乙醇性脂肪肝模型大鼠早期生长反应因子1表达及水飞蓟素的干预

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2015.27.016

摘要/Abstract

摘要：

背景：促炎性转录因子以及炎性因子在乙醇性肝病的发生中起着重要作用，而早期生长反应因子1正是炎症启动的关键因子之一。
目的：观察并分析水飞蓟素对乙醇性脂肪肝模型大鼠早期生长反应因子1的影响。
方法：将大鼠采用高脂饮食联合乙醇灌胃方式建立脂肪肝动物模型，每次灌胃后分别给予水飞蓟素高、低剂量(200，100 mg/kg)干预，并设正常组进行对照，共灌胃8周。
结果与结论：血清学指标检测和苏木精-伊红染色结果显示，与模型组相比，水飞蓟素高剂量组大鼠体质量增高(P < 0.05)，血清谷草转氨酶、谷丙转氨酶活性、肝组织早期生长反应因子1和肿瘤坏死因子α的表达降低(P < 0.05)，病理分级结果均占优(P < 0.01)。结果证实，高剂量水飞蓟素能有效保护大鼠肝功能，减少肝功能损害的发生，可能与水飞蓟素抑制大鼠体内早期生长反应因子1，从而减少肿瘤坏死因子α的形成有关，但具体机制尚待进一步研究。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：肾移植；肝移植；移植；心脏移植；组织移植；皮肤移植；皮瓣移植；血管移植；器官移植；组织工程

关键词: 实验动物, 消化系统损伤动物模型, 水飞蓟素, 乙醇性脂肪肝, 早期生长反应因子1, 肝功能, 谷丙转氨酶, 谷草转氨酶, 肿瘤坏死因子α, 苏木精-伊红染色, 模型, 机制

Abstract:

BACKGROUND: Proinflammatory transcription factors and inflammatory factors play an important role in the occurrence of alcoholic liver disease. However, early growth response factor 1 is one of the key factors of starting inflammation.
OBJECTIVE: To investigate and analyze the effects of silymarin on early growth response factor1 in rat models of alcoholic fatty liver.
METHODS: The rat models were established using the methods of feeding with high fat diet and intragastrically administering alcohol, in total 8 weeks. Silymarin intervention at high and low doses (200,100 mg/kg) was given after each gavage. The normal group was set as comparison.
RESULTS AND CONCLUSION: Serological indicator detection and hematoxylin-eosin staining results showed that compared with the model group, the body weight of rats was increased (P < 0.05); serum aspartate aminotransferase, alanine aminotransferase activity, early growth response factor 1 and tumor necrosis factor-α expression in the liver tissue were decreased (P < 0.05); pathological grading results were superior in the high-dose silymarin group to in the other groups (P < 0.01). The results confirm that high dose of silymarin can protect the liver function of rats, reduce the occurrence of liver function damage, which may be associated with the inhibition on the early growth response factor 1 in the body of rats, thereby reducing the tumor necrosis factor-α formation, but the specific mechanism remains to be further studied.

中国组织工程研究杂志出版内容重点：肾移植；肝移植；移植；心脏移植；组织移植；皮肤移植；皮瓣移植；血管移植；器官移植；组织工程

中图分类号:

R318

周红星. 乙醇性脂肪肝模型大鼠早期生长反应因子1表达及水飞蓟素的干预[J]. 中国组织工程研究, 2015, 19(27): 4351-4355.

