碳纤维-聚乳酸-聚乙二醇复合支架的制备及性能检测

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2015.21.017

摘要/Abstract

摘要：

背景：长期实验发现聚乳酸-聚乙二醇支架的力学性能及细胞相容性能较差，因此多数研究向支架中加入其他材料，以提高其生物活性及力学性能。
目的：制备改性碳纤维-聚乳酸-聚乙二醇支架，并检测其性能。
方法：采用溶液潘注/粒子沥滤法制备改性碳纤维-聚乳酸-聚乙二醇复合支架。对比改性碳纤维-聚乳酸-聚乙二醇复合支架与聚乳酸-聚乙二醇支架的超微结构、孔隙率、吸水性、降解率及力学性能。将改性碳纤维-聚乳酸-聚乙二醇复合支架与聚乳酸-聚乙二醇支架分别与SD大鼠成骨细胞共培养，12 h后采用沉淀法检测细胞黏附率；培养1，3，5，7，9 d后，采用 MTT 法检测细胞增殖。
结果与结论：聚乳酸-聚乙二醇支架材料表面孔结构分布均匀，孔径为(404.0±10.5) µm；改性碳纤维-聚乳酸-聚乙二醇支架碳纤维表面见大量纵向沟槽，表面孔结构分布均匀，孔径为(433.0±3.0) µm，两组支架孔径比较差异有显著性意义(P < 0.05)。改性碳纤维-聚乳酸-聚乙二醇支架的孔隙率、吸水性、弹性模量和抗压强度、降解率、细胞黏附率与增殖率均高于聚乳酸-聚乙二醇支架(P < 0.05)。表明改性碳纤维的加入改善了聚乳酸-聚乙二醇复合支架的力学性能及细胞相容性。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

关键词: 生物材料, 骨生物材料, 骨组织工程, 聚乳酸-聚乙二醇支架, 改性碳纤维-聚乳酸-聚乙二醇支架

Abstract:

BACKGROUND: The mechanical performance and cytocompatibility of polylactic acid-polyethylene glycol (PLA-PEG) scaffold is poor via long-term experiments; therefore, other materials are added to the scaffold in order to improve its biological activity and mechanical properties.
OBJECTIVE: To investigate the preparation process of carbon fiber (CF)-PLA-PEG scaffold, and to test its performance.
METHODS: Modified CF-PLA-PEG composite scaffolds were prepared using solution injection-particle leaching method. Ultra-structure, porosity, water-absorbing quality, degradation rate and mechanical properties of CF-PLA-PEG composite scaffolds and PLA-PEG scaffolds were compared. Rat osteoblasts were co-cultured with these two kinds of scaffolds in vitro, and the cell adhesion rate was detected by precipitation method after 12 hours. Cell counting was detected using MTT method to determine the cell proliferation at culture days 1, 3, 5, 7, 9.
RESULTS AND CONCLUSION: The surface structure of PLA-PEG distributed uniformly, and the aperture was
(404.0±10.5) µm. The carbon fiber surface of modified CF-PLA-PEG composite scaffolds had a lot of longitudinal grooves, the surface structure also distributed uniformly, and the aperture was (433.0±3.0) µm. Difference in scaffold aperture was of significance between the two groups (P < 0.05). The porosity, water-absorbing quality, elasticity modulus, compressive strength, degradation rate, cell adhesion rate and cell growth rate of CF-PLA-PEG were better than those of PLA-PEG (P < 0.05). These results show that the CF-PLA-PEG scaffolds have good mechanical property and cell compatibility.

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

Key words: Tissue Engineering, Polyethylene Glycols, Biomechanics

中图分类号:

