人肠三叶因子串联亲和层析表达载体的构建与表达

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2015.24.013

摘要/Abstract

摘要：

背景：人肠三叶因子为新型的生长因子，可促进细胞生长与迁移，并使细胞具有很强抗凋亡能力，在维持胃肠黏膜完整性、黏膜保护与损伤修复发挥着重要作用，与胃肠道等多个肿瘤的发生发展密切相关。人肠三叶因子(三叶因子3)在黏膜修复及作为肿瘤标志物有着广阔的临床应用前景，但其相互作用蛋白及具体分子机制不明确。
目的：构建和表达带串联StrepII和6×His两个蛋白标签的三叶因子3重组蛋白，以进一步利用研究体内蛋白质相互作用的串联亲和层析技术纯化获得三叶因子3相互作用蛋白。
方法：化学合成用于串联亲和层析的标签(StrepII-TEV-6×His)基因序列，并以三叶因子3表达载体为模板，PCR扩增三叶因子3基因序列，通过Xba I位点实现标签与三叶因子3基因序列的融合，并将标签置于三叶因子3蛋白的C端，融合基因通过EcoR I+Hind III酶切，克隆于表达载体pCDNA3.0，构建了三叶因子3串联亲和层析表达载体pTFF3-C-StH。表过载体通过脂质体瞬时转染胃癌细胞AGS，采用Western Blot检测重组蛋白的表达。
结果与结论：成功构建了三叶因子3串联亲和层析表达载体pTFF3-C-StH，经酶切和测序鉴定载体构建完全正确。表达载体成功转染胃癌细胞株，并获得重组蛋白的表达，通过Western Blot检测证明表达产物具有很好的抗原性和特异性，为串联亲和层析纯化三叶因子3相互作用蛋白提供重要的实验基础和工具。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

关键词: 组织构建, 组织工程, 串联亲和层析纯化, TFF3, StrepII 标签, 6×His标签

Abstract:

BACKGROUND: As a novel growth factor, human intestinal trefoil factor (TFF3) can promote cell growth and migration, and increase cell resistance to apoptosis, and it plays a great role in maintaining the mucosa integrity, mucosa protection and repairing the injured mucosa, also it has been closely related to the tumor growth and progression. With the function of mucosa repair, and as the tumor biomarker, TFF3 has a promising clinical application, but its definite interacting protein and molecular mechanism is still unclear.
OBJECTIVE: To construct and express the TFF3 recombinant protein with the tandem tag of StrepII-6×His in the target cells for further purifying its interaction protein in the native condition based on the tandem affinity purification technique.
METHODS: The DNA sequence for the tag (StrepII-TEV-6×His) and TFF3 as template was got by chemical
synthesis and PCR amplification respectively. They were fused by the restriction enzyme XbaI site, and the tag sequence was located at the C terminus of TFF3 protein. TFF3-tag fusion gene was cloned into the pCDNA3.0 using EcoRI+HindIII, thus the TFF3-tag expressing vector pTFF3-C-StH was constructed and transfected transiently into gastric cell AGS by lipofectin. The recombinant TFF3-tag protein was expressed and detected by western blot assay.
RESULTS AND CONCLUSION: The expressing vector pTFF3-C-StH for tandem affinity purification was constructed successfully, and was confirmed further by restriction enzyme analysis and sequenced. The recombinant TFF3-C-StH protein of TFF3-tag was expressed in the AGS cell, and showed specific antigenicity by western blot assay. Thus this work provides experimental base for further purification of the TFF3 interacting proteins.

