慢性脑缺血模型大鼠神经突触可塑性与N-甲基-D-天门冬氨酸型受体

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2015.40.019

中国组织工程研究 ›› 2015, Vol. 19 ›› Issue (40): 6498-6503.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.2015.40.019

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慢性脑缺血模型大鼠神经突触可塑性与N-甲基-D-天门冬氨酸型受体

王璐¹，霍帅¹，王亚飞²，赵琳¹，刘伯锋¹，阮彩莲¹，惠雪枫¹

1延安大学医学院解剖教研室，陕西省延安市 716000； 2延安市人民医院神经外科，陕西省延安市 716000

出版日期:2015-09-30 发布日期:2015-09-30
通讯作者: 霍帅，男，1980年生，陕西省延安市人，延安大学在读硕士，主要从事神经损伤修复的有关研究。
作者简介:王璐，男，1972年生，陕西省咸阳市人，硕士，副教授，主要从事人体解剖学教学和神经损伤修复的有关研究。
基金资助:
陕西省计生委卫生科研项目(2014D30)；延安市2013年度科学技术研究发展计划项目(2013-kw33)

The regulating effect of N-methyl-D-aspartate receptor on neural synaptic plasticity in a rat model of chronic cerebral ischemia

Wang Lu¹, Huo Shuai¹, Wang Ya-fei², Zhao Lin¹, Liu Bo-feng¹, Ruan Cai-lian¹, Hui Xue-feng¹

1Department of Anatomy, Yan’an University School of Medicine, Yan’an 716000, Shaanxi Province, China; 2Department of Neurosurgery, the People’s Hospital of Yan’an, Yan’an 716000, Shaanxi Province, China

Online:2015-09-30 Published:2015-09-30
Contact: Huo Shuai, Studying for master’s degree, Department of Anatomy, Yan’an University School of Medicine, Yan’an 716000, Shaanxi Province, China
About author:Wang Lu, Master, Associate professor, Department of Anatomy, Yan’an University School of Medicine, Yan’an 716000, Shaanxi Province, China
Supported by:
This study was supported by a grant from the Medical and Scientific Research Project of Shaanxi Provincial Family Planning Commission of China, No. 2014D30; a grant from Science and Technology Research Development Program in 2013 of Yanan City in China, No. 2013-kw33

摘要/Abstract

摘要：

背景：N-甲基-D-天门冬氨酸型受体是与神经突触可塑性密切相关的离子型谷氨酸受体，且由N-甲基-D-天门冬氨酸型受体启动突触的可塑性调节。
目的：探索N-甲基-D-天门冬氨酸型受体亚单位N-甲基-D-天门冬氨酸型受体亚单位2A(NR2A)和N-甲基- D-天门冬氨酸型受体亚单位2B(NR2B)在脑缺血后对神经突出的可塑性调节机制。
方法：60只Wistar大鼠随机等分为假手术组和脑缺血组，脑缺血组大鼠依据改良型2VO模型方法构建大鼠慢性脑缺血模型，假手术组大鼠不结扎颈总动脉和迷走神经。
结果与结论：慢性缺血后0-12 h大鼠大脑海马中NR2A表达水平逐渐降低，而NR2B慢性缺血后4 h达到峰值，且在脑缺血的情况下，无论低频或高频刺激均不能诱导长时程增强的形成。提示NR2B对条件刺激诱导的长时程增强形成有抑制作用；而NR2A对条件刺激长时程增强形成具有促进作用。
中国组织工程研究杂志出版内容重点：肾移植；肝移植；移植；心脏移植；组织移植；皮肤移植；皮瓣移植；血管移植；器官移植；组织工程

关键词: 实验动物, 脑及脊髓损伤动物模型, 慢性脑缺血, N-甲基-D-天门冬氨酸型受体亚单位2A, N-甲基-D-天门冬氨酸型受体亚单位2B, 长时程增强, 神经突触可塑性, 海马CA1区

Abstract:

BACKGROUND: N-methyl-D-aspartate receptor is an ionic glutamate receptor which is closely related with the neural synaptic plasticity, and also can regulate neural synaptic plasticity.

OBJECTIVE: To explore the mechanism by which N-methyl-D-aspartate receptor subunits NR2A and NR2B regulate neural synaptic plasticity after cerebral ischemia.

