in experimental osteoarthritis in rabbits. Inflamm Res. 2005; 54(4): 158-162.

[31] Lozoya KA, Flores JB. A novel rat osteoarthrosis model to assess apoptosis and matrix degradation. Pathol Res Pract. 2000;196:729-745.

[32] Mostkowitz RW,Davis W,Sammarco J,et al.Experimentally induced degenerative joints lesion following partial menisectomy in the rabbit. Arthritis Rheum. 1973;16:397-405.

[33] Stoop R,Buma P,van der Kraan M,et al.Type Ⅱ collagen degradation in articular cartilage fibrillation after anterior cruciate ligament transection in rats. Osteoarthritis Cartilage. 2001;9:308-315.

[34] Guingamp C,Gegout-Pottie P,Philippe L.Mono-iodoacetate- induced experimental osteoarthrit is:a dose-response study of loss of mobility,morphology,and biochemistry. Arthritis Rheum. 1997;40:1670-1679.

[35] Saied A,Cherin E,Gaucher H,et al.Assessment of art icular cart ilage and subchondral bone:subtle and progressive changes in experimental osteoarthritis using 50 MHz echography in vitro.J Bone Miner Res. 1997;12:1378-1386.

[36] Palmoski MJ,Colyer RA,Brandt KD,et al.Joint mot ion in the absence of normal loading does not maintain normal arti cular cartilage. Arthritis Rheum. 1980;23:325-334.

[37] Gu Y,Dai KR,Qiu SJ,et al.A Morphological Stydy of Degenerative Mechanism of Articular Cartiage Induced by Low Stress.Chin J Orthop. 1995;15:631-633.

[38] Masanori H.Changes in the nucleus pulposus of the intervertebral disc in bipedal mice. Clin Orthop.1983;175: 251-262.

[39] Machner A,Pap G,Schwarzberg H,et al.Deterioration of sensory joint innervation as an enabling factor for development of arthrosis.An animal experiment study of the rat model. Z Rheumatol. 1999;58:148-154.

[40] de Bri E,Jonsson K,Reinholt FP,et al.Focal destruction and remodeling in guinea pig arthrosis.Acta Orthop Scand. 1996; 67: 498-504.

[41] Bendele AM,Hulman JF.Spontaneous carti lage degeneration in guinea pigs. Arthritis Rheum. 1988;31:561-565.

引言

骨关节炎是一种与年龄密切相关的慢性退行性病变，软骨组织的退变丢失是其发生的基础。流行病学统计显示，骨关节炎在55岁以上人群的发病率为44%-70%^[1]，是影响国内老年人健康导致残疾的最主要疾病之一。目前，骨关节炎只能通过延缓疾病的进程达到缓解症状的目的，但没有治愈该病的有效措施。因此，对该病发生机制及治疗方法的研究刻不容缓。沉默信息调节因子1(silent information regulator 1，SIRT1)是一个在哺乳动物中研究最为深入的Ⅲ型去乙酰化酶，该基因位于10号染色体，编码的蛋白由500个氨基酸残基构成，它以去乙酰化的方式在翻译后水平调节下游基因及蛋白质的表达从而起到预防病毒感染、保护神经和控制细胞周期等多个方面的生物学效应^[2]。其可以通过调节组织代谢、抗氧化、抗自由基等多个方面影响机体及细胞的衰老过程^[2-3]。研究显示，骨关节炎发病时软骨细胞中SIRT1的表达水平明显降低^[4-5]。这可能是由于SIRT1通过多方面影响衰老过程造成的：首先，SIRT1在DNA损伤修复中起到重要作用，它可以募集修复蛋白，使后者聚集于损伤DNA链的末端，进行DNA的修复^[6-8]，从而使软骨细胞合成的细胞内基质产生变化，抵抗关节软骨的损伤及退变，减轻骨关节炎的症状^[9]；其次，SIRT1可以调节细胞中p53、ku70等蛋白的表达，减少细胞的衰老凋亡，延长细胞寿命^[10-11]，降低软骨组织衰老引起的骨关节炎发病的始动作用^[12]；最后，SIRT1还可以通过调节机体内糖代谢和胆固醇分泌等过程影响糖类及脂类物质在骨关节炎中引起的炎症作用^[13-16]。由此可见SIRT1基因在骨关节炎发病中的明显作用。
目前国内研究SIRT1基因的小鼠骨关节炎模型尚未建立，本实验室利用SIRT1co/co和Col2-CreERT2小鼠建立高龄SIRT1基因敲除骨关节炎模型小鼠，采用两种手术联合的方式改进骨关节炎的造模方式，并结合软骨组织SIRT1基因特异性敲除的高龄小鼠，模拟老年人群中骨关节炎的发生情况，以期建立稳定的相关动物模型，为骨关节炎发病机制的研究提供便利条件。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：肾移植；肝移植；移植；心脏移植；组织移植；皮肤移植；皮瓣移植；血管移植；器官移植；组织工程