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Key words: Vectors, Transfection, Recombinant Proteins

中图分类号:

R318

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图/表（结果） 5

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引言

人肠三叶因子即三叶因子3(trefoil factor 3，TFF3)，以下简称为TFF3，属三叶因子(trefoil factor family，TFF)家族成员之一，为富含半胱氨酸的小分子多肽。TFF3由59个氨基酸组成，相对分子质量约6 700，二级结构上，通过3个分子内二硫键折叠形成“三叶状”结构(Trefoil Domain)，这种“三叶状”结构非常稳定，使其具有很强的抗酸、抗蛋白酶水解及耐热等特性，能在胃肠道复杂的生理环境中保持生物活性^[1-2]。
TFF3为新型的生长因子，可促进细胞生长、迁移，并具有很强抗凋亡能力，在胃肠黏膜保护及损伤修复发挥着重要作用^[3-4]，可减轻肿瘤患者放化疗造成的肠黏膜炎性反应，加快黏膜的修复^[5]。TFF3还与肿瘤发生发展关系密切，可作为多个肿瘤的生物标志物，应用于肿瘤的诊断、治疗与预后评价等^[6-9]，但迄今为止，TFF3发挥功能作用的具体分子机制仍不明确^[10]。多数学者认为，TFF3是通过受体或结合蛋白发挥功能^[11-12]，但至今仍未找到确切的受体或结合蛋白，进而由受体介导的信号转导途径也不明确，因此寻找并确定TFF3受体或结合蛋白，对阐明其作用机制具有重要意义。
串联亲和层析(tandem affinity purification，TAP)是近年来发展的用于在生理条件下研究蛋白质相互作用的技术^[13]。该技术通过基因重组与表达融合有2个不同标签的靶蛋白，在接近生理状态下，经2次特异的亲和层析柱纯化，获得靶蛋白及其复合物。与传统的蛋白相互作用研究技术相比，其优点在于可以模拟体内生理条件，高效、特异地分离蛋白质复合物，且假阳性率低。串联亲和纯化已成功应用于细菌、哺乳动物细胞等研究，并鉴定出新的蛋白质相互作用^[14-16]。
本实验旨在构建TFF3串联亲和层析表达载体，为纯化和鉴定TFF3发挥生物学功能形成的蛋白质复合物，并为其受体或结合蛋白的研究奠定基础。

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材料方法

设计：分子、细胞水平体外观察。
时间及地点：实验于2014年3至9月在厦门大学附属中山医院医学中心实验室完成。
材料：胃上皮腺癌细胞株AGS购自中科院上海生命科学院细胞所。

TFF3载体构建实验用主要试剂及仪器：
试剂及仪器	来源
限制性内切酶(EcoR Ⅰ、Xba Ⅰ、Hind Ⅲ)、T₄DNA连接酶	Takara 公司，日本
F-12K培养液	Gibco公司，美国
ViaFect^TM Transfection Reagent	Promega公司，美国
Protease Inhibitor Cocktail	Sigma公司，美国
化学发光底物HRP Substrate	Millipore公司，美国
鼠抗人TFF3抗体	Abnova公司，台湾
鼠抗StrepII标签抗体	Genscript 公司，美国
鼠抗6×His标签抗体	北京天根
HRP标记兔抗鼠二抗	Genscript公司，美国
FluorChem HD2化学发光仪	Cell Biosciences公司，美国