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图/表（结果） 7

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引言

乙醇性肝病是指长期饮酒引起的肝脏病变，早期常为脂肪肝，若继续发展可演变为肝纤维化、肝硬化等。乙醇性肝病早期可无明显临床症状，主要为恶心呕吐、肝大黄疸，晚期则会引起各种并发症，比如最常见的消化道大出血。不仅给患者健康造成巨大威胁，而且增加患者经济负担^[1-2]。据黄陂区人民医院多年的临床统计，近年来，因为长期饮酒导致的肝脏疾病的患者越来越多，并且在所有肝脏疾病中所占比例也越来越大，因此，对于乙醇性肝病的研究也逐渐开展。肝脏是乙醇的主要代谢器官，长期大量乙醇的摄入可导致乙醇性脂肪肝乙醇性肝炎和乙醇性肝硬化的发生。在这一系列的过程中，促炎性转录因子及炎性因子对乙醇性脂肪肝的发生发展起着关键作用。慢性乙醇的摄入可激活Kupffer细胞，而Kupffer细胞又是肝脏炎症和细胞因子产生的主要细胞，Kupffer细胞与内毒素或者肠道内的细菌产生的脂多糖相互作用，激活核转录因子kB，早期生长反应因子1等转录因子，产生一系列的细胞因子和炎症递质如肿瘤坏死因子α等，这些细胞因子和炎症递质被认为是早期肝脏损害的关键因素^[3-7]。
早期生长反应因子1其编码的蛋白质有3个重复的锌指结构域，属锌指蛋白家族成员早期生长反应因子1是一个广泛表达的转录因子，可对细胞生长增殖分化及凋亡进行调节[8-9]。早期生长反应因子1可调节多种炎性细胞因子的表达，如肿瘤坏死因子等，肿瘤坏死因子基因启动子内含有早期生长反应因子1结合位点，通过调节这一结合位点来调控肿瘤坏死因子的表达^[10-13]。另有研究发现，在给予野生型和早期生长反应因子1基因敲除大鼠乙醇喂养6周后，发现早期生长反应因子1有助于增加脂多糖介导的肿瘤坏死因子α的表达，而缺少早期生长反应因子1时，可以阻碍乙醇性脂肪肝的形成^[13-17]。乙醇中毒后，早期生长反应因子1可以通过调节肿瘤坏死因子α等炎症因子发挥作用。
近年来，研究发现促炎性因子以及炎性因子在乙醇性脂肪肝的发生发展中起着关键作用，而在肝脏中主要的炎症因子产生于Kupffer细胞。
目前认为，Kupffer细胞能与人体内的毒素以及肠道内细菌产生的脂多糖相互作用，进而激活早期生长反应因子1等转录因子以及一系列的细胞因子和炎症递质如肿瘤坏死因子α等，这些细胞因子和炎症递质被认为是早期肝脏损害的致病因素^[18-19]。早期生长反应因子1是一个广泛表达的转录因子，人体内许多生理反应(包括炎症反应、应激、损伤等)都可以引起早期生长反应因子1的表达。有研究表明，促炎性转录因子以及炎性因子在乙醇性肝病的发生中起着重要作用，而早期生长反应因子1正是炎症启动的关键因子之一。有学者发现在乙醇性脂肪肝患者肝组织中早期生长反应因子1较正常肝组织高，这可能与肿瘤坏死因子α的形成有关[20]。
因此，实验观察并分析水飞蓟素对乙醇性脂肪肝模型大鼠早期生长反应因子1的影响。

材料方法

1.1 造模动物及材料 SD雌性大鼠80只，鼠龄70-85 d，平均(76.4±8.3) d，体质量(200±20) g。购自湖南斯莱克景达实验动物有限公司，动物许可证号：SCXK(湘)2009-0004。

乙醇性脂肪肝模型大鼠构建实验相关试剂及仪器：
试剂及仪器	来源
水飞蓟素	浙江康乐药业股份有限公司
水合氯醛	湘雅制药有限公司
SABC法免疫组织化学试剂盒	武汉博士德生物有限公司
乙醇	湖南化学试剂厂
NikonEclipse 8ic显微镜	日本Nikon公司
血液用全自动生化分析仪	迈瑞生物医疗电子股份有限公司

1.2 造模方法实验于2013年1月至2014年1月在黄陂区人民医院实验室完成。将80只大鼠随机分为正常组、模型组、水飞蓟素低、高剂量组，每组20只大鼠。
对各组大鼠每日测体质量，所有大鼠正常喂养，模型组大鼠采用高脂饮食联合乙醇灌胃8周以建立脂肪肝模型，具体喂养方法：所有大鼠按照先前饮食正常喂养1周，随后给予混合型饲料喂养(1%胆固醇+84%基础饲料+ 10%玉米油+5%猪油)。从第1周开始，模型组、水飞蓟素组分别采用体积分数40%乙醇灌胃，2次/d，剂量为6 g/(kg•d)，两次中间间隔时间为8 h，正常对照组给予等体积的生理盐水灌胃。以后每周黄陂区人民医院根据具体情况对乙醇量进行调整，第2周时，黄陂区人民医院将乙醇浓度和剂量调整为体积分数50%乙醇7 g/(kg•d)，第3、4周调整为体积分数50%乙醇8 g/(kg•d)，第5-8周调整为体积分数50%乙醇8 g/(kg•d)，以上灌胃时间间隔不变。水飞蓟素高、低剂量组在每天早上灌胃后2 h给予水飞蓟素200，100 mg/kg灌胃^[10]。
水飞蓟素高、低剂量组在模型组基础上，每次灌胃后分别给予水飞蓟素(浙江康乐药业股份有限公司，国药准字h33022700)200，100 mg/kg。8周后禁食不禁水12 h后，给予体积分数10%水合氯醛3 mL/kg麻醉，于腹主动脉取血。取血后夹闭大鼠肝脏周围动脉，立即取出大鼠肝脏，称质量后取肝左叶用甲醛固定，同时，在肝右叶对称部位取相同大小肝脏组织放入液氮中备用。
1.3 造模成功的检测标准取血后即刻进行检测，使用高速冷冻离心机于4 ℃下离心(3 000 r/min)5 min后取上层血清。通过日立-7110型全自动生化析仪对谷丙转氨酶、谷草转氨酶水平进行检测。
取血后立刻取出大鼠肝组织，经体积分数10%甲醛固定，由梯度脱水机进行脱水后浸蜡、包埋，用石蜡切片机做4 μm连续切片，然后脱蜡到水透明，用苏木精进行染色15 min，后使用自来水冲洗3 min，1%盐酸乙醇进行分化30 s，待切片变红，用自来水进行冲洗3 min，体积分数1%氨水进行反蓝30 s，再冲洗1 min，伊红进行染色30 s，随后乙醇梯度脱水，二甲苯透明，用甘油明胶进行封固。并依据下列标准进行肝脏脂肪变性的程度分级，于光学显微镜下观察，以脂肪病变细胞占全部肝细胞比例表示肝脏脂肪的变性程度[17]：0级，肝细胞没有脂肪变；1级；脂肪变性肝细胞比例<25%；2级：25%<脂肪变性肝细胞比例<50%；3级：50%<脂肪变性肝细胞比例<75%；4级：脂肪变性肝细胞比例>75%。
使用保存于液氮的肝组织于第2日进行检测。用免疫组织化学法测定早期生长反应因子1，肿瘤坏死因子α的表达状态。用SABC法免疫组织化学试剂盒(武汉博士德生物有限公司)检测肝组织早期生长反应因子1，肿瘤坏死因子α的表达，简述如下：石蜡切片后二甲苯脱蜡、梯度乙醇水化、蒸馏水冲洗，再用体积分数3%过氧化氢去除内源性过氧化物酶，经0.01 mol/L枸橼酸盐缓冲液微波修复抗原，加羊血清封闭液，滴加稀释的一抗(早期生长反应因子1抗体1∶400稀释，肿瘤坏死因子α抗体1∶300稀释，阴性对照以PBS缓冲盐液代替一抗)，滴加生物素化二抗工作液，加辣根酶标记链霉卵白素工作液，DAB显色，苏木精复染，中性树胶封固，光学显微镜下观察，细胞内有明显黄色/棕黄色颗粒时判定为阳性细胞。在Nikon显微镜下，每张切片随机选取4个不连续视野(×400)保存，使用Image-Pro Plus医学图像分析软件测量各个图像吸光度值，取平均值作为早期生长反应因子1，肿瘤坏死因子α相对表达量。
1.4 主要观察指标测量并记录所有大鼠血清谷丙转氨酶、谷草转氨酶的活性、早期生长反应因子1，肿瘤坏死因子α等指标以及苏木精-伊红染色观察肝脏病理学变化。定期观察大鼠精神状态、食欲和毛发光泽度等情况。
1.5 统计学分析采用SPSS 13.0统计软件处理，计量资料结果以x±s表示，等级资料(病理分级)采用Ridit分析；计量资料采用单因素的方差分析，组间数据两两比较采用LSD法检验，以P < 0.05为差异有显著性意义。

