颌面部及牙周组织工程骨的血管化和成骨策略

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2015.42.018

摘要/Abstract

摘要：

背景：颌面部骨缺损以及牙周组织缺损是影响人类功能和美观的重要疾病之一，组织工程骨成为了修复颌面部骨和牙周组织缺损的主要手段。目前已形成了种子细胞及细胞共培养、支架材料、微环境三者复合以构建组织工程骨的基本模式，将组织工程骨进行预血管化并促进其快速成骨可以减少植入物的坏死、吸收，提升骨缺损修复的成功概率。
目的：归纳总结近5年内组织工程骨在口腔颌面部及牙周组织上的研究新进展。
方法：对CNKI数据库和PubMed数据库2010年至2015年文献进行检索，中文检索关键词为：颌面；组织工程骨；骨再生；血管化；基因修饰；种子细胞；支架材料；微环境，英文检索词为：oral and maxillofacial，bone tissue engineering， bone regeneration，vascularization，Genetic modification，Seed cells，Support material， Micro environment。排除无关性研究、重复性研究，保留68篇中英文文献进行归纳总结。
结果与结论：组织工程骨在修复口腔颌面部及牙周缺损上的应用得到了巨大发展，在三维结构的支架材料上加载基因修饰的种子细胞可以有效的促进血管化进程，提高成骨效应，增加颌骨缺损修复术的成功概率。此外，在牙槽嵴缺损处或新鲜拔牙窝处植入组织工程骨材料，可以有效的恢复和保存牙槽嵴高度和宽度，为后续的修复治疗保证了良好的骨条件。在植入组织工程骨后，可在缺损处加载不同的外部环境刺激，可以通过调节细胞外基质成分或信号通路来改变血管化进程，而血管化是建立有效血循环，保证植入支架成功的前提条件。
中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

关键词: 组织构建, 骨组织工程, 颌面部骨缺损, 牙周组织缺损, 血管化骨再生

Abstract:

BACKGROUND: Maxillofacial bone and periodontal tissue defect is one of the important diseases that affect human functionality and aesthetic appearance, and bone tissue engineering becomes the main means to repair maxillofacial and periodontal tissue defects. Currently, the basic mode is constructed by the combination of co-culture of seed cells and cells, scaffolds and micro-environment. Pre-vascularization and rapid osteogenesis of tissue-engineered bone can reduce implant necrosis and absorption, and improve repair success rate.
OBJECTIVE: To summarize the new progress of bone tissue engineering used in the oral and maxillofacial and periodontal tissue in the past 5 years.
METHODS: CNKI database and PubMed database from 2010 to 2015 were searched using the keywords of “oral and maxillofacial, bone tissue engineering, bone regeneration, vascularization, genetic modification, seed cells, support material, microenvironment” in Chinese and English, respectively. After elimination of independent and repetitive studies, 68 articles were included in result analysis.
RESULTS AND CONCLUSION: The tissue-engineered bone has achieved tremendous progress in the repair of oral and maxillofacial and periodontal tissue defects. The three-dimensional scaffold with gene-modified seed cells can effectively promote the vascularization, improve the osteogenic effect and increased the probability of success in mandibular defect repair. In addition, tissue-engineered bone implantation into the alveolar ridge defects or fresh extraction fossa can effectively restore and preserve alveolar ridge height and width, to ensure a good bone condition for subsequent restorative treatment. After the implantation of tissue-engineered bone, different external environmental stimuli could be loaded at defect sites, and the extracellular matrix components or signal pathway could be adjusted to change the process of vascularization. Vascularization is a premise condition for the establishment of an effective blood circulation to ensure the success of scaffold implantation.
中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

Key words: Tissue Engineering, Jaw, Periodontium, Neovascularization, Physiologic

张馨月，李焰，李晨军. 颌面部及牙周组织工程骨的血管化和成骨策略[J]. 中国组织工程研究, 2015, 19(42): 6819-6825.

Zhang Xin-yue, Li Yan, Li Chen-jun. Maxillofacial and periodontal tissue-engineered bone: vascularization and osteogenesis strategies[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2015, 19(42): 6819-6825.

图/表（结果） 1

2.1.1 血管内皮祖细胞血管内皮祖细胞是血管内皮细胞的前体细胞，组织工程骨的重要种子细胞，具有促进缺血组织血管新生的能力^[2]。内皮祖细胞参与胚胎发育过程中及出生后的血管的形成，可在体外形成内皮样克隆，依靠其旁分泌释放的促血管生成因子来促进体内血管生成，更早的实现骨内血管循环系统的建立。内皮祖细胞具有促进骨修复的作用，其机制可能是通过旁分泌释放多种细胞因子，如血管内皮生长因子A、SDF-1α、转化生长因子β1等促进破骨前体细胞与破骨细胞的存活来促进骨修复早期的骨吸收活动^[3]。

