卒中后抑郁模型大鼠与miR-137抑制下的Grin2A表达

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2015.24.012

摘要/Abstract

摘要：

背景：卒中后抑郁是脑血管病后最常见的心理行为障碍并发症，其发病机制目前尚未明确。目前研究表明，microRNA与神经发生和突触形成有关，可能在精神疾病中扮演至关重要的作用。
目的：分析卒中后抑郁大鼠模型脑内和外周血中的miR-137的表达以及其对模型行为学的影响。
方法：将36只大鼠分为6组，每组各6只。对照组不做任何处理，卒中后抑郁组大鼠经大脑中动脉阻塞后慢性温和刺激建立卒中后抑郁模型，agomir-137组、agomir-NC组、agomir-137+Grin2A组和agomir-137+vector组大鼠在建立卒中后抑郁模型的基础上分别给予脑室内注射agomir-137、agomir-NC、agomir-137和Grin2A过表达质粒以及agomir-137和空白质粒。
结果与结论：实时定量PCR检测显示卒中后抑郁模型大鼠脑内和外周血中miR-137表达水平均明显低于对照组正常大鼠。行为学结果显示，在脑缺血第3周，agomir-137组大鼠垂直得分以及水平得分均显著高于agomir- NC组大鼠以及卒中后抑郁组大鼠。糖水消耗实验结果显示，在脑缺血后第2周末起，agomir-137组大鼠糖水消耗百分比即显著高于agomir-NC组大鼠以及卒中后抑郁组大鼠。进一步研究发现，miR-137可以与Grin2A的3’UTR端结合，抑制Grin2A mRNA的翻译从而下调其蛋白的表达。并且在卒中后抑郁大鼠模型的脑内过表达Grin2A基因后，miR-137抗卒中后抑郁的作用被显著减弱。提示miR-137可通过与Grin2A mRNA结合抑制其蛋白表达，从而发挥抗卒中后抑郁的作用，为卒中后抑郁提供新的临床治疗靶点。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

关键词: 组织构建, 组织工程, 抑郁, 卒中, 微小RNA, 大鼠, 神经元, 突触, 门冬氨酸受体, 质粒

Abstract:

BACKGROUND: Poststroke depression is one of the most common psychological behavior disorders after stroke and its mechanism remains unclear. Studies have suggested that microRNAs (miRNAs) involved in neurogenesis and synaptogenesis may play an important role in psychology diseases.
OBJECTIVE: To observe the expression of miR-137 in the blood and brain of poststroke depression rats and its effect on the behaviors of rats.
METHODS: Thirty-six rats were equally divided into six groups: control, model, agomir-137, agomir-NC, agomir-137 + Grin2A and agomir-137+vector groups. Control group had no treatment. Poststroke depression models were established by ligation of middle cerebral artery and chronic mild stimulation in the latter four groups followed by receiving an injection of nothing, agomir-137, agomir-NC, LV-CMV-Grin2A or control plasmids into the left lateral ventricle, respectively.
RESULTS AND CONCLUSION: We found significantly lower miR-137 levels in the brain and peripheral blood of post-stroke depression rats compared with normal rats. Vertical scores and horizontal scores on the behavior test were significantly higher in the agomir-137 group than the agomir-NC and model groups at 3 weeks after cerebral ischemia; while, sucrose consumption percentage was also higher in the agomir-137 group at the end of 2 weeks
after cerebral ischemia. Luciferase assays showed miR-137 bound to the 3’ UTR of Grin2A, regulating Grin2A expression in a neuronal cell line. Grin2A gene overexpression in the brain of post-stroke depression rats noticeably suppressed the inhibitory effect of miR-137 on post-stroke depression. Overall, these findings show that miR-137 suppresses Grin2A protein expression through binding to Grin2A mRNA, thereby exerting an inhibitory effect on post-stroke depression and offering a new therapeutic target for poststroke depression.

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

中图分类号:

R318

杨晓煜，史齐，褚秀峰，张清琴，张敏，郑胜哲，姬颖华，路平. 卒中后抑郁模型大鼠与miR-137抑制下的Grin2A表达[J]. 中国组织工程研究, 2015, 19(24): 3832-3838.