讨论

肝脏是重要的代谢转化器官，人体摄入的乙醇大部分经过肝脏代谢，长期过量饮酒将会导致肝细胞功能衰竭甚至死亡。近年来，研究发现促炎性因子以及炎性因子在乙醇性脂肪肝的发生发展中起着关键作用，而在肝脏中主要的炎症因子产生于Kupffer细胞[^28-29]。目前认为，Kupffer细胞能与人体内的毒素以及肠道内细菌产生的脂多糖相互作用，进而激活早期生长反应因子1等转录因子以及一系列的细胞因子和炎症递质如肿瘤坏死因子α等，这些细胞因子和炎症递质被认为是早期肝脏损害的致病因素。早期生长反应因子1是一个广泛表达的转录因子，人体内许多生理反应(包括炎症反应、应激和损伤等)都可以引起早期生长反应因子1的表达。有研究表明，乙醇性脂肪肝患者肝组织中早期生长反应因子1明显高于正常肝组织，早期生长反应因子1可能在乙醇性肝病的发生发展中起着重要作用[30]。
实验通过对大鼠进行造模，同时应用水飞蓟素干预研究发现，模型组大鼠体质量明显低于正常组，而肝指数明显高于正常组；水飞蓟素高剂量组大鼠体质量明显高于模型组。此外对各组大鼠的肝功能进行比较发现，模型组大鼠谷丙转氨酶和谷草转氨酶均明显高于正常组；而水飞蓟素高剂量组大鼠谷丙转氨酶和谷草转氨酶均明显低于模型组。因此提示，高剂量水飞蓟素能有效改善肝功能，降低大鼠转氨酶和肝指数，增加大鼠体质量。对各组大鼠病理学组织变化研究表明，高剂量水飞蓟素能有效改善大鼠肝功能，防止或者减缓高脂以及高浓度乙醇下肝功能的病变。实验还考察了各组大鼠肿瘤坏死因子α的表达情况，由于肿瘤坏死因子α会因乙醇的摄入而大量释放，从而加重炎症，使肝脏受损严重，研究结果表明，正常组肿瘤坏死因子α的表达程度显著低于造模组大鼠，其趋势与早期生长反应因子1相一致，提示早期生长反应因子1与乙醇性脂肪肝的发生有着密切关系，并且高剂量水飞蓟素能有效降低早期生长反应因子1的产生。
综上所述，高剂量水飞蓟素能有效保护大鼠肝功能，减少肝功能损害的发生，可能与水飞蓟素抑制大鼠体内早期生长反应因子1，从而减少肿瘤坏死因子α的形成有关，但具体机制尚待进一步研究。