材料方法

1.1 实验材料分组对照荧光定量PCR和组织学观察实验，于2013年4月至2014年10月在北京大学/香港科技大学医学中心深圳医院实验室完成。

1.2 造模动物 SIRT1co/co (B6；129-SIRT1tm1Ygu/J)小鼠和Col2-CreERT2[FVB-Tg(Col2a1-cre/ERT) KA3Smac/J]小鼠均购买自美国杰克逊实验室[17-18]，各3雄3雌，共12只。实验用小鼠饲养于北京大学/香港科技大学医学中心深圳医院实验动物中心SPF级屏障区域的PVC鼠笼内，持续过滤通气，自由饮食，清洁饮水，每日保持12 h光照/黑暗循环，垫料每周更换2次。实验过程中对动物的处置方法经北京大学深圳医院伦理委员会批准且符合2009年《Ethical issues in animal experimentation》相关动物伦理学标准的条例。
1.3 造模方法
SIRT1基因敲除小鼠(SIRT1-/-小鼠)的繁殖和基因敲除：SIRT1co/co小鼠和Col2-CreERT2小鼠先分别分笼进行繁殖，按照1只SIRT1co/co雄鼠和1只SIRT1co/co雌鼠合笼、1只Col2-CreERT2雄鼠和1只Col2-CreERT2雌鼠合笼的方式进行繁殖。待SIRT1co/co小鼠和Col2-CreERT2小鼠分别繁殖到20只以上，按照1只SIRT1co/co雄鼠和1只Col2-CreERT2雌鼠合笼的方式进行繁殖得到SIRT1+/+小鼠，SIRT1+/+小鼠繁殖到20只以上时正常条件下继续饲养，饲养至15月龄，取15月龄[体质量(100±10) g]小鼠12只，按随机数字表法分为对照组(SIRT1+/+小鼠组)和敲除组(SIRT1-/-小鼠组)，每组6只。其中SIRT1-/-小鼠组给予腹腔注射Tamoxifen[10 g/L，1 g/(L•g)， 1次/d，连续注射5 d]，SIRT1+/+小鼠组仅给予腹腔注射玉米油(剂量与SIRT1-/-小鼠组相同，1次/d，连续注射5 d)，注射完毕7 d后进行进行后续实验。
骨关节炎模型的建立：取注射Tamoxifen和玉米油后的SIRT1-/-小鼠和SIRT1+/+小鼠分别行单侧膝关节前交叉韧带横断加内侧半月板切除，造成单侧膝关节不稳定，对侧膝关节仅切开滑膜囊行假手术作对照。具体方案为：以小鼠髌骨为中心，在无菌条件下用手术刀片切开小鼠单侧膝关节直至暴露关节软骨，切口1.0-1.5 cm；屈曲小鼠膝关节在其内侧寻找前交叉韧带位置进行标记；用显微剪在侧方剪断前交叉韧带；将手术刀片尖端伸入小鼠膝关节股骨下端与胫骨头半月板处将半月板切除；缝合小鼠膝关节处的皮肤；对侧膝关节用同样方式暴露膝关节软骨后不进行手术直接缝合皮肤。一般条件下饲养3个月，处死小鼠后进行后续实验。
1.4 指标测定
荧光定量PCR反应鉴定SIRT1基因敲除小鼠(SIRT1-/-小鼠)的表型：取小鼠胸骨处软骨组织，磨碎提取总RNA，根据NCBI网站GeneBank查询目的基因SIRT1序列，引物合成使用Primer Premier 5.0软件，序列见表1。cDNA合成按照TaKaRa PrimeScript Ⅱ 1st Strand cDNA Synthesis Kit(D6210A)试剂盒说明书进行。按照各目的基因退火温度选择三步法完成扩增，循环44次。根据熔解曲线判断扩增产物的特异性，以GAPDH为内参。反应参数参考TaKaRa SYBR Premix Ex Taq Ⅱ (Perfect Real Time)试剂盒说明进行，运用Bio-Rad CFX96 Real Time PCR仪配套的Bio-Rad CFX Manager Software 1.6数据分析软件，采用2-ΔΔCt法开展数据分析。