Yang Xiao-yu, Shi Qi, Chu Xiu-feng, Zhang Qing-qin, Zhang Min, Zheng Sheng-zhe, Ji Ying-hua,Lu Ping. Grin2A expression under inhibition of miR-17 in poststroke depression rats [J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2015, 19(24): 3832-3838.

图/表（结果） 3

2.1 实验动物数量分析共使用36只大鼠，所有大鼠均进入实验，无脱落。实验流程见图1。
2.2 卒中后抑郁大鼠脑内miR-137水平下调卒中后抑郁大鼠模型制造成功后(第18天)，取正常大鼠和卒中后抑郁大鼠处死取脑以及外周血液，实时定量PCR检测发现，卒中后抑郁大鼠脑内和外周血中miR-137表达水平均明显低于正常大鼠(P < 0.05；图2)，表明miR-137可能参与卒中后抑郁的病理生理过程。

2.3 miR-137改善卒中后抑郁大鼠行为学变化为了检测上调脑内miR-137表达水平对卒中后抑郁大鼠行为学的影响，实验将miR-137的激动剂agomir-137和其阴性对照agomir-NC经脑室注射入卒中后抑郁大鼠脑内，旷野实验结果显示，在脑缺血第3周，经脑室注射agomir-137的卒中后抑郁大鼠垂直得分以及水平得分均显著高于agomir-NC组以及卒中后抑郁组(P < 0.05；图3A)。糖水消耗实验结果显示，在脑缺血后第2周末起，agomir-137组大鼠糖水消耗百分比即显著高于agomir-NC组以及卒中后抑郁组(P < 0.05；图3B)。

2.4 miR-137通过与Grin2A mRNA 3’UTR端结合下调其蛋白表达通过数据库检索发现Grin2A基因的3’UTR端包含一个7 mer大小的序列与miR-137相匹配，如图4A。结果显示Grin2A-3’UTR-wt组荧光强度明显低于其阴性对照组(miR-con)(P < 0.05)，而Grin2A-3’UTR-mut组或空质粒组荧光强度与其阴性对照差异无显著性意义(P > 0.05)，如图4B。此结果表明，miR-137可以通过与Grin2A mRNA 3’UTR端结合而调节其翻译。并且将miR-137 mimic及其阴性对照(mimic-NC)、miR-137 inhibitor及其阴性对照(inhibitor-NC)转染至PC12细胞中，Western blot检测Grin2A水平。结果发现miR-137 mimic可显著降低PC12细胞中Grin2A水平(P < 0.05)，而miR-137 inhibitor可显著升高PC12细胞中Grin2A水平(P < 0.05；图4C)，表明miR-137可以通过与Grin2A mRNA 3’UTR端结合而调节其蛋白表达水平。
2.5 过表达Grin2A阻断miR-137对卒中后抑郁大鼠行为学的改善作用为确定Grin2A是否参与miR-137对卒中后抑郁大鼠行为学的改善作用，实验将含Grin2A基因的表达质粒经脑室注入卒中后抑郁大鼠脑内，结果发现， agomir-137+Grin2A组的大鼠垂直得分以及水平得分均明显低于其阴性对照(agomir-137+vector)和agomir-137组 (P < 0.05；图5A)。并且agomir-137+Grin2A组糖水消耗百分比明显低于其阴性对照和agomir-137组(P < 0.05；图5 B)。表明Grin2A参与了miR-137对卒中后抑郁大鼠的治疗作用。