METHODS: 60 Wister rats were randomly and evenly divided into a sham-operated group and a cerebral ischemia group. Rat models of chronic cerebral ischemia were established using the modified bilateral common carotid artery occlusion method in the cerebral ischemia group, while rats in the sham-operated group did not undergo occlusion of the common carotid artery and vagus nerve.

RESULTS AND CONCLUSION: At 0-12 hours after chronic cerebral ischemia, NR2A expression in the rat hippocampus was gradually decreased, while the expression of NR2B reached its peak level at 4 hours after cerebral ischemia. Under the circumstance of cerebral ischemia, neither low frequency nor high frequency induced long-term potentiation. These findings suggest that NR2B exhibit inhibitory effect, while NR2A exhibit promoting effect on long-term potentiation induced by stimulation.

中国组织工程研究杂志出版内容重点：肾移植；肝移植；移植；心脏移植；组织移植；皮肤移植；皮瓣移植；血管移植；器官移植；组织工程

Key words: Receptor, NMDA, Long-term Potentiation, Cerebral Ischemia, Hippocampus

中图分类号:

R318

王璐，霍帅，王亚飞，赵琳，刘伯锋，阮彩莲，惠雪枫. 慢性脑缺血模型大鼠神经突触可塑性与N-甲基-D-天门冬氨酸型受体[J]. 中国组织工程研究, 2015, 19(40): 6498-6503.

Wang Lu, Huo Shuai, Wang Ya-fei, Zhao Lin, Liu Bo-feng, Ruan Cai-lian, Hui Xue-feng. The regulating effect of N-methyl-D-aspartate receptor on neural synaptic plasticity in a rat model of chronic cerebral ischemia [J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2015, 19(40): 6498-6503.

图/表（结果） 2

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引言

材料方法

1.1 动物及材料选取成年清洁Ⅰ级雄性Wistar大鼠60只，鼠龄9-11周，体质量300-350 g，清洁级饲养室喂养，饲养环境为恒温动物房(18-25 ℃)，购自北京维通利华实验动物技术有限公司，动物生产许可证：SCXK(京)2007- 0005。大鼠饲养于湿度50%-70%，光照150-200 Lx，顶端照明，12 h明暗交替，噪声 < 50 dB，环境条件设有自控和报警系统，动物实验使用许可证：SYXK(陕)2012- 0007。饮水为自来水经水处理器过滤。实验经延安大学医学院动物伦理委员会批准。

检测脑缺血大鼠中NR2A和NR2B亚基的作用使用的主要试剂及仪器：
试剂及仪器	来源
NR2A(鼠抗)和NR2B(鼠抗)，化学发光试剂盒	武汉博士德生物工程有限公司
Biofuge stratos高速冷冻离心机	德国Kendro公司
NanoDrop ND-2000超微量分光光度计	美国Thermo Scientific公司
UniCel DxI 800全自动化学发光免疫分析仪	美国Beckman Coulter公司
BIO-RAD GS800激光吸光度扫描仪	美国BIO-RAD公司
AXON膜片钳放大器200B\700B	上海先仪谱生物科技有限公司

1.2 造模及取材实验于2012年1月至2014年12月在延安大学医学院实验室完成。

造模方法：60只Wistar大鼠随机分为假手术组和脑缺血组，各30只。根据王兴华等^[12]慢性脑缺血2VO模型的改良方法，以乙醚麻醉Wistar大鼠，无菌条件下从单侧大鼠颈总动脉上方的颈侧部手术分离颈总动脉和迷走神经后停止麻醉，然后结扎；于该侧结扎1周后手术结扎另一侧颈总动脉，成功标志为大鼠出现意识障碍且反正反射消失，视为完成大鼠慢性脑缺血模型(图1)。假手术组大鼠不结扎颈总动脉和迷走神经。

模型大鼠脑组织悬液的制备：分别于慢性脑缺血模型大鼠构建成功后0，4和12 h后，断颈处死2组大鼠，立刻取出大脑并在冰上剥离大鼠脑双侧海马，用预冷超纯水冲洗脑组织中残留的血液，称质量后液氮速冻，贮存于-80 ℃冰箱中备用。根据Luo等^[10]文献描述的方法制备海马蛋白样品，即在液氮冷冻条件下用研钵将样品研成粉末，每1 g样品分别加入5，10 mL裂解液，用玻璃匀浆器在冰浴中进行匀浆。匀浆液在4 ℃高速冷冻离心机以12 000×g离心 15 min；吸取上清液于4 ℃，以15 000×g离心60 min，弃去上层悬浮的脂质层，吸取上清液于4 ℃，60 000×g离心60 min，取离心上清液，贮存于-80 ℃冰箱中备用。并用分光光度计测定蛋白浓度。