血管内皮祖细胞可通过多种方式获得，首先可通过含Singlequot组合添加剂的EGM-2培养基在37 ℃，体积分数5%CO₂浓度，饱和湿度的条件下诱导骨髓干细胞分化而成，其在脱离人工诱导或进入机体后，可自行向骨或软骨发生分化，此外可以通过抽取外周血或婴儿新鲜脐带血等，经密度梯度离心分离及帖壁法提纯并进行扩增获得^[4]。通过第2种方法获得的内皮祖细胞较稳定，几乎不向骨或软骨分化。所获得的内皮祖细胞抗原CD34、CD133、vWF可用免疫荧光进行鉴定，其中CD133在成熟的血管内皮细胞中基本不表达，该抗体可作为内皮细胞与内皮祖细胞相鉴别的重要标志。

2.1.2 间充质干细胞间充质干细胞是胚胎源性细胞，是一种能分化成骨的成体干细胞，是成骨细胞的前体细胞，可直接转化为成骨细胞促进骨组织再生。临床上间充质干细胞的主要来源是脐带血和下颌第三磨牙发育中的牙蕾。CD44、CD90、CD105是其特异性表面标志^[5]。

间充质干细胞具有多向分化的潜能，与异体骨细胞相容性好，成骨能力强，是骨损伤修复的细胞来源。目前口腔可使用的间充质干细胞包括骨髓间充质干细胞、脂肪来源的间充质干细胞和牙源性间充质干细胞。其中颌骨间充质干细胞和牙源性间充质干细胞具有较强的增殖和成骨分化能力，较易诱导分化形成需要的口腔黏膜、牙体、牙周或骨组织。Li等^[6]研究证明，人牙髓间充质干细胞能够诱导成骨和类骨质的形成。同时间充质干细胞可形成细胞膜片，姚超等^[7]应用骨髓间充质干细胞细胞膜片包裹含有骨形态发生蛋白2、血管内皮生长因子的聚乳酸-乙醇酸共聚物支架表面，成功构建组织工程骨并修复犬下颌骨缺损。

2.1.3 牙周膜干细胞牙周膜干细胞是牙周组织工程中的重要种子细胞^[8]，在适宜的刺激下，可以分化为成骨细胞、破骨细胞、成牙骨质细胞、成纤维细胞等，可实现牙周组织特别是牙槽骨的再生。牙周膜干细胞为STRO-1阳性细胞，胞浆内细胞器相对较少，仅含有少量的粗面内质网、核糖体、线粒体，具有处于低分化细胞超微结构特点^[9]。可均一表达间充质细胞标志CD44、CD90、CD105，异质性表达间充质标志CD146、Stro-1，同时表达部分胚胎干细胞标志如Oct4、Nanog、SSEA-4、TRA-1-60阳性，Sox2、TRA-1-81阴性，同时具有间充质干细胞和胚胎干细胞特性^[10]。

张凤秋等^[11]收集21颗正畸牙牙根中1/3的牙周膜组织，接种于含体积分数10%胎牛血清的达尔伯克改良伊格尔培养基(DMEM)中进行培养，通过免疫磁珠分选系统进行细胞分选获得了STRO-1阳性细胞既人牙周膜细胞，在光学显微镜和相差显微镜下观察所培养的细胞为圆形、具备成纤维型细胞外观，同时具备克隆形成能力，有间充质干细胞的特点。罗傲翔等^[12]发现3D悬滴培养出的牙周膜干细胞形成矿化结节的数量及矿化相关基因碱性磷酸酶骨桥蛋白mRAN的表达显著高于2D培养的细胞。束丽红等^[13]对不同发育阶段的人牙周膜干细胞增殖能力进行了比较研究，发现根尖孔未闭合牙上采集的牙周膜干细胞其碱性磷酸酶活性、体外形成矿化结节的能力和DMP1、RUNX2、DSP、OSX等成牙/成骨相关蛋白表达均高于发育完成牙上采集的牙周膜干细胞。叶菁等^[14]研究发现，牙周膜干细胞可在体外诱导下分化为内皮细胞，同时炎症来源的人牙周膜干细胞比正常来源的人牙周膜干细胞具有更高的克隆形成能力和成血管能力。

贺慧霞等^[15]研究证明牙周膜干细胞不论与羟基磷灰石/磷酸三钙还是ADM复合后体内移植，均可显著增高牙槽嵴高度，是牙槽嵴增高重建、实现无牙合种植修复的有效途径。

牙周膜干细胞需拔除一定量的自体牙后培养获得，培养成功率有限，目前发现牙龈成纤维细胞在一定刺激下也有成骨表型，且取材方便，培养成功率高，成为了牙周组织工程种子细胞的新热点。

2.1.4 其他常用种子细胞诱导式多潜能干细胞与胚胎干细胞的分化潜能和自我更新能力相似，能够分化成为牙囊、牙周组织、牙龈组织等，来源广泛，不受伦理学限制，可通过牙周膜干细胞、脱落乳牙干细胞、牙乳头干细胞以及牙囊前体干细胞等诱导重编程形成。诱导多能干细胞具有成骨分化潜能，段学静^[16]证实釉基质蛋白对诱导多能干细胞具有诱导定向分化的作用，将诱导多能干细胞和釉基质蛋白共同用于牙周组织骨缺损，可以促进新生牙骨质和牙槽骨的生成。Hynes等^[17]成功诱导诱导多能干细胞转化为间充质干细胞并接种于牙周缺损部位,发现缺损部位新生组织形成并有部分矿化。表明诱导多能干细胞牙周的临床治疗中充满前景。