膝关节软骨组织学检测及骨关节炎程度的评定：取双侧膝关节，体积分数10%甲醛固定后石蜡包埋，组织标本修切后100 g/L多聚甲醛固定24 h，脱钙后石蜡包埋，连续切片，片厚 5 μm，行苏木精-伊红、番红O-固绿双染色，参照文献[19]进行Mankin评分(表2)。

1.5 主要观察指标小鼠膝骨软骨组织SIRT1基因mRNA含量，膝关节软骨形态结构及Mankin评分。
1.6 统计学分析全部计量资料采用x(_)±s表示，两组样本之间进行t 检验，统计处理软件系统采用SPSS 19.0，P < 0.05为差异有显著性意义。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：肾移植；肝移植；移植；心脏移植；组织移植；皮肤移植；皮瓣移植；血管移植；器官移植；组织工程

讨论

骨关节炎是一种以关节软骨的退变丢失为基础的慢性退行性病变，受到软骨细胞代谢紊乱、软骨基质破坏及软骨下骨向软骨内侵蚀等的共同影响，延缓软骨组织进行性的退变是防治骨关节炎的重点所在。骨关节炎与衰老、年龄、肥胖、性别等多种因素相关，其发病机制不甚明确，目前只能通过延缓疾病的进展或者对症治疗达到缓解的目的，但是无法治愈。研究显示，衰老是导致骨关节炎发病的独立影响因素，骨关节炎在55岁人群的发病率为44%-70%，65岁以上人群中男性发病率约为60%，女性达70%^[21]，随着当今世界步入老龄化，骨关节炎的发病率也逐年上升^[21-23]，成为影响人群健康的主要疾病之一，也是造成老年人残疾的主要疾病之一。因此，对该病的研究刻不容缓，但是目前用于该病研究的模型仍然不多，本课题组根据研究的需要，建立高龄小鼠SIRT1基因敲除后膝骨关节炎模型，为骨关节炎的研究提供便利。
衰老是一个随着年龄增长而整个机体功能渐渐衰退的复杂过程，但近来的遗传研究显示它可能也像其他生理病理现象一样，受基因的调控，某个基因的突变可延缓机体的老化过程。SIRT1就是一个与衰老相关的基因。目前SIRT1调控衰老的机制可归纳为：抑制细胞凋亡，调控新陈代谢(热量消耗、脂肪贮存等)，维持氧化应力下线粒体的正常功能以及抑制炎症等多个方面^[2，24]。在软骨细胞方面，SIRT1 通过调节信号通路中蛋白的乙酰化水平，影响软骨细胞的分化表型和存活能力。Fujita等^[4]和Takayama等^[5]的实验证明软骨细胞中SIRT1的表达水平明显减少，这与作者的预实验中应用本院创伤性股骨颈骨折行髋关节置换的正常股骨头软骨组织标本和骨关节炎患者行髋关节置换的软骨组织标本中SIRT1表达量的检测一致。Takayama等^[5]通过siRNA干扰SIRT1表达的实验证实SIRT1 siRNA能显著降低正常软骨细胞特异性的聚集蛋白聚糖的表达导致软骨细胞向肥大表型分化，与此同时SIRT1可以通过调节线粒体内的凋亡通路引起软骨细胞的大量凋亡, 这在本课题组的前期研究中也得到了证实^[25]。也有文献提出，去乙酰化酶活性下降可以间接抑制Ⅱ型胶原的表达[26]，Liu等^[27]发现，白芦藜醇还可以通过激活SIRT1显著降低一氧化氮合酶及基质金属蛋白酶的表达,而抑制基质金属蛋白酶后可以减轻对Ⅱ型胶原的降解，可以显著降低因一氧化氮和放射线导致的软骨细胞凋亡^[5，28], 这和作者前期发现的白藜芦醇可保护分化的软骨细胞在类软骨支架材料上的存活和软骨表型的维持相似，这与白藜芦醇抑制核因子κB的功能有关，但SIRT1在其中的作用机制仍待阐明^[29]。在骨关节炎动物模型试验中，白藜芦醇关节腔内注射可显著降低病理性的软骨损伤评分等级，可能与其激活SIRT1有关，但其具体的作用机制仍然不甚明了^[30]。为了研究衰老与骨关节炎的关系，尤其是SIRT1基因与骨关节炎的关系，作者从美国杰克逊实验室引进SIRT1基因第4个外显子两侧插入3个Loxp位点的纯合子基因工程小鼠(SIRT1co/co小鼠)和Ⅱ型胶原启动子控制重组酶Cre表达的基因工程小鼠(Col2-CreERT2小鼠)，它们杂交所产生的后代在Tamoxifen的诱导下便可以实现在任意时间点对软骨组织中的SIRT1基因进行敲除，具有空间和时间双重特异性，从而做到了即敲除了SIRT1基因，又防止过早的敲除该基因对小鼠本身所产生的其他影响，为实验的开展提供了便利的条件，本课题组从美国杰克逊实验室引入这两种基因工程小鼠建立相关模型。根据美国杰克逊实验室的资料可知，18-24个月龄的小鼠相当于人类56-69岁^[20]，与流行病学研究中人类骨关节炎发病的高发年龄段相似，可以更好的模拟骨关节炎在体的发病情况，因此作者使用15个月龄的小鼠进行实验。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：肾移植；肝移植；移植；心脏移植；组织移植；皮肤移植；皮瓣移植；血管移植；器官移植；组织工程