实验方法：
串联亲和层析纯化标签设计与基因克隆：标签的结构设计为StrepII-TEV-His，氨基酸序列为：N-WSHPQFEKGGTGS ENLYFQGEGTGS HHHHHH-C (31aa)，N端含有一个由8个氨基酸(WSHPQFEK)构成的StrepII标签，中间含有一个烟草花叶病毒蛋白酶(Tobacco etch virus protease，TEV)识别序列ENLYFQG，C端含有一个由6个组氨酸构成的6×His标签。标签基因序列为：5’-TCT AGA TGG AGC CAT CCA CAG TTC GAG AAG GGC GGC ACC GGA AGC GAA AAT TTA TAT TTT CAG GGT GAG GGT ACC GGA AGC CAT CAT CAC CAT CAC CAT TGA AAG CTT-3’(正义链)，5’端引入XbaⅠ位点，3’端含有一个终止密码TGA及Hind Ⅲ位点。基因序列由上海生工合成，并克隆于载体pUC57，经XbaⅠ/HindⅢ双酶切，2%琼脂糖凝胶电泳鉴定，测序确认后命名为pStH。
TFF3基因亚克隆：以本室构建的TFF3表达载体pCMV-TFF3为模板[17]，设计扩增TFF3基因序列引物，上游引物引入Kozak序列GCCACC，下游引物引入Xba Ⅰ位点，上游引物：5’-GCC ACC ATG AAG CGA GTC CTG AGC TGC-3’，下游引物：5’-TCT AGA GAA GGT GCA TTC TGC TTC CTG C-3’。引物由上海生工合成。反应条件：94 ℃预变性5 min，94 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s，72 ℃    30 s，30个循环，最后72延伸10 min。扩增产物经1.2%琼脂糖凝胶电泳，胶回收纯化，连接于pUCm-T载体，转化大肠杆菌DH5α，蓝白斑筛选重组克隆，经EcoRⅠ/XbaⅠ双酶切鉴定，测序确认后命名为pTFF3。
TFF3串联亲和层析表达载体构建与纯化：XbaⅠ/HindⅢ双酶切pTFF3及pStH，胶回收目的片段，连接、转化DH5α，抗性筛选重组子，经EcoRⅠ/Hind Ⅲ双酶切鉴定，命名为pTFF3-SH。EcoRⅠ/ Hind Ⅲ双酶切pTFF3-SH及表达载体pcDNA3.0，胶回收目的片段，连接、转化DH5α，抗性筛选重组子，经EcoRⅠ/Hind Ⅲ双酶切鉴定，测序确认正确重组表达载体，命名为pTFF3-C-StH。过夜培养   10 mL含有pTFF3-C-StH质粒的DH5α，用无内毒素质粒提取试剂盒制备转染细胞的高纯度质粒DNA。
DNA瞬时转染：胃上皮腺癌细胞AGS贴壁培养于含体积分数10%胎牛血清、100 U/mL青霉素和100 U/mL链霉素的F-12K培养液中，培养条件为饱和湿度、37 ℃、体积分数5% CO2。待细胞布满培养皿后，0.25%胰酶消化、血球计数板计数，以1×105接种于6孔板，每孔培养液为2 mL，培养24 h后细胞生长至密度70%-80%，更换培养液为不含血清及抗生素的F-12K培养液。用ViaFectTM Transfection Reagent转染试剂进行DNA转染，取表达载体DNA 2 μg、转染试剂6 μL及F-12K培养液不含血清的制备200 μL转染复合物，室温放置20 mins后，加入培养细胞的6孔板(转染做3个复孔)，轻轻混合均匀，24 h后，更换为新鲜完全培养液，继续培养24 h。
蛋白免疫印迹分析：取转染培养细胞，去掉培养液，预冷PBS洗涤2次，置4 ℃冰浴，加入裂解液(30 mmol/L Tris-HCl，pH 7.4，150 nmol/L NaCl，0.5% Nonidet- P40， Protease Inhibitor Cocktail )5 min，用细胞刮收集细胞悬液后转移至1.5 mL离心管，超声破碎10次，每次1 s。于    4 ℃，12 000 r/min离心30 min，收集上清。BCA定量，取20 μg上样，进行SDS-PAGE，电转移至PVDF膜，TBST   (10 mmol/L Tris-HCl，150 mmol/L NaCl，0.1% Tween-20，pH 7.4)洗涤3次后，按蛋白分子量显示的位置，分别剪下膜条带，置于封闭液室温2 h。分别加入一抗(鼠抗TFF3单克隆体抗(1∶1 000)、鼠抗His单克隆抗体(1∶1 000)、鼠抗StrepII单克隆抗体(1∶1 000)、鼠抗β-actin 单克隆抗体(1∶500)，4 ℃孵育过夜，去掉一抗，TBST( 10 mmol/L Tris-HCl，150 mmol/L NaCl，0.1% Tween-20，pH 7.4)洗涤3次，分别加入HRP标记的兔抗鼠二抗(1∶500)，室温振荡孵育1 h，TBST洗涤3次，加化学发光底物溶液HRP Substrate，用化学发光仪进行ECL显影，拍照记录条带。
主要观察指标：①标签及TFF3 DNA序列。②融合标签的TFF3重组表达载体pTFF3-C-StH目的基因读码框序列。③TFF3重组蛋白的表达。

