聚乙烯醇/羟基磷灰石复合水凝胶修复膝关节软骨缺损的组织相容性

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2015.30.015

摘要/Abstract

摘要：

背景：将羟基磷灰石与聚乙烯醇水凝胶复合之后应用于软骨缺损修复中，可在软骨连接部位产生良好的生物活性，有效促进骨细胞的生长，提高植入材料的稳定性和生物活性。
目的：观察聚乙烯醇/羟基磷灰石复合水凝胶修复兔膝关节软骨缺损的组织相容性。
方法：取20只新西兰大白兔，随机分为空白对照组(n=6)与实验组(n=14)，构建单侧膝关节软骨缺损模型，空白对照组不予以修复，实验组予以聚乙烯醇/羟基磷灰石复合水凝胶修复。术后4，8，12周获取膝关节标本进行大体观察及组织学观察。
结果与结论：空白对照组关节软骨面在术后12周内始终未得到修复，软骨下缺损存在肉芽组织充填现象，组织学也未见明显修复。实验组术后4周可见聚乙烯醇/羟基磷灰石复合水凝胶填充于缺损处，与周围软骨组织之间连接紧密，且存在清晰的界限，未出现细胞长入情况；至12周时，聚乙烯醇/羟基磷灰石复合水凝胶呈白色、半透明状，表面平坦，与周围软骨组织之间存在清晰界限，两者交界面存在软骨细胞大量增殖现象，与周围组织发生紧密结合，二者之间无间隙，底部与软骨下骨紧密连接，并存在骨样组织长入。表明聚乙烯醇羟基磷灰石复合水凝胶修复兔膝关节软骨缺损具有良好的组织相容性。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

关键词: 生物材料, 软骨生物材料, 聚乙烯醇, 羟基磷灰石, 膝关节, 软骨缺损, 移植修复, 动物模型, 组织相容性

Abstract:

BACKGROUND: Hydroxyapatite and polyvinyl alcohol composite hydrogel used for the repair of cartilage defects can have good biological activity in the cartilage joints, effectively promote the growth of bone cells, and enhance the stability and biological activity of implant materials.
OBJECTIVE: To explore the histocompatibility of polyvinyl alcohol/hydroxyapatite composite hydrogel transplantation for the repair of articular cartilage defects.
METHODS: Twenty New Zealand rabbits were enrolled and randomly divided into control group (n=6) and experimental group (n=14). Unilateral knee cartilage defect models were constructed in the two groups. No treatment was done in the control group, and polyvinyl alcohol/hydroxyapatite composite hydrogel transplantation was performed in the experimental group. After 4, 8, 12 weeks, the animals were killed to collect knee joint specimens for gross observation and histological observation.
RESULTS AND CONCLUSION: The surface of articular cartilage in the control group was not recovered at 12 weeks after operation, and granulation tissues were full of cartilage defects. In the experimental group, the
polyvinyl alcohol/hydroxyapatite composite hydrogel was filled in the defects, and tightly connected with the surrounding cartilage tissues with clear boundary and no cell ingrowth at 4 weeks after operation. Until the 12th week, in the experimental group, the composite hydrogel was white and translucent with smooth surface. There was a clear boundary between the composite hydrogel and surrounding cartilage tissues, a great amount of cartilage cells proliferated in the interface that tightly bound to the surrounding tissues, and osteoid tissue grew. These findings indicate that the polyvinyl alcohol/hydroxyapatite composite hydrogel has good histocompatibility in the repair of cartilage defects of rabbit knee joints.

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

Key words: Durapatite, Cartilage, Articular, Histocompatibility

中图分类号:

R318

雷智坚. 聚乙烯醇/羟基磷灰石复合水凝胶修复膝关节软骨缺损的组织相容性[J]. 中国组织工程研究, 2015, 19(30): 4832-4836.