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引言

卒中后抑郁是脑卒中后最常见的心理行为障碍并发症，在卒中患者中的发病率为25%-79%^[1]。卒中后抑郁主要表现为脑卒中后的情绪低落和兴趣减退，延缓神经功能的恢复，增加死亡率，极大降低了卒中患者的生活质量^[2-4]。虽然卒中是卒中后抑郁的直接原因，但其引起卒中后抑郁的具体机制尚未完全清楚，给治疗带来极大的困难。
MicroRNA(miRNA)是一类长18-25个碱基的非编码单链小RNA分子，可以与mRNA分子的3’UTR(3’-untranslated regions)上序列互补结合而调节目标基因的蛋白表达水平^[5-6]。目前，共有约1 400余种的人类miRNA被鉴定出并被认为参与了多种病理生理过程，如肿瘤的形成和转移、细胞分化、炎症以及胚胎发育^[7-8]。最新研究表明，miRNA还可能与抑郁症相关。Smalheiser等^[9]对18例因抑郁自杀患者的脑组织检测发现，相比于正常人脑组织共有包括miR-137在内的21种miRNA表达下调。通过对比抑郁症患者治疗前后血清的miRNA谱，Bocchio-Chiavetto等发现口服抗抑郁药物可使28种血清miRNA水平增高^[10]。Baudry等^[11]发现，选择性5-羟色胺再摄取抑制剂类抗抑郁药物可以使miR-16水平升高，从而下调miR-16的靶基因5-羟色胺转运体的表达，发挥抗抑郁作用。这些证据表明了miRNA可能在抑郁症的发生、发展中扮演着重要的角色，可以作为抑郁症临床治疗的潜在靶点^[12-13]。
作为抑郁症中的特殊一种，卒中后抑郁的发病是否也与miRNA相关呢?近期，Tan等^[14-16]对脑卒中患者外周血检测发现，有多种miRNA在急性期出现上调或下降，随后在鼠类缺血模型中的研究证实了脑内也出现了相应的miRNA变化。令人感兴趣的是，在脑缺血后下调的miRNA和抑郁症患者下调的miRNA有着部分的重叠，但这些重叠的miRNA在卒中后抑郁的发生发展中发挥的作用尚无人研究。因此，作者选取miR-137为对象，研究其对卒中后抑郁大鼠模型行为学的影响。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