2.1.5 多细胞共培养以往的实验发现，单一的细胞培养不能使组织工程骨的存活率提高，需要将2种或2种以上的细胞同时或先后接种，共同培养。细胞间的相互作用能加快血管化的进程，提高成骨效应。目前用于构建血管化组织工程骨共培养体系的细胞来源主要有终末分化成熟的成体细胞、成体干细胞、胚胎干细胞、诱导多能干细胞等^[18]，常用的细胞共培养体系有内皮祖细胞/间充质干细胞，内皮细胞/成骨细胞等^[19]。

在缺氧时，Notch信号通路激活，抑制间充质干细胞分化为成骨细胞，在氧气充足的条件下，间充质干细胞的成骨分化能力将明显超过成软骨分化能力^[20]，将其与内皮祖细胞共培养后，内皮祖细胞可以提高间充质干细胞的体外存活能力促进间充质干细胞的成骨分化，同时促进间充质干细胞在支架材料上的黏附^[21]。此外，间充质干细胞为内皮祖细胞的血管化提供局部微环境，内皮祖细胞与间充质干细胞共培养后能显著增强成骨关和血管化关键标志物的表达，包括碱性磷酸酶、骨形态发生蛋白2、血管内皮生长因子、VⅢ因子等。同时，可早期实现骨缺损区的桥接，促进骨力学性能的恢复^[21]。

在内皮细胞与成骨细胞的共培养体系中，通过介导P38丝裂原活化蛋白激酶(p38 mitogen activated protein kinases，p38 MAPK)信号通路的转录，内皮细胞可支持成骨分化和维持成骨细胞的功能，加快成骨进程^[22]，同时，成骨细胞通过自分泌或旁分泌相关的促血管生长因子，如血管内皮生长因子等，促进内皮细胞形成血管。

牙周膜干细胞和骨髓间充质干细胞在牙周组织再生中具有协同作用^[23]。将骨髓间充质干细胞与多种牙源性干细胞共同培养后均能表现出向牙及牙周组织分化的潜能^[24-25]。王璇等^[26]将小型猪的牙周膜干细胞和骨髓间充质干细胞联合培养，通过实时定量PCR检测相对MEPE mRNA表达水平，发现联合培养组明显高于单独培养组，证明牙周膜干细胞可以促进骨髓间充质干细胞获得牙源性干细胞特性。

根端牙胚细胞是一个复杂的细胞群体，包含牙囊细胞，牙乳头和上皮根鞘等。童晓洁等^[27]将根端牙胚细胞与免疫磁珠法分离的牙周膜干细胞联合共培养，并加入50 μg/L的骨形态发生蛋白2，通过RT-PCR，茜素红染色和碱性磷酸酶活性检测等方法分析其相关成牙骨质基因及蛋白的表达变化，发现诱导后h牙周膜干细胞的碱性磷酸酶活性明显升高，牙骨质细胞相关基因如牙骨质附着蛋白、牙骨质蛋白、碱性磷酸酶，骨钙素的转录水平表达量均有不同程度的增高，矿化诱导14 d后，形成大量矿化结节，通过骨形态发生蛋白2与大鼠牙胚细胞的联合作用成功诱导牙周膜干细胞向成牙骨质细胞定向分化，同时其矿化能力较单独培养组有明显提高。

2.2 微环境干细胞的定向分化需要特殊的微环境和相关信号分子的联合作用^[28]。在组织工程骨血管化的进程中，微环境是促进血管化及成骨的重要微环境。

富血小板血浆是一种自体源性的生长因子，内含血管内皮生长因子、转化生长因子β等生长因子，促进血管形成和骨的修复^[29-30]。富血小板血浆可以通过激活PI3K-AKT-NFκB信号通路^[31]，促进骨髓间充质干细胞的旁分泌，主要是血管内皮生长因子和血小板衍生生长因子的分泌，降低骨髓间充质干细胞在恶劣环境条件的死亡。同时富血小板血浆能提高受体血清中一氧化氮的含量，在植入体的周围先形成微血管循环网，同时将成骨细胞带入，形成新骨^[32-34]。此外富血小板血浆能降低丙二醛的含量，增强血清中超氧化物歧化酶和GSH-px的活力，减轻自由基连锁反应-脂质过氧化反应，减少炎症的发生，间接促进血管化进程^[35-36]。