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图/表（结果） 1

2.1 实验动物数量分析入组的20只兔全部存活，未出现关节感染等情况。实验过程中所有动物均按照时间进行分批处死并获得标本。 2.2 大体观察结果术后2组动物膝关节均处于正常活动状态，观察标本未出现骨赘形成及软骨磨损等。 空白对照组：关节软骨面在术后12周的观察期内始终未得到修复，软骨下缺损存在肉芽组织充填现象，软骨大体观察评分为8.5分。 实验组：术后4周，可见聚乙烯醇/羟基磷灰石复合水凝胶填充于缺损处，与周围软骨组织之间连接紧密，且存在清晰的界限，表面存在轻微的不光整现象，未出现正常软骨磨损，软骨大体评分为4.5分；术后8周，聚乙烯醇/羟基磷灰石复合水凝胶呈白色，表面平坦，与周围软骨组织之间存在清晰的界限，周围软骨表面光滑，未出现磨损现象，软骨大体评分为3.8分；术后12周，聚乙烯醇/羟基磷灰石复合水凝胶呈白色、半透明状，表面平坦，与周围软骨组织之间存在清晰的界限，软骨大体评分为2.5分。 2.3 组织形态学观察结果 实验组：术后4周，可见聚乙烯醇/羟基磷灰石复合水凝胶填充在缺损处，边界清楚，其内未出现细胞长入情况，周围软骨细胞未出现明显增殖现象，聚乙烯醇/羟基磷灰石复合水凝胶底部与软骨下骨发生连接，连接部无间隙，但存在清晰的边界(图1A)；术后8周，聚乙烯醇/羟基磷灰石复合水凝胶与周围软骨组织之间依然存在清晰的界限，软骨交界处存在大量的细胞增生，且呈不规则排列(图1B)；术后12周，聚乙烯醇/羟基磷灰石复合水凝胶与周围软骨交界面存在软骨细胞大量增殖现象，且呈蜂巢样不规则排列，聚乙烯醇/羟基磷灰石复合水凝胶与周围组织发生紧密结合，二者之间无间隙，聚乙烯醇/羟基磷灰石复合水凝胶底部与软骨下骨紧密连接，并存在骨样组织长入(图1C)。 空白对照组：在12周的观察期内未完成修复。术后4周，可见关节软骨缺损边缘呈现出内向生长现象，缺损边缘变钝，宽度变小，在底部存在纤维增生，但数量较少；术后8，12周，未出现明显改变，无法完成修复(图1D)。

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引言

人体关节长骨末端覆盖着一层薄薄的透明软骨组织，起着润滑、缓冲震荡等作用^[1]。膝关节软骨是一种透明的关节软组织，在膝关节润滑、减震和承重中有重要作用。关节软骨退行性改变及关节软骨缺损性疾病发病率非常高^[2-5]。人体内软骨组织缺乏血管和神经，又缺乏再生能力，目前的各种治疗手段均无法再生出透明软骨组织^[6]，许多治疗手段只能延缓关节软骨退化的速度，最终只能进行关节置换手术^[7]。由于关节假体均有使用寿命，许多患者一生中需要进行多次关节置换手术^[8]。随着临床组织工程学技术的不断发展，各种新型的软骨替代材料被积极地应用膝关节软骨缺损的治疗之中^[9]。其中，聚乙烯醇水凝胶是一种理想的材料，具有较高的弹性及良好的组织相容性^[10]。但是，由于聚乙烯醇水凝胶无生物活性，与骨基底的结合性能差，这种软骨假体的固定和连接一直未得到很好的解决，因此，单纯予以聚乙烯醇水凝胶进行软骨缺损修复无法获得满意的效果^[11]。为此，需要积极的采取有效方式对其进行改性。羟基磷灰石具有良好的生物活性，是天然骨中矿化基质的重要成分^[12]。将羟基磷灰石与聚乙烯醇复合应用于软骨缺损修复之中，可以在软骨连接部位产生良好的生物活性，对骨细胞的生长产生有效促进作用，有效提高植入材料的稳定性和生物活性^[13]。但关于聚乙烯醇/羟基磷灰石复合水凝胶修复膝关节软骨缺损的组织相容性相关问题，目前尚缺乏详细的报道。为此，本次实验通过构建膝关节软骨缺损动物模型，探讨聚乙烯醇/羟基磷灰石复合水凝胶移植修复兔膝关节软骨缺损的组织相容性，为临床治疗提供一定的参考依据。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