R318

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图/表（结果） 4

2.1 支架的表面形貌聚乳酸-聚乙二醇支架孔表面结构分布均匀，孔与孔之间互相连通，孔径为(404.0±10.5) µm。改性碳纤维-聚乳酸-聚乙二醇支架碳纤维表面见大量纵向沟槽。孔表面结构分布均匀，孔与孔之间互相连通，孔径为(433.0±3.0) µm，两者孔径比较差异有显著性意义(P < 0.05)。
2.2 支架的孔隙率聚乳酸-聚乙二醇支架的孔隙率为(83.1±3.5)%，改性碳纤维-聚乳酸-聚乙二醇支架的孔隙率为(90.3±1.5)%，两组支架孔隙率比较差异有显著性意义 (P < 0.05)。
2.3 支架的吸水性聚乳酸-聚乙二醇支架的吸水性为(136.4±3.7)%，改性碳纤维-聚乳酸-聚乙二醇支架的吸水性为(164.5±3.2)%。两组支架吸水性比较差异有显著性意义(P < 0.01)。支架的亲水性与孔隙率呈正比。
2.4 支架的力学性能聚乳酸-聚乙二醇支架的弹性模量和抗压强度分别为(19.1±2.4) MPa和(0.8±0.1) MPa，改性碳纤维-聚乳酸-聚乙二醇支架的弹性模量和抗压强度分别为(27.1±2.7) MPa和(1.1±0.2) MPa，两组支架弹性模量和抗压强度比较差异有显著性意义(P < 0.05)，见图1。

2.5 支架的降解率聚乳酸-聚乙二醇支架初始质量为(0.23±0.02) g，30 d后最终质量为(0.22±0.01) g，降解率为4.3%；改性碳纤维-聚乳酸-聚乙二醇支架初始质量为(0.23±0.02) g，30 d后最终质量为(0.18±0.01) g，降解率为21.7%。两组支架降解率比较差异有显著性意义(P < 0.05)，见图2。

2.6 支架的细胞黏附率聚乳酸-聚乙二醇支架的细胞黏附率为(62.7±0.35)%，改性碳纤维-聚乳酸-聚乙二醇支架的黏附率为(70.9±1.2)%，两组支架黏附率比较差异有显著性意义(P < 0.01)，见图3。

2.7 支架表面的细胞增殖活性聚乳酸-聚乙二醇支架表面细胞在1，3，5，7，9 d的增殖率分别为0.25，0.28，0.34，0.42，0.47，改性碳纤维-聚乳酸-聚乙二醇支架表面细胞在1，3，5，7，9 d的增殖率分别为0.29，0.33，0.42，0.53，0.55，改性碳纤维-聚乳酸-聚乙二醇支架组第3，5，7，9天的细胞增殖率高于聚乳酸-聚乙二醇支架组(P < 0.05)，见图4。

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引言

人工骨组织工程学是近几十年来新发展的学科，主要研究热点就是制备出可任意塑形、生物相容性好的骨替代材料，其中聚乳酸-聚乙二醇共聚物是研究最多的材料之一，目前主要应用在药物载体、骨组织工程材料中^[1]。聚乳酸是FDA认可的一类生物材料，具有良好的弹性模量和热成型性，在骨和软骨组织的再生与修复中基本能满足作为细胞生长载体材料的要求，目前已被应用于多种组织工程领域^[2-3]。