材料方法

设计：分子生物学随机对照实验。
时间及地点：实验于2012年4至9月在山东大学病理实验室完成。
材料：
动物：分子生物学随机对照清洁级健康雄性SD大鼠36只，鼠龄8-10周，体质量280-340 g，由山东大学动物实验中心提供，动物许可证号：SCXK(鲁)2003-0002。在室温(21±2) ℃、相对湿度30%-35%、人工12 h昼/夜循环照明环境中用全价营养饲料分笼饲养，自由摄食及饮水。各组间暴露因素无差异。实验符合动物伦理学要求。
细胞与质粒：HEK-293细胞(Invitrogen，Carlsbad，CA，USA)培养于含体积分数10% 胎牛血清(Thermo， Waltham，USA)的RPMI 1640培养基中(Gibco，California，USA)，置于37 ℃下含体积分数5%CO2的培养箱中。Agomir-137、Agomir-NC和miR-137 mimic、miR-137 inhibitor均购自于广州锐博生物科技有限公司。lentiviral-CMV-Grin2A质粒和lentiviral-CMV-control质粒由上海吉凯基因化学技术有限公司代为合成。
方法：
实验动物分组：为研究miR-137对卒中后抑郁大鼠的影响，共24只大鼠入组：6只大鼠不作任何处理(对照组)，6只大鼠经大脑中动脉阻塞+慢性温和刺激制作卒中后抑郁模型(卒中后抑郁组)，6只大鼠经大脑中动脉阻塞+脑室注射agomir-137+慢性温和刺激(agomir-137组)，6只大鼠经大脑中动脉阻塞+脑室注射agomir-NC+慢性温和刺激(agomir-NC组)。
为检测Grin2A是否参与miR-137抗卒中后抑郁作用，12只大鼠被添加入组：6只大鼠经大脑中动脉阻塞+脑室注射AAV9-CMV-Grin2A质粒和agomir-137+慢性温和刺激(agomir-137+Grin2A组)，6只大鼠经大脑中动脉阻塞+脑室注射空质粒和agomir-137+慢性温和刺激(agomir-137+ vector组)。
脑室注射慢病毒质粒：脑室注射方法参考Nishida等[17]的方法。体积分数75%乙醇消毒表皮后沿中线切开2.5 cm长矢状切口，暴露颅骨。在颅骨上标出入针点坐标(前囟前0.3 mm，腹侧3.6 mm，左侧1.1 mm)，然后在标记点处钻孔。钻孔后小针刺穿硬脑膜，将套管置入入点，经钻孔缓慢进入。进入左侧侧脑室后，经微型注射泵向agomir-137组左脑室中注射10 nmol agomir-137，agomir-NC组注射入10 nmol agomir-NC，向agomir-137+Grin2A组注射入LV-CMV-Grin2A质粒(10 µL，108 TU/mL)和10 nmol agomir-137，向agomir-137+vector注射入LV-CMV- control质粒(10 µL，108 TU/mL)和10 nmol agomir-137。缝合头部皮肤，将大鼠由立体定向仪(瑞沃德，深圳，中国)移下，放入可控湿度和温度的孵育箱中，37 ℃下60 min。之后将手术后大鼠置入22 ℃恒温环境下单独笼子中，自由摄水摄食。
卒中后抑郁模型大鼠的建立：所有大鼠在脑室注射慢病毒质粒48 h后，采用大脑中动脉阻塞法制作脑缺血再灌注模型[18]，其过程如下：大鼠经氯胺酮(100 g/L，100 mg/kg)，甲苯噻嗪(20 g/L，2.5 mg/kg)和乙酰丙嗪(2.5 g/L，2.5 mg/kg) (济南万兴达化工有限公司)皮下注射麻醉后, 仰卧位固定于手术板上。颈部皮肤消毒后作正中切口，依次分离左侧颈总、颈外及颈内动脉。在颈总动脉和颈外动脉，眼科剪于颈总动脉近端剪一小口，插入直径0.26mm钝头鱼线，经颈内动脉到达大脑中动脉起始部。阻断左侧大脑中动脉血流2 h后，拔除鱼线，结扎颈外动脉，缝合切口。大鼠复苏后在20-25 ℃饲养，自由摄水摄食。
在脑缺血再灌注模型建立后2 d，选取Longa评分≥1并< 4的大鼠^[19]。参考Willner等[20]的方法进行慢性温和刺激建立卒中后抑郁模型，其过程如下：对所有大鼠予以夹尾 (1 min)、禁水(24 h)、禁食(24 h)、高温环境(45 ℃，5 min)、冰水游泳(4 ℃，5 min)、昼夜颠倒(24 h)和水平摇晃 (160次/min，30 min)共7种方法刺激，1周内每天采用1种刺激，共重复3周，即在诱导过程中每种刺激共执行3次，期间所有大鼠孤养。