1.3 Western blot检测N-甲基-D-天门冬氨酸型受体亚单位NR2A和NR2B的表达水平提取大鼠海马蛋白样品上清液20 µL，经SDS-PAGE蛋白电泳后转膜，进行N-甲基-D-天门冬氨酸型受体亚单位NR2A和NR2B的Western blot杂交，然后进行化学发光检测，并采用BIO-RAD GS800激光吸光度扫描仪读取相对积分吸光度以假手术组作为对照，进行N-甲基-D-天门冬氨酸型受体亚单位NR2A和NR2B定量分析。

1.4 场电位记录慢性脑缺血后长时程增强形成分别于大鼠慢性脑缺血实验动物模型构建成功后0，4和12 h后，无菌条件下断颈处死所有大鼠，立刻取出大鼠脑并分离大鼠脑双侧海马，置含糖7.5 g/L的HBSS中，在铺有3%琼脂的活组织切片机上切取海马脑片，片厚400 μm。6孔培养板内各加入1.3 mL的海马脑片培养液，然后放入插入式微孔滤膜，将完好的海马脑片分放在各孔内的滤膜上，每孔8张。置37 ℃、体积分数5%CO₂、平衡湿度的标准培养箱内培养，每周更换培养液2次，每次换液1.2 mL。培养液成分为：50%BME，25%HBSS，24%马血清，50×10³ U/L青-链霉素，1 mmol/L谷氨酰胺，7.5 g/L葡萄糖，制成大鼠脑切片。

实验选择5 Hz/16 s低频刺激作为阈值性刺激及100 Hz/s高频刺激诱导海马CA1区长时程增强的形成，并通过神经信号放大器记录场电位。

1.5 NR2A和NR2B亚基海马表达量与低频刺激诱导长时程增强的关系关于长时程增强的诱导机制目前已经基本阐明，普遍认为高频刺激引起突触后膜产生持续的去极化，去极化达到一定程度导致常态下阻断N-甲基-D-天门冬氨酸型受体通道的Mg²⁺移开，N-甲基-D-天门冬氨酸型受体与突触前膜释放的谷氨酸递质结合而被激活^[13-15]，导致大量Ca²⁺内流，继而触发了一系列与Ca²⁺有关的生理生化反应，激活第二信使系统，改变膜的性质，触发了长时程增强的产生^[16]。为了探讨N-甲基-D-天门冬氨酸型受体对慢性脑缺血神经突触可塑性的调节机制，实验通过构建慢性脑缺血大鼠实验动物模型，分别于脑缺血后0，4和12 h通过膜片钳放大器记录场电位记录法测定低频(单冲脉，强度0.4 mA，波宽0.06 ms，刺激频率为1 Hz)和高频诱导(单冲脉，强度0.4 mA，波宽0.06 ms，刺激频率为300 Hz)的长时程增强。

1.6 NR2A和NR2B亚基海马表达量与高频刺激诱导长时程增强的关系为了探讨N-甲基-D-天门冬氨酸型受体对慢性脑缺血神经突触可塑性的调节机制，通过构建慢性脑缺血大鼠实验动物模型，分别于脑缺血后4 h和12 h通过场电位记录法测定高频刺激诱导的长时程增强。