田建宁等^[4]采用/糖球沥滤复合法制备出聚乳酸多孔支架材料，通过细胞毒性检测发现该孔支架无细胞毒性，具有良好的生物相容性。Li等^[5]将小鼠坐骨神经细胞在聚乳酸乙醇酸/明胶支架进行培养，细胞黏附性能良好。但单纯的聚乳酸机械性能差、力学强度较低，且其在降解过程中力学性能下降快，易引起体内炎症，所以需与其他材料复合使用。这可能是因为聚乳酸结构中含有大量的酯健，降低了聚乳酸的水溶性，因此在疏水的聚乳酸分子链中引入亲水的聚乙二醇链段，可极大地改善材料的亲水性^[6-7]。王淑红等^[8]将兔成骨细胞在聚乳酸-聚乙二醇支架上进行培养，发现聚乳酸-聚乙二醇支架上的细胞黏附个数比纯聚乳酸支架多。Vila等[9]在聚乳酸-聚乙二醇纳米粒通过小鼠鼻黏膜的实验中发现，具有高聚乙二醇涂层密度的复合纳米粒远较无涂层聚乳酸纳米粒及低聚乙二醇涂层密度的复合纳米粒更易通过鼻黏膜到达病灶部位。但在长期实验中发现聚乳酸-聚乙二醇的力学性能及细胞相容性较差，因此有研究加用其他材料以获得在体内更加稳定的复合材料^[10]。同时卢剑等^[11]通过细胞黏附实验、细胞染色实验及碱性磷酸酶实验发现，在聚乳酸-聚乙二醇共聚物表面接枝复合纤维材料可提高成骨细胞活性及其生物相容性。
碳纤维耐腐蚀、耐磨损，并有自身润滑能力，具有良好的力学性能和细胞相容性，常用来提高组织工程复合材料支架的力学性能，且经处理后的碳纤维表面亲水性更强，可为黏附在支架上面的细胞提供营养物质并排泄代谢物^[12]。临床研究也已报道将碳纤维植入人体代替损坏的韧带安全可靠、成功率高，而且能促进新的韧带形成和成长^[13-14]。
自应用碳纤维人工腱以来，又陆续对碳纤维人工材料进行了大量研究，认为碳纤维具有良好的组织相容性^[15-16]。用碳纤维增强聚乳酸共聚物复合材料，可显著提高复合材料的力学性能，满足骨折内固定材料所需的力学强度^[17]。徐文峰等^[18]用溶液共混法和冷冻干燥法制备了多孔碳纤维/聚乳酸/壳聚糖三元复合生物材料，通过扫描电子显微镜对其进行表征并评价其细胞相容性，结果发现此支架孔与孔间相互连通，具有较好的相容性，符合组织支架材料的基本要求。有研究将磷酸钙/聚乙烯醇及碳纤维和树脂的复合物植入兔骨缺损处，12周后缺损部位无不良反应，显示出良好的生物相容性^[19]。碳纤维可以聚乳酸羟基乙酸对成纤维细胞的黏附力，对细胞无任何毒副作用^[20]。将碳纤维增强型聚醚醚酮植入兔双侧骨皮质缺损中无免疫反应，具有良好的生物相容性及生物活性^[21]。因此本实验通过使用改性碳纤维做聚乳酸-聚乙二醇的增强材料，期待制备的新型改性碳纤维-聚乳酸-聚乙二醇能在力学等性能上得到改善，为复合材料的建立提供实验支持。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