大鼠行为学检测：
旷野试验：参考Wang等[21]的方法制作敞箱，在安静的情况下将大鼠放入箱内，观察记录大鼠穿越的方格数作为水平活动得分(以大鼠四爪均进入方格为准)，以大鼠直立次数为垂直活动得分(两前肢离地1次为准)。每只大鼠测定3次，每次3 min。
蔗糖水消耗试验：禁水禁食20 h后，所有大鼠同时给予1瓶1%浓度的蔗糖水和1瓶清水，计算1 h内大鼠蔗糖水的消耗量(%)=蔗糖水消耗量/(蔗糖水消耗量+清水消耗量)×100%。
实时定量PCR检测miR-137表达：按Duan等[22]的方法进行PCR测定卒中后抑郁大鼠脑内和外周血中的miR-137的表达，步骤如下：总RNA通过Trizol(美国Sigma-Aldrich公司)提取后，使用EasyScript First-Strand cDNA Synthesis SuperMix(北京全式金公司)进行cDNA合成。 2.5 μL合成的cDNA、1 μL特异性引物(广州锐博生物科技有限公司)加入TransStartTM SYBR Green qPCR Supermix (北京全式金公司)后进行实时定量PCR测定miR-137水平，PCR仪(美国ABI公司)检测PCR产物SYBR绿色荧光强度，以小RNA分子U6为内参定量产物浓度。
Luciferase assay检测miR-137对报告质粒荧光表达的影响：通过Targetscan(http://www.targetscan.org/)和miRBase(www.mirbase.org)两个数据库寻找miR-137的作用靶点。并将含有miR-137结合位点的大鼠Grin2A 3’UTR全长经PCR扩增后克隆入pMIR-REPORT miRNA expression reporter vector(Ambion公司)的下游Hind Ⅱ和Sac Ⅰ 位点之间，命名为Grin2A-3’UTR-wt。Grin2A- 3’UTR-wt经Easy Mutagenesis System kit (北京TransGen Biotech公司)进行点突变后，命名为Grin2A-3’UTR-mut。取HEK 293T细胞种入24孔板中，分为3组：对照组加入400 ng的空质粒(empty vector)；野生型组加入400 ng Grin2A-3’UTR-wt质粒；突变组加入400 ng Grin2A-3’UTR- mut质粒。每组中在lip2000(美国Invitrogen公司)存在下加入miR-137和20 ng pRL-TK作为内参，另外每组均设立复孔加入mimic-NC替代miR-137 mimic作为阴性对照(miR-con)。转染36 h后，收集细胞经荧光报告检测系统(美国Promega公司)检测荧光强度。
Western blot检测miR-137对Grin2A表达的影响：PC12细胞种于24孔板，分为：对照组，常规培养；miR-137转染组，加入miR-137 mimic；mimic阴性对照组，加入miR-137 mimic的阴性对照；miR-137 inhibitor转染组，加入miR-137 inhibitor；inhibitor阴性对照组加入miR-137 inhibitor的阴性对照。转染48 h后收集PC12细胞，离心后加入裂解液裂解30 min，收集蛋白后采取BCA法测定蛋白浓度。每个样品经10% SDS-PAGE(武汉博士徳公司)不连续凝胶电泳，湿法电转膜后加5%脱脂牛奶封闭2 h，TBST(武汉博士徳公司)洗脱6次(10 min/次)，加一抗兔抗大鼠Grin2A或GAPDH多克隆抗体IgG(1∶2 000，美国santa cruz公司)于4 ℃孵育过夜，次日TBST洗脱6次 (10 min/次)，再加入辣根过氧化物酶标记的二抗山羊抗兔多克隆抗体IgM(美国santa cruz公司)。室温孵育2 h后行ECL化学发光法显示电泳条带，内参选用GAPDH。
主要观察指标：大鼠行为及脑组织和外周血中miR-137的表达与转染细胞中Grin2A和报告质粒荧光表达的变化。
统计学分析：使用SPSS 17.0 for windows软件(SPSS Inc，Chicago，IL，USA)进行数据处理。所有数据均用x±s表示，组间比较采用t 检验，检验水准α=0.05。