材料方法

设计：动物观察实验。

时间及地点：于2014年3至7月在南宁市中医医院骨二科完成。

材料：①聚乙烯醇：由惠州华阳医疗器械有限公司提供，产品以聚氧化乙烯和聚乙烯醇为原料制成，该材料无细胞毒性和热源反应等，具有良好的生物相容性。②羟基磷灰石：由四川大学生物材料工程研究中心提供，产品为白色粉末，难溶于水，易溶于酸，该材料无细胞毒性和热源反应等，具有良好的生物相容性。

实验动物：新西兰大白兔18只，雌雄各半，由青岛中创生物科技有限公司提供，健康状况良好，体质量 2.0-3.0 kg。将18只兔随机分2组，其中空白对照组6只，实验组12只。本次研究相关内容和方法均经本院伦理部门审核并批准，实验设计方案、使用动物品种品系规格、处死动物的方法、项目进行中涉及动物福利和伦理问题等均符合要求。

复合水凝胶修复兔膝关节软骨缺损实验的试剂和仪器：
试剂和仪器	来源
戊巴比妥钠	湖北兴恒化工有限公司
光学显微镜	上海蔡康光学仪器厂
中性甲醛	南京森贝伽生物科技有限公司
乙醇	上海诚凛生物科技有限公司
苏木精-伊红染色液	北京索莱宝科技有限公司
冷冻箱	北京福意联医疗设备有限公司
环锯	上海艾研生物科技有限公司

实验方法：

材料制备：利用冷冻-熔融成型法制备聚乙烯醇水凝胶，将适量聚乙烯醇装于盛有定量水的烧杯中，置于 95 ℃条件下进行2 h的水浴中加热，至聚乙烯醇完全溶解达到澄清均匀状态之后倒入模具中，并置于-28 ℃冷冻箱中进行6 h的冷冻。冷冻结束取出，置于室温条件下进行6 h的自然解冻。重复以上操作数次，最终得到聚乙烯醇水凝胶。然后利用溶胶凝胶法制备聚乙烯醇/羟基磷灰石复合水凝胶，在氮气保护条件下，制备Ca(OC₂H₅)₂溶液，并将其倒入质量分数15%的聚乙烯醇溶液中，充分混合均匀之后，滴入一定Ca/P比配置的H₃PO₄/无水乙醇溶液之中，置于 90 ℃条件下进行8 h的反应。反应结束后将溶液浇注于模具中，并进行冷冻-熔融成型，获得聚乙烯醇/羟基磷灰石复合水凝胶，气体消毒后保存备用。

兔膝关节软骨缺损模型的构建：利用戊巴比妥钠对实验动物进行静脉麻醉，常规消毒之后，于无菌条件下任选动物一侧膝关节做切口，暴露股骨内外髁关节面后，利用环锯构建关节软骨缺损模型，深度约4 mm，深达软骨下骨，空白对照组不进行任何处理，常规缝合切口；实验组于动物软骨缺损处植入圆柱形聚乙烯醇/羟基磷灰石复合水凝胶，并进行妥善嵌压固定。

术后处理：术后对动物进行单笼关养和常规饲喂，术肢均不进行固定，并予以常规抗感染处理。

主要观察指标：术后 4，8，12周，实验组分别处死4只动物，空白对照组每个时间点1只，获得膝关节标本进行大体观察和评分；苏木精-伊红染色后，置于光学显微镜下进行组织学观察。