讨论

三叶因子家族是正常黏膜重要组成部分，在维持胃肠道黏膜完整性、促进胃肠黏膜修复等具重要作用。同时与肿瘤发生发展密切相关，特别是TFF3对肿瘤生长、侵袭、转移与血管生成具有促进作用。但具体分子机制目前仍不明确。已有的研究表明TFF是通过受体-配体相互作用的方式发挥功能，并有几个候选受体。TFF3可激活EGF受体信号传导途径，起到进细胞迁移，加快损伤黏膜的修复与重建的作用，并通过调节调节COX-2、EGF-R介导的信号途径，及MAPK、JNK等信号传导途径发挥影响细胞生长、增殖与迁移^[18]。最近研究发现，TFF3通过PI3K/Akt信号转导途径发挥肠道黏膜保护及通过Twist通路起到促进细胞迁移的作用^[19-20]。但TFF3直接相互作用的蛋白仍未确定，一直属于孤儿配体。
本实验创新结合串联亲和层技术，构建了TFF3串联亲和层析表达载体，通过转染获得在胃癌细胞中的表达，为在接近自然状态下研究TFF3相互作用蛋白奠定实验基础。串联亲和层技术采用的典型标签由金色葡萄球菌蛋白A的两个免疫球蛋白IgG结合区(IgG Binding Domain of Protein A)和钙调蛋白结合区(calmodulin binding peptide domain，CBP)构成，中间被一个烟草花叶病毒蛋白酶(TEV)切割位点隔开，但这标签相对分子质量相对较大，约21 000，较容易干扰到靶蛋白的功能，进而影响到相互作用蛋白的结合，造成假阳性或假阳性的出现^[21]。随后又发展多个特异性高、分子量小的标签包括6×His、Flag、StrepII、c-Myc、SBP等^[22-23]。
TFF3多肽仅含59氨基酸，大分子标签有可能影响其结构与功能，因此，本文采用StrepII 与6×His两个小分子标签的组合构建串联亲和层析表达载体。位于N端的StrepII标签为8个氨基酸(WSHPQFEK)的短肽，具有化学平衡的氨基酸组成，不干扰靶蛋白质的折叠和生物活性，可用抗生物素蛋白链菌素(streptavidin)的变异体Strep-Tactin进行生理条件下的亲和纯化，且一步纯化靶蛋白的纯度可达到99%。C端为6×His标签，分子质量小，不影响靶蛋白的结构，用于镍离子金属鳌合亲和层析纯化。标签中间含有TEV蛋白酶识别位点，当靶蛋白结合于镍离子金属鳌合层析住，用含TEV蛋白酶的缓冲液进行生理条件下的洗脱，可保持蛋白在纯化过程的活性与功能。
TFF3为分泌蛋白，由其前体经剪切去除N端信号肽后加工形成，因此本实验在构建串联亲和层析表达载体pTFF3-C-StH时，将标签序列融合在TFF3蛋白的C端，使表达的TFF3蛋白含有签序列。并在TFF3起始密码前加入Kozak序列GCCACC，以提高蛋白表达量。构建的表达载体，经脂质体转染试剂瞬时转染胃癌细胞株AGS，免疫印迹检测结果表明，TFF3-C-StH重组蛋白在转染的细胞中获得表达，表达产物具较好的抗原性和特异性。
鉴于TFF3独特的功能和作用，其作用机制研究倍受关注，本实验将为生理条件下分离与纯化TFF3结合蛋白或相互作用蛋白提供重要实验基础与材料，也为三叶因子家族其他成员相互作用蛋白的研究提供的思路和借鉴。

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