血管内皮生长因子能在植入体之后早期诱导新生幼稚血管长入支架，后期再血小板衍生生长因子的作用下，幼稚血管逐渐改建成熟，最终形成支架内成熟稳定的循环网络^[37]。血管内皮生长因子与其受体结合后通过产生血管基底膜分解所需的蛋白酶及整合素，促进内皮细胞的增殖与迁移，同时增加微血管通透性，促进新生血管形成。血小板衍生生长因子可通过募集周细胞，促进血管平滑肌细胞发育，促进新生血管的功能和稳定^[38]。

P38丝裂原活化蛋白激酶(p38 mitogen activated protein kinases，p38 MAPK)是存在于胞浆的蛋白质激酶，属于MAPK家族，它的活化和细胞的生长发育、增殖、分化、凋亡密切相关。有研究表明，p38可调控间充质干细胞的成骨分化^[39-41]。p38 MAPK可抑制锌指结构转录因子(OS. terix，OSX)和核转录因子Runx2的转录，进而影响细胞的成骨分化^[42]。聂嘉等^[43]使用p38 MAPK特异性抑制剂SB-203580干扰炎症组织来源的牙周膜干细胞后体外成骨诱导7 d，实时定量PCR检测细胞成骨关键基因Runx2和碱性磷酸酶的基因表达水平，成骨诱导21 d后茜素红染色检测牙周膜干细胞的矿化结节形成情况，发现sB-203580干扰后牙周膜干细胞的Runx2和碱性磷酸酶表达水平显著降低、矿化结节形成数量减少，表明特异性p38MAPK抑制剂阻断炎症组织来源的牙周膜干细胞的p38后，细胞的成骨分化能力也被显著抑制，证明了p38 MAPK在牙周膜干细胞的成骨分化中具有重要作用。

骨形态发生蛋白2是多功能细胞生长因子，为转化生长因子β超家族的成员之一，在胚胎发育过程中，骨形态发生蛋白2与胚胎干细胞的演变密切相关，具有调节间充质干细胞成骨向分化、血管发生、神经元向分化等功能^[44]。在牙周组织缺损区局部应用骨形态发生蛋白2，能有效促进牙周韧带、牙骨质和牙槽骨的重建，并可提高成骨细胞特异性基因的表达(骨桥蛋白，破骨细胞，BSP，Cbfal等)，促进成骨细胞的成熟，加快骨再生愈合过程^[45-47]。研究发现，将骨形态发生蛋白2作用于骨髓间充质干细胞，骨形态发生蛋白2能明显促进骨髓间充质干细胞的增殖^[48-49]，若阻断骨形态发生蛋白2的作用，体外培养的骨髓间充质干细胞几乎不能表现出增殖能力^[50]。将骨形态发生蛋白2作用于人牙周膜干细胞后，细胞表达的成骨分化标志物如Ⅰ型胶原酶、骨钙素等明显升高，其成骨能力显著高于单独培养组，证明牙周膜干细胞在骨形态发生蛋白2的诱导下有向成骨分化的趋势同时钙化能力增强^[51-52]。

此外，曹钰等^[53]通过利用EREG shRNA基因敲除EREG进行丧失性功能研究，利用重组EREG活性蛋白进行获得性功能研究，发现人重组表皮生长因子(Epiregulin，EREG)活性蛋白可增强牙周膜干细胞碱性磷酸酶活性和体外矿化能力。维甲酸对胚胎干细胞及多种成体干细胞具有成骨方向诱导作用，通过有限稀释法分离纯化牙周膜干细胞STRO-1，经维甲酸诱导14 d后，碱性磷酸酶染色阳性，21 d后茜素红染色阳性，骨桥蛋白、骨钙素、Ⅰ型胶原阳性表达，Ⅲ型胶原阴性表达，证明了牙周膜干细胞能够被维甲酸诱导向成骨样细胞分化^[54]。地塞米松可有效诱导牙周膜干细胞成骨分化，可显著提高碱性磷酸酶活性，促进茜素红矿化结节形成，提高成骨相关基因骨粘连蛋白及Ⅰ型胶原表达^[55]。EGRG、维甲酸、地塞米松等均对牙周膜干细胞的定向成骨分化具有良性诱导作用。

2.3 支架材料支架材料是骨组织工程学研究的热点领域，理想的支架材料应具备良好的生物相容性，良好的生物降解性，良好的材料-细胞界面，同时应有三维立体多孔结构，有一定的可塑性和一定的机械强度^[56]。通常情况下，单一类型的支架材料很难满足修复骨缺损的需要，目前口腔颌面部组织工程骨多采用复合材料，主要有生物陶瓷材料与高分子材料复合物，聚乳酸-聚羟基乙酸共聚物(poly(lactic-co-glycolic acid)，PLGA)，磷酸钙骨水泥/聚乳酸-羟基乙酸高分子聚合物(磷酸钙人工骨/聚乳酸-聚羟基乙酸共聚物)等。