高龄小鼠沉默信息调节因子1基因敲除后膝骨关节炎模型的建立

Construction of elderly SIRT1 gene knockout mouse models of knee osteoarthritis

PDF

可视化

被引次数

摘要/Abstract

引用本文

使用本文

图/表（结果） 4

参考文献

相关文章 15

引言

材料方法

讨论

文章快阅

延伸阅读

编辑推荐

Metrics

本文评价

[1]	刘翔翔, 黄云梅, 陈文列, 林如辉, 卢小冬, 李钻芳, 许亚晔, 黄美雅, 李西海. 早期骨关节炎模型大鼠半月板白区细胞的超微结构变化[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(8): 1237-1242.
[2]	刘少华, 周观明, 陈希聪, 肖可明, 蔡剑, 刘效仿. 前交叉韧带缺陷对固定平台单髁置换后中期疗效的影响[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(6): 860-865.
[3]	黎永华, 冯强, 谭仁霆, 黄世福, 邱金龙, 尹恒. 杜仲活性成分抗膝骨关节炎滑膜炎病变分子机制的网络药理学阐述[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(5): 765-771.
[4]	马子越, 巨啸晨, 张磊, 孙荣鑫. 保留与不保留残端重建前交叉韧带后移植物腱骨愈合的比较[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(4): 582-587.
[5]	张立书, 刘安琪, 何小宁, 金岩, 李蓓, 金钫. Alpl基因影响骨髓间充质干细胞治疗溃疡性结肠炎[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(25): 3970-3975.
[6]	杨威, 陈泽华, 易志勇, 黄旭东, 韩清民, 张荣华. 关节腔内注射透明质酸与安慰剂治疗早中期膝骨关节炎的疗效差异：基于随机、双盲、对照、临床试验的Meta分析[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(23): 3760-3766.
[7]	王皓, 陈明学, 李俊康, 罗旭江, 彭礼庆, 李获, 黄波, 田广招, 刘舒云, 眭翔, 黄靖香, 郭全义, 鲁晓波. 脱细胞猪皮基质构建组织工程半月板支架[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(22): 3473-3478.
[8]	彭超, 刘云鹏, 华国军, 杨家骥, 王星亮, 王小龙. 退行性内侧半月板后根撕裂半月板部分切除前后髋膝踝角与骨性关节炎进展的影像学评估[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(21): 3368-3373.
[9]	熊小龙, 王广积, 方业汉, 杜秀藩, 黄晖, 叶志方 . 自体腘绳肌重建前交叉韧带中可吸收螺钉和金属螺钉胫骨固定效果比较的Meta分析[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(21): 3438-3444.
[10]	左秀芹, 尹飒飒, 谢惠敏, 贾子善, 张立宁. 富血小板血浆在肌骨修复领域应用的适用性与相关规范[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(20): 3239-3245.
[11]	卢明峰, 赵立连, 邢基斯, 何利雷, 许挺, 王昌兵. 前交叉韧带重建后二次关节镜探查关节软骨的转归分析[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(2): 222-227.
[12]	郑维蓬, 魏合伟, 刘治军, 万雷, 陈胜, 廖志浩, 胡伟坚. 三维重建CT与X射线片评价单束前交叉韧带类等长重建后骨隧道及移植物状态的比较[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(18): 2881-2886.
[13]	孙凯, 陈蕾, 麦瑶, 胡花, 陈亮, 钟俊, 胡勇, 邱波. 加速康复外科在前交叉韧带重建围术期的应用[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(11): 1647-1651.
[14]	徐昌奎, 蒲小兵, 陆遥, 陈加荣, 潘磊. 载庆大霉素丝素蛋白作为半月板修复材料的安全性和抗菌性能[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(10): 1545-1549.
[15]	赵春涛, 卿明松, 余浪波, 彭笳宸. 运动学对线和机械力学对线指导全膝关节置换效果的Meta分析[J]. 中国组织工程研究, 2020, 24(9): 1435-1442.