讨论

关节腔是一个缺血缺氧的环境，所以一旦损伤，关节软骨很难自身修复^[14-15]。目前临床采用的药物和保健品只起到缓解的作用，实际效果并不明显；全关节置换治疗恢复慢、风险高且寿命有限。用自体软骨修复需要两次手术，组织结构的耐受力又十分有限，也容易造成其他部位的损伤。传统的治疗方法只能短期减轻疼痛而疗效有限，更换人工关节是较为常见的终末期治疗手段，但手术风险高、创伤大，出血及并发症多，且人工材料会伴随植入时间损耗^[16]。膝关节软骨是一种透明的关节软组织，在膝关节润滑、减震和承重中有重要作用^[17-18]。膝软骨受损后，由于缺乏血液供应，其再生能力很弱^[19-21]。目前治疗关节软骨缺损的主要方法均有明显缺陷，比如关节清理仅能暂时缓解疼痛症状，不能阻止病程发展；关节融合会使关节功能严重丧失；人工关节置换则价格昂贵^[22-23]。跟人体的其他部位不同，软骨组织没有神经，一旦受伤或者磨损后，不会有疼痛的感觉，所以容易被忽视，但关节表面的小伤口如果没有得到及时治疗，将会随着关节的运动而越来越严重，不仅不会愈合，而且还会越变越大，到最后只有通过关节置换解决问题^[24]。随着临床医学水平的不断提高，各种软骨替代材料开始被积极应用于软骨缺损的治疗之中^[25-26]。其中，聚乙烯醇水凝胶是一种理想的材料，具有较高的弹性及良好的组织相容性，弹性模量与人关节软骨相近，有效提高了水凝胶的机械力学性能。另外，聚乙烯醇水凝胶为内含大量水分的多微孔可渗透材料，在载荷作用下，液体可以渗入和挤出，从材料中挤出的液体，起到类似活体关节中液膜润滑的作用，可作为一种理想的软骨假体植入材料^[27-29]。但单纯予以聚乙烯醇水凝胶进行软骨缺损修复，受到材料表面性质等因素的影响，往往无法获得满意的效果^[30-32]。因聚乙烯醇水凝胶表面光滑，无生物活性，软骨假体与骨基底的结合性能差，影响了软骨的固定和修复功能。而且，聚乙烯醇水凝胶的生物力学性能，如润滑性、黏弹性等有待进一步提高。为此，需要积极的采取有效方式对其进行改性。羟基磷灰石具有良好的生物活性，是天然骨中矿化基质的重要成分^[33-35]。该材料具备骨诱导性，可诱导周边骨组织直接长入材料内形成生物连接，将其与聚乙烯醇进行复合之后修复各种软骨缺损，可以在软骨连接部位产生良好的生物活性，有效促进骨细胞的生长，有效提高植入材料的稳定性和生物活性^[36-38]。潘育松^[39]采用原位合成和冷冻-解冻相结合的方法制备了纳米羟基磷灰石增强聚乙烯醇凝胶复合材料，通过实验发现，该材料具有与自然关节软骨相似的结构、力学与摩擦学性能，是一种很有应用前景的关节软骨修复材料。
为了保证最终的修复效果，需要对复合材料的组织相容性进行研究^[40]。本次实验结果显示，入组的18只动物均全部存活，未出现关节感染等情况。术后2组动物膝关节均处于正常活动状态，观察标本未出现骨赘形成及软骨磨损等。实验组术后不同时间的关节软骨面修复效果均优于空白对照组，经组织学观察可以发现，实验组术后4周可见聚乙烯醇/羟基磷灰石复合水凝胶填充在缺损处，边界清楚，其内未出现细胞长入情况；术后12周观察，聚乙烯醇/羟基磷灰石复合水凝胶与周围软骨交界面存在软骨细胞大量增殖的现象，与周围组织发生紧密的结合，二者之间无间隙，底部与软骨下骨紧密连接，并存在骨样组织长入，即提示聚乙烯醇羟基磷灰石复合水凝胶是一种安全的修复材料，可以有效解决聚乙烯醇水凝胶与软骨下骨结合不佳等问题，获得理想的修复效果。但受到入组样本数量及观察时间等因素的影响，本次实验所得到的相关结果及相应的结论可能存在一定的片面性和不准确。因此，本研究还存在一定的不足之处，还需要在今后的研究中予以进一步完善和分析。总之，新型人工关节软骨替代材料用于软骨损伤的修复目前仍主要处于实验阶段，在真正应用于临床之前还需要进行更多的体外及体内试验，对其在生理条件下的机械力学性能及长期植入体内的全身与局部生物安全性还需进一步的研究。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程