材料方法

设计：对比观察实验。
时间及地点：于2013年3月至2014年3月在湖北医药学院附属太和医院生物科学研究所完成。
材料：聚乳酸-聚乙二醇共聚物、聚丙烯腈基碳纤维、对氨基苯甲酸、浓硝酸、醋酸、无水乙醇、四氢呋喃、二氯甲烷、纤维强伸度仪，均由湖北医药学院附属太和医院生物科学研究所提供。扫描电镜(日本电子株式会社JSM-5600LV型扫描电镜)。三思电子万能试验机(型号：10TWDW3100，长春科新试验仪器公司)。DMEM/F12培养基(Gbico公司)。
实验动物：新生1 d内的SD大鼠6只，由湖北医药学院动物实验中心提供。
实验方法：
改性碳纤维-聚乳酸-聚乙二醇复合材料的制备：将聚丙烯腈基碳纤维和对氨基苯甲酸按质量比1∶50混合，升温至70 ℃同时加入少量NaOH催化24 h，分别置于2%醋酸、蒸馏水、无水乙醇、四氢呋喃、PBS中，80 ℃烘干留用。釆用溶液绕注/粒子沥滤法制备聚乳酸-聚乙二醇支架的孔隙度为70%，取1.81 g聚乳酸-聚乙二醇溶于一定量的二氯甲烷，加入一定量的氯化钠，制备成均质浆料后注入模具，室温下避光烘干留用。将经过对氨基苯甲酸处理过的聚丙烯腈基碳纤维按2%质量比加入聚乳酸-聚乙二醇支架中，加入一定量的氯化钠，室温下避光烘干留用。
复合支架的电镜观察：在扫描电镜下观察聚乳酸-聚乙二醇支架和改性碳纤维-聚乳酸-聚乙二醇支架的表面形貌，随机测量5个完整边缘的孔径大小取平均值。
测定支架孔隙率：将聚乳酸-聚乙二醇支架、改性碳纤维-聚乳酸-聚乙二醇支架材料真空干燥后，于干燥器中烘至恒质量24 h，测定质量(m₁)，将两种支架完全浸入乙醇中，待乙醇充分填满孔隙后取出支架，清除表面乙醇，重新测量两种支架的质量(m₂)，计算孔隙率：孔隙率= (m₂-m₁)/m₁。
检测支架吸水性：方法同孔隙率测定，将聚乳酸-聚乙二醇支架、改性碳纤维-聚乳酸-聚乙二醇支架支架真空干燥后，于干燥器中烘至恒质量24 h，测定质量(m₁)，将两种支架完全浸入去离子水中，待去离子水充分填满孔隙后取出支架，清除表面去离子水，重新测量质量(m₂)，计算亲水率：亲水率=(m₂-m₁)/m₁。
检测支架力学性能：采用三思电子万能试验机测定聚乳酸-聚乙二醇支架和改性碳纤维-聚乳酸-聚乙二醇支架的弹性模量及抗压强度。
检测支架降解性：将聚乳酸-聚乙二醇支架、改性碳纤维-聚乳酸-聚乙二醇支架裁成同等大小，分别放入装有一定量PBS的聚酯瓶中，每周测试PBS的pH值，于30 d后测量支架放入前后的质量变化，计算降解率。
大鼠成骨细胞的分离培养：取新生1 d的SD大鼠处死并消毒后剪下头部，仔细清除非骨组织，将剩余的头盖骨碾压成泥状，分别用胰酶、胶原酶等消化，最后用成骨细胞培养液制出成骨细胞悬液。
细胞黏附率的测定：将0.5 mL第3代成骨细胞悬液按1×10⁹ L^-1的细胞浓度分别滴加于聚乳酸-聚乙二醇支架、改性碳纤维-聚乳酸-聚乙二醇支架材料上，在正常体温、体积分数5% CO₂条件下培养24 h，用钙绿黄素染色观察细胞在材料表面的黏附情况，细胞黏附率的测定采用间接计数法：黏附率(%)=(总细胞数-未黏附细胞数)/总细胞数× 100%。
MTT法检测细胞增殖：将聚乳酸-聚乙二醇支架、改性碳纤维-聚乳酸-聚乙二醇支架分别放入96孔板内与8×103第3代成骨细胞悬液复合培养，加入DMEM/F12培养液使每孔液体量相等，在正常体温、体积分数5%CO2条件下培养，每2 d换1次液，于细胞培养的第1，3，5，7，9天分别加入20 μL 5 g/L MTT，继续培养4 h后吸弃培养液，每孔加入150 μL DMSO，振荡使结晶物充分溶解，于酶标仪测 490 nm波长吸光度A值，计算增殖率∶细胞增殖率=(实验组A值-对照组A值)/对照组A值。
主要观察指标：聚乳酸-聚乙二醇支架和改性碳纤维-聚乳酸-聚乙二醇支架材料的大体形态及孔径、孔隙率、吸水性、弹性模量及抗压强度和降解率，以及成骨细胞在改性材料表面的黏附率及增殖情况。
统计学分析：采用SPSS 17.0统计软件进行统计学分析，计量数据用x±s表示，比较采用t 检验，多组数据比较采用单因素方差分析。