生物陶瓷活性陶瓷包括磷酸三钙陶瓷、羟基磷灰石等，目前在骨组织工程学领域应用较多的是羟基磷灰石陶瓷材料，羟基磷灰石有良好的生物相容性，良好的骨传导性，但成形困难，强度低，脆性大。钟志华等^[57] 研究发现，将磷酸三钙与壳聚糖作为复合支架比单一成分支架更能促进牙周膜干细胞分化。
聚乳酸-聚羟基乙酸共聚物复合支架及磷酸钙人工骨/聚乳酸-聚羟基乙酸共聚物复合支架机械性能较好，降解速率可控，同时具有良好的生物相容性，具有较好的缓释能力，是用于药物控释、基因控释的常用支架。目前药物控释的组织工程骨是研究的热点，通过在支架材料上添加药物控释系统可以有序的控制支架材料的降解和血管化及成骨效应，提高植入成功率。据研究报告，在聚乳酸-聚羟基乙酸共聚物纳米纤维支架上加载促骨生成药物，如辛伐他汀等，可以在较长时间内保持药物的释放处于最佳浓度范围内^[58]，达到长期而有效的调节细胞的目的。对于各种原因引起的牙槽骨吸收或牙槽嵴缺损等，使用此类载有缓释系统的支架材料可加速和提高新骨形成的速度与质量。

纳米氧化锌(n-ZnO)材料是高生物活性、高吸收率高安全性的无机抗菌材料，将其与羟基磷灰石晶须复合形成的HAPw/纳米氧化锌材料，具备两者的生物学特性，可以减轻植入或手术后的炎症反应，可用于拔牙后拔牙创的填塞，有利于牙槽骨高度的保存。β-磷酸三钙可搭载自体浓缩骨髓血，内含大量间充质干细胞，可有效形成新骨，在临床试验中，自体骨髓复合支架材料可部分恢复牙槽嵴裂患者骨缺损区域的牙槽嵴高度，改善鼻基底塌陷，与传统的髂骨松质骨取骨术相比，手术创伤小，术后较短时间内即可进行活动，该支架材料复合体制备方法简单，不额外增加免疫排斥反应的风险^[59]。铌酸钾钠压电陶瓷是一种新型电活性骨组织替代材料，其负极电势表面能在短时间内促成陶瓷材料表面新城钙磷盐仿生矿化膜层，但其正极表面不利于钙磷盐沉积^[60]，该生物材料有待于进一步研究。透明质酸钠凝胶具有良好的生物相容性，申德山等^[61]在新西兰大白兔的下颌骨双尖牙区邻牙间隙的下方制备 6 mm×6 mm×3 mm骨缺损，进行对照试验，通过组织学检测、免疫组织化学染色和骨计量学研究分析各组修复效果，发现将透明质酸钠凝胶作为细胞载体，牙周膜干细胞可显著促进牙槽骨再生修复重建，同时成功修复兔牙槽突裂,证明该复合体具有良好应用前景。赵丙姣等^[62]将牙周膜干细胞接种于聚己内酯静电纺丝支架上观察其生长情况，结果发现牙周膜干细胞在聚己内酯静电纺丝支架上生长良好，证明聚己内酯静电纺丝支架与牙周膜干细胞具有良好的生物相容性，有望作为牙周组织工程的载体材料。

除材料的组成成分以外，支架的孔径大小、孔隙率以及孔之间的贯通性也是影响组织工程骨血管化和成骨的重要因素^[56]，研究发现平均孔径为32 μm的多孔支架是最理想的骨组织工程支架^[63]。

近年来，基因复合组织工程骨成为了研究的新热点，所谓基因复合组织工程骨是在组织工程骨的种子细胞内载入相关生物外源性基因，并使其与支架材料进行复合，组建基因修饰的组织工程骨。据研究报告，血管内皮生长因子165-骨形态发生蛋白2双基因复合组织工程骨能够使种子细胞在骨缺损或损伤部位安全、稳定、大量的表达血管内皮生长因子蛋白和骨形态发生蛋白2蛋白^[64]，可以有效的刺激间充质干细胞和内皮祖细胞向骨损伤的部位趋化并分泌大量的骨钙素、碱性磷酸酶蛋白等，促进血管化进程，早期建立有效的血循环，刺激成骨。载有骨形态发生蛋白基因的聚乳酸-聚羟基乙酸共聚物微球能够缓慢释放骨形态发生蛋白2基因，进一步转染有关细胞在骨缺损部位促进骨形成，是一种具有很好应用前景的骨缺损修复材料。