讨论

最新研究表明，miR-137与神经精神疾病关系密切。Geekiyanage等^[23]通过实时定量PCR检测发现，阿尔茨海默症患者脑组织以及血清中miR-137水平较正常人脑明显降低，且其表达与丝氨酸棕榈酰转移酶及β淀粉样蛋白水平呈反比，因此认为miR-137可能具有通过调节丝氨酸棕榈酰转移酶抗阿尔茨海默症的作用。体外研究中发现，miR-137在分化过程中的神经祖细胞中高表达，并可通过抑制组蛋白赖氨酸特定脱甲基酶1等蛋白表达而促进神经细胞成熟与分化^[24]。基因组学研究结果发现，miR-137突变可引起精神分裂症和情感障碍，因此认为miR-137可能与维持正常情绪功能有关^[25]。进一步研究发现miR-137的这种功能可能是通过下调某些精神分裂症相关基因如CSMD1、C10orf26、CACNA1C和TCF4实现的^[26]。本实验发现miR-137水平在卒中后抑郁大鼠模型的脑内以及外周血中明显下调，表明miR-137可能与卒中后抑郁发病机理有关。值得注意的是，无论是脑卒中还是抑郁患者其体内均发现miR-137水平的下调^[9，15]，结合本实验结果，提示miR-137可能是卒中与抑郁之间的桥梁和纽带。
为了验证miR-137对卒中后抑郁的作用，作者建立了大鼠卒中后抑郁模型，并将miR-137的激动剂agomir-137经脑室注射入卒中后抑郁大鼠脑内。结果发现miR-137水平上升后可明显提高卒中后抑郁大鼠的旷野实验得分以及对糖水的消耗量，说明miR-137的确具有抗卒中后抑郁的作用。但miR-137抗卒中后抑郁的分子生物学基础是什么呢？为了解决这个问题，实验通过Targetscan和miRBase两个数据库寻找miR-137的潜在作用靶点，结果发现Grin2A mRNA 3’ UTR段具有一个7 mer长度的序列可以与miR-137结合，提示Grin2A可能是miR-137发挥作用的下游靶基因。
Grin2A蛋白是门冬氨酸受体的重要组成部分，广泛分布于中枢神经系统，被认为在记忆、情绪和学习等行为中扮演重要角色^[27-29]。门冬氨酸受体是离子型谷氨酸受体的一个亚型，由2个Grin1和2个Grin2(Grin2A和Grin2B)亚基共同组成^[30]。研究表明，门冬氨酸受体与抑郁发病机理有关。抑郁症患者脑内门冬氨酸受体结合能力明显高于正常人，而在动物模型中阻断门冬氨酸受体后可发挥明显的抗抑郁作用^[31-35]。
脑缺血后，由于应激大量谷氨酸生成，导致门冬氨酸受体过量激活并通过级联反应触发下丘脑-垂体-肾上腺异常兴奋，从而参与卒中后抑郁的发生^[36]。临床研究发现，门冬氨酸受体拮抗剂可用于治疗抑郁症以及卒中后抑郁[^37-44]。但是，由于肌肉松弛、共济失调、学习和记忆损伤等严重并发症的出现，普通的抗门冬氨酸受体药物的临床应用受到了极大地制约。因此，选择性作用其亚基如Grin2A或Grin2B的门冬氨酸受体拮抗剂受到了研究者的广泛关注。本实验的luciferase assay结果显示，转染miR-137 mimic后，含野生型Grin2A的3’-UTR段的荧光报告质粒的荧光表达强度明显降低，而含突变miR-137结合位点的荧光报告质粒的荧光表达强度则不受影响，并且Western blot结果证实，过表达miR-137时PC12细胞中Grin2A蛋白水平下降，而抑制miR-137时其蛋白水平则上升，说明miR-137的确可以通过结合Grin2A的3’-UTR段抑制其mRNA的翻译。本实验结果表明miR-137可在转录后水平抑制Grin2A蛋白的合成，可能作为一种潜在的选择性门冬氨酸受体拮抗剂而用于治疗抑郁或卒中后抑郁等神经精神类疾病。
虽然Grin2A是miR-137的一个下游靶点，但其是否参与到miR-137的抗抑郁作用中还需要进一步证实。因此，作者通过脑室注射Grin2A质粒和agomir-137的方式使Grin2A和miR-137同时在卒中后抑郁大鼠模型的脑内过表达，以研究两者在卒中后抑郁发病机理中作用关系。结果发现，脑内Grin2A和miR-137同时过表达的大鼠垂直得分以及水平得分均明显低于其阴性对照(agomir-137+vector)和agomir-137组，说明过表达Grin2A可以阻断miR-137的抗抑郁作用，间接的证明了Grin2A是miR-137抗抑郁作用的一个重要的下游靶点。
综上所述，实验发现miR-137水平在卒中后抑郁大鼠模型的外周血和脑内明显下调，脑内过表达miR-137可明显改善卒中后抑郁大鼠的行为学变化，进一步研究发现miR-137的抗卒中后抑郁作用是通过在转录后水平抑制Grin2A表达实现的。本实验对卒中后抑郁的发病机制做出了新的补充，为卒中后抑郁提供了潜在的临床治疗靶点。

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