讨论

聚乳酸-聚乙二醇是一种人工合成的高分子-高分子聚合物，已在骨组织材料实验中大量使用^[22]，但为使得人工材料具有更佳的生物活性及力学强度，有研究通过多元复合材料来塑造功能更强的骨组织材料，其中聚乙二醇的三嵌段共聚物常常发挥作用。如宋显晶等^[23]研究了聚乙二醇-聚乳酸-聚谷氨酸三嵌段共聚物与人脐静脉内皮细胞的细胞相容性，发现与空白组比较，人脐静脉内皮细胞在聚乙二醇共聚物上生长良好，表明三段共聚物与人脐静脉内皮细胞具有良好的细胞相容性。刘斌等^[24]通过急性全身毒性试验、皮内刺激试验、溶血试验、细胞毒性试验、体内植入试验等证实了聚乙二醇-聚乳酸-聚谷氨酸共聚物无急性全身毒性，无溶血反应，初期植入有轻微炎症反应，12周后炎症反应基本消失，未见巨噬细胞聚集现象，也说明了聚乙二醇共聚物具有良好的生物相容性。以往研究认为碳纤维具有高强度、高模量、抗疲劳性能优良、耐热性好等优点，并具有一定的生物相容性，植入人体后与骨的兼容性良好，不过敏，不引起炎症及毒性反应等并能提高支架的力学性能^[25]。因此本实验通过溶液潘注/粒子沥滤法制备出改性碳纤维-聚乳酸-聚乙二醇支架三元复合生物材料，通过电子显微镜观察发现支架表面孔结构分布均匀，碳纤维在支架内部分布均匀，碳纤维表面见大量纵向沟槽。改性碳纤维-聚乳酸-聚乙二醇支架孔径较聚乳酸-聚乙二醇支架明显增大，随着孔径的增加，孔与孔之间互相连通程度越高，孔隙率明显增大，说明新骨的生成及长入越快，因此本实验制备的改性碳纤维-聚乳酸-聚乙二醇支架三元复合生物材料符合组织支架材料的基本要求。
目前力学性能对于支架也是重要因素之一，给予组织细胞生长提供固定的空间，而避免受外力挤压而影响支架内细胞的、分化^[26]。孔径越大、孔隙率越高，连通性越好，则细胞沿支架生长并成骨的可能性就越大，但也会导致材料的力学强度越低，影响早期植入骨缺损时支架的抗压能力^[27-28]。因此合适的孔径、孔隙率及力学强度能最大限度地维持细胞爬行能力。聚乳酸-聚乙二醇复合材料强度较低，尚不能满足大块骨段强度的要求^[29]，并有报道采用碳纤维增强聚乳酸共聚物复合材料，提高了复合材料的力学性能，满足骨折内固定材料所需的力学强度^[17]。孙蕊等^[30]利用热致相分离/粒子沥滤结合法制备了聚乳酸-聚乙二醇-聚乳酸共聚物复合支架，该支架抗压强度最高为1.23 MPa，对比发现，本实验中制备的改性碳纤维-聚乳酸-聚乙二醇支架的力学性能更好，更符合组织支架的基本要求。同时本实验发现改性碳纤维-聚乳酸-聚乙二醇支架在吸水性、弹性模量数据统计上均明显高于聚乳酸-聚乙二醇支架，对比Wang等^[31]制备的聚乙二醇-聚乳酸共聚物复合支架，发现增加改性碳纤维后支架的亲水性明显增加，考虑可能是由于改性碳纤维本身表面存在亲水性基团，另外改性碳纤维的纵向沟槽与周缘产生了机械和/或化学等互锁作用，极大增加了支架的牢固程度^[32]。
理想的骨组织材料是在骨组织形成早期起到骨支架作用，而到骨成型后期迅速降解^[33]。本实验中改性碳纤维-聚乳酸-聚乙二醇支架30 d的降解率约为21.7%，明显高于聚乳酸-聚乙二醇支架，同Chen等^[34]研究复合多孔支架降解结果相似。但本实验认为支架降解与支架所处的环境、受压程度及支架本身成分有着密切的关系，因此对于骨支架的降解程度应根据不同目的选择不同的材料，只有这样才能达到提高骨愈合的目的。
大量研究证实调控生物材料与细胞的黏附是生物材料应用的关键，也是组织修复及重建的基础，细胞的增殖直接和与之接触的材料表面生物特异性相关^[35-36]。同时骨组织工程技术中一个关键环节就是种子细胞的选取。其中成骨细胞来源较广，易取材，体外培养增殖能力强，植入机体内对周围环境的适应能力强。因此本实验选取成骨细胞在支架材料表面是否黏附及增殖来判断支架的组织相容性，只有当细胞在支架表面黏附成功了，才能在支架表面继续增殖分化并进行功能的表达^[37-38]。本实验发现改性碳纤维-聚乳酸-聚乙二醇支架在细胞黏附率和细胞增殖活性等数据统计上均明显高于聚乳酸-聚乙二醇支架，支架的组织相容性不仅仅存在空间相容，细胞黏附率及增殖活性才是组织相容性中最重要的指标^[39]，因为只有使得组织细胞黏附、增殖、分化、促进胶原骨基质分泌等才能尽快修复组织缺损。虽然聚乳酸-聚乙二醇支架有较好的亲水性，但据Miao等[40]研究认为支架亲水性总体与支架孔隙率呈正比，因此改性碳纤维表面本身含有较多亲水性基团，增大了支架的孔隙率，极大增加了支架内部的储水空间，由此也加大了支架内部与外部物质的交换空间，进而达到促进细胞增殖的目的。也有可能是因为用对氨基苯甲酸表面改性碳纤维后在碳纤维表明贴附了一层对氨基苯甲酸，促进了细胞的生长，因此改性碳纤维的加入有利于成骨细胞的增殖与黏附^[41]。
综上所述，改性碳纤维-聚乳酸-聚乙二醇复合支架材料具有良好的骨缺损修复潜能，但仍需进一步分析不同材料成型参数与组织修复性能的关系，以及探讨支架植入体内是否产生免疫作用或毒性。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程