2.4 外部环境在骨缺损区域植入组织工程骨后，将其处于不同情况的外部环境中，其血管化及成骨进程有所不同。低强度脉冲超声(LIPUS)能通过引起组织温度变化，提高细胞内酶活性，如基质金属蛋白酶1等，来参与血管形成，促进血管化构建，同时还可促进碱性成纤维细胞生长因子、血小板衍生生长因子、血管内皮生长因子等的表达，加快钙盐沉积，刺进新生骨质结构的改建和成熟，缩短成骨修复时间^[65]。据王居勇等^[66]报告，使用强度为30 mW/cm²，频率为1.5 MHz的低强度超声波处理Fischer-344鼠背部右侧组织工程骨后5，10，25和50 d，实验组血运及成骨状况均优于对照组。研究发现，20 kPa的持续静压力作用于牙周膜干细胞时，破骨细胞核因子KB受体活化因子配基mRNA和蛋白的表达量变化不明显^[67-68](见图1)，但骨保护因子骨保护素的表达量明显升高，KB受体活化因子配基/骨保护素的比值明显降低；当压力值为100 kPa时，KB受体活化因子配基mRNA和蛋白的表达量明显升高，但骨保护素的表达量降低，KB受体活化因子配基/骨保护素的比值明显升高；当压力值为200 kPa时，KB受体活化因子配基、骨保护素mRNA和蛋白的表达量均明显降低，其中以KB受体活化因子配基下降的程度更加明显，KB受体活化因子配基/骨保护素的比值明显降低，证明了持续的静压力作用可使牙周膜干细胞表达骨保护素和KB受体活化因子配基/骨保护素的比值明显降低，并具有力值依赖性，同时不同压力作用不同时间对牙周膜干细胞的凋亡作用不同，证明了静压力对牙周膜干细胞的成骨分化有较大影响。