1.7 主要观察指标大鼠海马中NR2A和NR2B的表达水平。

1.8 统计学分析数据采用SPSS 18.0统计软件进行统计学分析。数据以x(_)±s表示，组间比较使用t 检验，P < 0.05为差异有显著性意义。

讨论

1973年，Loftis等^[18]首次从实验层面上提出了突触可塑性证据，他们利用高频率、短暂的电脉冲刺激家兔海马前穿质通路发现神经元兴奋性突触，发现神经电位增大并可持续几小时甚至几周，因此，这一现象称为长时程增强，然而，虽然越来越多的研究证实长时程增强和长时程抑制诱发需要N-甲基-D-天门冬氨酸型受体的激活^[19-21]，但是，N-甲基-D-天门冬氨酸型受体与长时程增强和长时程抑制的诱发，甚至突触可塑性的调节究竟存在什么样的调节机制还需要进一步研究。作者通过构建慢性脑缺血大鼠实验动物模型，根据Gogas等^[22]研究结果分别选取0，4 和12 h研究探讨了N-甲基-D-天门冬氨酸型受体亚基NR2A和NR2B表达量与长时程增强诱发之间的关系^[23]。结果显示在给予阈值低频刺激(5 Hz/16 s)的条件下，在脑缺血后4 h，NR2A并没有显著降低，而NR2B却显著增高的条件下，并不能诱发长时程增强的形成，而于脑缺血后12 h，NR2A表达水平显著降低，NR2B没有显著变化的条件下，给予5 Hz/16 s阈值性低频刺激后，也并没有诱导长时程增强的形成^[24]。随后，实验给予100 Hz/s的强刺激后，在脑缺血4 h后，NR2A海马表达水平无显著性降低，而NR2B的表达水平却显著增高的条件下，长时程增强形成表现为抑制；而在脑缺血后12 h，NR2B海马表达水平无显著性降低，而NR2A表达水平显著降低的情况下，长时程增强依然没有诱导形成。上述结果提示NR2B亚基在长时程增强诱发过程中存在负向的抑制作用，且在NR2A亚基表达量的降低条件下，低频刺激也没有诱发长时程增强形成，且高频刺激也未能诱发长时程增强的形成，提示NR2A可能对长时程增强的诱导形成具有促进的作用；然而，在NR2B表达水平显著增高的时候，长时程增强诱导形成依然显示抑制，因此，NR2A亚基在长时程增强的诱导行程中可能起正向的促进作用，而NR2B可能起负向的抑制作用。

本实验结果和Massey等^[25-29]研究结果是一致的，而Abe等^[28]的研究体现了N-甲基-D-天门冬氨酸型受体两个亚基在神经突触可塑性调节中的作用。N-甲基-D-天冬氨酸受体是中枢神经系统最主要的兴奋性氨基酸受体之一^[30-32]，属于配基和电压双门控的Ca²⁺和Na⁺-K⁺通道，由NR1、NR2、NR3和/或NR4 亚单位组成异四聚体^[24]，并以NR1/NR2A和NR1/NR2B作为主要的构成形式^[32-34]。其中，作为功能性亚单位的NR2B不仅在兴奋性突触传递和神经元兴奋毒性等方面起重要作用，决定NR通道的导电性和动力学特性，以及对药物的敏感性^[28]，还存在于神经干细胞上，影响中枢神经发生^[35-40]。神经干细胞通过不对称细胞分裂方式产生子代干细胞、神经细胞和各种胶质细胞^[41]。脑室下区作为哺乳动物脑内重要的神经发生区之一，成年仍存在神经发生现象^[42]。免疫电镜研究发现，脑室下区存在神经干细胞(单纤毛的星形胶质样细胞)、成神经细胞、成熟的星形胶质细胞(多纤毛)和室管膜细胞等^[43-46]。以上细胞表达有多种神经递质受体和神经营养因子构成了影响干细胞自我更新、激活和分化的微环境^[47-49]。Darios等^[50]证实了发生于脑室下区的成神经细胞在向嗅球迁移的过程中需要NR的参与，同时，基因敲除功能性NR可降低脑室下区神经发生的功能。脑室下区神经发生在幼年时期最为活跃，并随着年龄增长逐渐降低^[50-55]，然而，慢性脑缺血大鼠海马区NR的表达却鲜见报道。

实验通过研究N-甲基-D-天门冬氨酸型受体表达量和神经突触可塑性的关系揭示了在大鼠慢性脑缺血条件下N-甲基-D-天门冬氨酸型受体NR2的两个亚基NR2A和NR2B在神经突触可塑性调解中的作用。中国组织工程研究杂志出版内容重点：肾移植；肝移植；移植；心脏移植；组织移植；皮肤移植；皮瓣移植；血管移植；器官移植；组织工程

慢性脑缺血模型大鼠神经突触可塑性与N-甲基-D-天门冬氨酸型受体

The regulating effect of N-methyl-D-aspartate receptor on neural synaptic plasticity in a rat model of chronic cerebral ischemia

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