参考文献

[1] Khademi R, Mohebbi-Kalhori D, Hadjizadeh A.Computational study of culture conditions and nutrient supply in a hollow membrane sheet bioreactor for large-scale bone tissue engineering. J Artif Organs. 2014; 17(1):69-80.
[2] Alevc,liM,Asahara T.Endothelial progenitor cells: A novel tool for the therapy of ischemic diseases. Antioxid Redox Signal. 2011; 15:949-965
[3] 庞浩.血管内皮祖细胞促进骨缺损修复重建的作用机制研究[D]. 重庆: 第三军医大学, 2013.
[4] Christian N, Charlotte S,Theresia P, et al.The cell surface proteome of human mesenchymal stromal cells PLoS One. 2011;6(5):1546-1651.
[5] Luang S,Leung V,Peng S, et al. Developmental definition of MSCs: new insights into pending questions. Cell Reprogram. 2011;13(6):465-472．
[6] Li JH, Liu DY, Zhang FM,et al. Human dental pulp stem cell is a promising autologous seed cell forbone tissue engineering. Chin Med J.2011;124(23): 4022-4028.
[7] 姚超,卜令学,王科,等.应用细胞片层技术构建组织工程骨修复犬下颌骨缺损的实验研究.华西口腔医学杂志,2012,30(3):229-233.
[8] Menicanin D, Mrozik KM, Wada N, et al. Periodontalligament- derived stem cells exhibit the capacity for long-term survival, self-renewal, and regeneration of multiple tissue types in vivo. Stem Cells Dev.2014;23(9):1001-1011
[9] Zeng HL, Zhong Q, Qin YL, et al.Hypoxia-mimetic agents inhibit oliferation and alter the morphology of human umbilical cord-derived mesenehymal stem cells.BMC Cell Biol.2011; 12(1): 32-42．
[10] 谷子芽,李颖,张文元,等.几种胚胎干细胞标志在牙周膜细胞中的表达及意义[J],口腔医学,2013,33(12):796-880.
[11] 张凤秋,孟焕新,韩劫,等.人牙周膜间充质干细胞的分离培养及超微结构观察[J],北京大学学报(医学版),2014,46(2):274-277.
[12] 罗傲翔,吴补领,侯晋,等. 3D培养牙周膜干细胞生物学特性的初步研究[J].牙体牙髓牙周病学杂志,2014,24(5):264-268.
[13] 柬丽红,曹灵,闫明,等.不同发育阶段的人牙周膜干细胞增殖能力和成牙/成骨能力的比较研究[J].口腔生物医学,2013,4(2):65-69.
[14] 叶菁,张戎,褚云娟,等.正常和炎症来源的人牙周膜干细胞内皮向分化能力的比较[J].牙体牙髓牙周病学杂志,2014,24(1):7-12.
[15] 贺慧霞,刘洪臣,马军利,等.牙周膜干细胞用于犬牙槽嵴组织工程化增高的实验研究[J].中华老年口腔医学杂志,2013,11(4):199-204.
[16] 段学静.釉基质蛋白在体外对诱导性多能干细胞的作用及其共同在牙周再生中的应用[D].济南:山东大学口腔医学院,2010．
[17] Hynes K, Menicanin D, Han J, et al. Mesenchymal stem cells from ips cells facilitate periodontal regeneration.J Dent Res. 2013,92(9):833-839.
[18] Szpalski C, Barbaro M, Sagebin F,et al.Bone tissue engineering: current strategies and techniques-part II:Cell types.Tissue Eng Part B Rev,2012,18(4):258-269.
[19] 付维力, 项舟.血管化组织工程骨构建中细胞共培养体系的研究进展[J].中国修复重建外科杂志,2014,28(2):179-185.
[20] Xu N, Liu H,Qu F, et al.Hypoxia inhibits the differentiation of me senchymal stem cells into osteoblasts by activation of Notch signaling. Exp Mol Pathol.2013;19:748-758
[21] 赵娴.自体外周血EPCs与BMSCs联合PDPBB构建微血管化生物骨[D].昆明: 昆明医科大学, 2013
[22] Estrela C,Alencar A,Kitten GT,et al.Mesenchymal stem cells in the dental tissues:perspectives for tissue regeneration. BrazDent J.2011;22(2):91-98．
[23] Xie H, Ⅱu H．A novel mixed•type stem cell pelet for cementum periodontal ligament-like complex.J Periodontol. 2012; 83(6): 805-815．
[24] Yang ZH, Jin F, Zhang XJ, et al．A novel possible strategy based on self-assembly approach to achieve complete periodontal regenera-tion．Artif Organs.2010;34(7):603-609．
[25] Lei G, Yu Y, Jiang Y, et al．Diferentiation ofBMMSCsinto odon-toblast-like cells induced by natural dentine matrix.Arch OralBiol.Pii:S0003-9969(13)00007-1.
[26] 王璇,刘奕杉,马艳,等.牙周膜干细胞诱导骨髓间充质干细胞的牙向分化[J],细胞与分子免疫学杂,2013,29(8):818-822.
[27] 童晓洁,兰泽栋,郑雅心,等.骨形成蛋白-2和牙胚细胞联合作用诱导人牙周膜干细胞表达成牙骨质细胞的表型研究[J],中国美容医学,2014,23(16):1343-1348 .
[28] Dapeng L, Xiaojie L, Ping G, et al．Erk1, 2 signalling is involved in the diferentiation of periodonml ligament stem cells to Schwann cells in dog.Arch Oral Biol.2014;59(5):487-491.
[29] 文军. 改良富血小板血浆对乳牙牙髓干细胞增殖和成骨分化的作用研究[D].广州: 南方医科大学,2014.
[30] 刘斌钰,刘斌焰,邢雁霞,等. PRP 在颅骨缺损修复中血管化的实验研究[J].山东大学学报(医学版),2015;53(2):27-33.
[31] 彭艳. 富血小板血浆激活PI3K/AKT/NFκB信号通路促进骨髓间充质干细胞再生及修复功能的相关研究[D],广州:南方医科大学,2013.
[32] 赵天源,孙红.骨组织工程支架材料及其血管化的研究进程[J].中国组织工程研究,2013,17(38):6832-6838.
[33] Sheu SY,Tsai CC, Sun JS, et al. Stimuatory effect of puerarin on bone for mation1 through coactivation of nitricoxide and bone morphogenetic protein-mitogen- activatedprotein kinases pathways in mice.Chin Med (eng1).2012;125(20):3646-3653
[34] Russell JA, Connor NP, Hartig GK. Iontophoretic delivery of nitric oxide donor improves local skin flap viability.J Rehabil Resdev.2010;47(1):61-66．
[35] Benjamin S, Sheyn D, Ben-David S,et al.Oxygenated environment enhances both stem cell survival and osteogenic differentiation.Tissue Eng Part A.2013;19:748-58.
[36] Zhang PJ, Liu BY, Zhang LH, et al. Effects of Shengtaiwang Potion on the Activity of Antistress and Antioxidase in Mice.Chi J Exp Tra Med For.2012;18(10):221-223．
[37] 李受益.双因子诱导骨组织工程支架快速血管化的动物实验研究[D].天津:天津医科大学,2013.
[38] Schwarz F,Ferrari D,Podolsky L,et al. Initial pattern of angiogenesis and bone formation following lateral ridge augmentation using rhPDGF and guided bone regeneration: an immunohistochemical study in dogs. Clin Oral Implants Res. 2010;21(1):90-99.
[39] Liu N, Shi S, Deng M, et al. High levels of 13-catenin signaling reduce osteogenie differentiation of stem ce[1s in inflare-matory microenvironments through inhibition of the noncanonical Wnt pathway．J Bone Miner Res.2011;26(9):2082-2095．
[40] Zhou Y, Guan X, Wang H, et al. Hypoxia induces osteo-Genic/ angiogenic responses of bone marrow-derived mesenchyma1 8tromal ce11s seeded on bone-derived scaffolds via ERK1/2 and p38 pathways.Biotechnol Bioeng.2013;110(6):1794-1804.
[41] Li XD,Liu ZY,Chang B,et al.Panax notoginseng saponins promote osteogenic differentiation of bone marrow stromal cells through the ERK and P38 MAPK signaling pathways. Cell Physiol Biochem.2011;28(2):367-376.
[42] Aaigas N, Urefia C, Rodrigu ez-Carballo E, et al. Mitogen- activated protein kinase(MAPK)-regulated interactions between Osterix and Runx2 are critical for the Transcriptional Osteogenic Program.J Biol Cbem.2014; 289(39): 27105- 27117.
[43] 聂嘉,张博,顾斌,等. p38丝裂原活化蛋白激酶在炎症微环境作用下对牙周膜干细胞成骨分化的影响[J].中国医学科学院学报, 2015,37(1):1-7.
[44] Hughes FJ, Ghuman M, Talal A. Periodontal regeneration:a challenge for the tissue engineer?. Proc Inst Mech Eng H, 2010, 224(12):1345-1358．
[45] Lo KW , Ulery BD, Ashe KM, et al. Studies ofbone morphogenetic protein-based surgical repair. Adv Drug Deliv Rev.2012;64(12):1277-1291．
[46] van Hout WM, Mink VDMA, Breugem CC, et al.Reconstruction of the alveolar cleft:can growth factor-aided tissue engineering replace autologous bone grafting?A literature review and systematic review of results obtained with bone morphogenetic protein-2. Clin Oral Investig.2011;15(3):297-303．

[47] Grgurevic L, Macek B, Mercep M, et al. Bone morphogenetie protein(BMP)1-3 enhances bone repair. Biochem Biophys Res Commun.2011;408(1):25-31．
[48] Su J, Xu H, Sun J, et al. Dual delivery of BMP-2 and bFGF from a new nano-composite scaffold, loaded with vascular stents for large-size mandibular defect regeneration. J Mol Sci. 2013;14(6): 12714-12728.
[49] Park SY, Kim KH, Shin SY, et al. Dual delivery of rhPDGF-BB and bone nlalTow mesenchymal stromal cells expressing the BMP-2 gene enhance bone formation in a critical-sized defect model．TsueEngPartA.2013;19(21-22):2495-2505．
[50] Guo Y,Zeng Q,Yan Y,et al.Proliferative effect and osteoin-ductive potential of extracellular matrix coated on cell culture plates. Springerplus.2013;2(1):303.
[51] Hakki SS, Bozkurt B, Hakki EE, et al. Bone morphogenetic protein-2, -6, and-7 differently regulate osteogenic differentiation of human periodontal ligament stem ceHs. J Biomed Mater Res BAppl Biomater.2014;102(1):119-130．
[52] Khanna-Jain R, Agata H, Vuorinen A, et al.Addition of BMP-2 or BMP-6 to dexamethasone, ascorbic acid, and betaglycerophosphate may not enhance osteogenic differentiation of human periodontal ligament cells.Growth Factors. 2010;28(6):437-446．
[53] 曹钰,杜娟,范志朋.表皮生长因子Epiregulin促进牙周膜干细胞成骨分化[J].北京口腔医学,2013,21(3):125-128.
[54] 张鹏涛,钟良军,张远, 等.维甲酸诱导小型猪牙周膜干细胞的体外成骨[J].中国组织工程研究与临床康复,2011,15(49):9218-9222.
[55] 谷子芽,翟强,吕秋峰, 等.地塞米松诱导牙周膜干细胞的定向成骨分化及凋亡 [J].中国组织工程研究,2013,17(40):7090-7095.
[56] Saleh FA,Whyte M,Genever PG,et al.Effects of endothelial cells on human mesenchymal stem cell activity in a three- dimensional in vitro model.Eur Cell Mater. 2011;22:242-257.
[57] 钟志华,施斌,周先略.牙周膜干细胞在磷酸三钙/壳聚糖支架上生长的体外实验[J].口腔医学研究,2015,1(2):113-116.
[58] 姜力铭.PLGA纳米纤维支架缓释辛伐他汀促进骨再生的研究[D].长春:吉林大学,2011.
[59] 吴欢欢.组织工程骨构建策略及自体浓缩骨髓血复合支架修复齿槽裂的临床研究[D].北京:北京协和医学院,2014.
[60] 余遵雄.铌酸钾钠压电陶瓷的制备及其生物学性能研究[D].广州:华南理工大学,2014.
[61] 申德山,刘亚蕊,张清彬等.牙周膜干细胞移植促进兔牙槽突裂成骨修复研究[J].中国实用口腔科杂志,2013,2:96-99.
[62] 赵丙姣,李远远,刘月华.聚己内酯静电纺丝支架与人牙周膜干细胞的生物相容性[J].临床口腔医学杂志,2014,30(5):269-272.
[63] Traini T, Novaes AB,Piattelli A et al.The relationship between interimplant distances and vascularization of the interimplant bone. Clin Oral Implants Res.2010;21(8):822-829.
[64] 宋晓彬.VEGF及BMP2基因修饰对血管化组织工程骨的影响及机制研究[D].济南:山东大学,2012.
[65] 陈广栋, 陈建常. 低强度脉冲超声波促进组织工程骨血管化重建的研究进展[J].中国矫形外科杂志,2010;18(17):1450-1452.
[66] 王居勇,沈惠良,刘利民, 等.经低强度超声波照射后组织工程骨成骨的组织学观察[A]. 第8届北京国际康复论坛文集(上册)[C], 2013:112-117.
[67] 申琳,刘文佳,杨振华, 等.静态压力对人牙周膜干细胞凋亡相关蛋白表达的影响[J].现代生物医学进展,2015,15(12):2213-2218.
[68] 马小杰,刘文佳,杨振华, 等.静压力对人牙周膜干细胞骨向分化能力的影响[J].牙体牙髓牙周病学杂志,2015,25(3):137-141.