构建双基因共表达腺病毒载体转染关节炎模型大鼠的意义

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2015.18.007

中国组织工程研究 ›› 2015, Vol. 19 ›› Issue (18): 2825-2830.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.2015.18.007

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构建双基因共表达腺病毒载体转染关节炎模型大鼠的意义

樊萍1，何岚1，郝志明1，蒲丹1，吕晓虹1，孙怡宁1，胡楠1，王研华1，丁小明2，李杨2，薛武军2

西安交通大学医学院第一附属医院，1风湿免疫科，2肾移植科，陕西省西安市 710061

收稿日期:2015-03-12 出版日期:2015-04-30 发布日期:2015-04-30
通讯作者: 薛武军，博士，主任医师，西安交通大学医学院第一附属医院肾移植科，陕西省西安市 710061
作者简介:樊萍，女，1982年生，河南省项城市人，汉族，2008年西安交通大学毕业，硕士，主治医师，主要从事类风湿关节炎发病机制的研究。
基金资助:
国家自然科学基金项目资助(81400677)；陕西省科学技术研究发展计划项目资助(2012K16-09-02)

Transfection of double gene co-expressing adenovirus vector into arthritis rats

Fan Ping1, He Lan1, Hao Zhi-ming1, Pu Dan1, Lv Xiao-hong1, Sun Yi-ning1, Hu Nan1, Wang Yan-hua1,Ding Xiao-ming2, Li Yang2, Xue Wu-jun2

1Department of Rheumatism, 2Department of Renal Transplantation, First Affiliated Hospital of Xi’an Jiaotong University Health Science Center, Xi’an 710061, Shaanxi Province, China

Received:2015-03-12 Online:2015-04-30 Published:2015-04-30
Contact: Xue Wu-jun, M.D., Chief physician, Department of Renal Transplantation, First Affiliated Hospital of Xi’an Jiaotong University Health Science Center, Xi’an 710061, Shaanxi Province, China
About author:Fan Ping, Master, Attending physician, Department of Rheumatism, First Affiliated Hospital of Xi’an Jiaotong University Health Science Center, Xi’an 710061, Shaanxi Province, China
Supported by:
the National Natural Science Foundation of China, No. 81400677; Science and Technology Research and Development Program of Shaanxi Province, No. 2012K16-09-02

摘要/Abstract

摘要：

背景：淋巴细胞异常激活以及核因子κB依赖非特异性的炎症反应是类风湿关节炎关节组织炎症损害的两个重要方面。共刺激信号CD40/CD40L是T细胞识别、活化中最重要的共刺激分子。IκBα有效的抑制核因子κB的途径，可以在中心环节上抑制炎症反应的产生，抑制炎症因子滑膜组织的损害。
目的：采用CD40LIg-IRES2-IκBα双基因表达的腺病毒载体转染到关节炎动物模型，探索双基因共表达腺病毒载体转染对免疫性关节炎的治疗效果。
方法：构建pAdCD40LIg-IRES2-IκBα双基因共表达腺病毒载体。采用含1 g/L Ⅱ型胶原蛋的完全弗氏佐剂皮下多点注射构建关节炎Wistar大鼠模型。将20只构建成功的关节炎大鼠模型分为未处理组和转染组，分别给予2组大鼠四肢末端关节腔注射生理盐水和pAdCD40LIg-IRES2-IκBα腺病毒载体。
结果与结论：转染14 d后，与未处理组相比，转染组大鼠关节炎评分、关节液中淋巴细胞CD40L表达水平、关节滑膜组织中核因子κB p65表达水平、关节液内白细胞介素2、白细胞介素6、肿瘤坏死因子α、间质金属蛋白酶3和间质金属蛋白酶9的水平降低。提示共表达CD40LIg和IκBα腺病毒载体局部转染可有效抑制关节炎大鼠关节炎症状，降低关节腔内炎性细胞因子及炎性分子在滑膜组织中的表达，取得良好的治疗效果。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：肾移植；肝移植；移植；心脏移植；组织移植；皮肤移植；皮瓣移植；血管移植；器官移植；组织工程

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关键词: 实验动物, 骨及关节损伤模型, 关节炎, 类风湿, CD40L, IκBα, 核因子κB, 共刺激信号, 炎症, 滑膜, 国家自然科学基金

Abstract:

BACKGROUND: Abnormal activation of lymphocytes and nuclear factor κB-dependent non-specific inflammation are two major manifestations of joint damage in rheumatoid arthritis. Co-stimulatory signal CD40/CD40L is the dominant co-stimulatory factor in the recognition and activation of T cells. IκBα effectively inhibits nuclear factor κB pathway, prevent the inflammation in the central link, and suppress the damage caused by inflammatory factor in the synovial tissue.
OBJECTIVE: To investigate the therapeutic effect of double gene co-expressing adenovirus vector on arthritis based on an arthritis model rat transfected by CD40LIg-IRES2-IκBα co-expressing adenovirus vector.
METHODS: The pAdCD40LIg-IRES2-IκBα co-expressing adenovirus vector was established. Arthritic model was established through multi-subcutaneous injections of complete Freund's adjuvant of type collagen II (1 g/L) into Wistar rats. Then 20 arthritic rats were divided into two groups: untreated group and transfection group, receiving an injection of saline and pAdCD40LIg-IRES2-IκBα adenovirus vector to distal joint cavity of limbs, respectively.
RESULTS AND CONCLUSION: At 14 days post-transfection, compared with the untreated group, the mean arthritis index score, the CD40L expression of lymphocytes in synovial fluid, the nuclear factor-κB p65 expression in synovial tissue, and levels of interleukin-2, interleukin-6, tumor necrosis factor-α, matrix metalloproteinase-3 and matrix metalloproteinase-9 in synovial fluid of rats in transfection group were significantly lower than those in
untreated group. Focal transfection of the CD40LIg-IκBα co-expression adenovirus vector can effectively inhibit arthritic symptoms, and reduce the expressions of inflammatory cytokine in synovial fluid and inflammatory molecule in synovial tissue of arthritic rats, which shows good therapeutic effect.

中国组织工程研究杂志出版内容重点：肾移植；肝移植；移植；心脏移植；组织移植；皮肤移植；皮瓣移植；血管移植；器官移植；组织工程

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Key words: Arthritis, Adenoviridae Infections, Lymphocytes, T-Lymphocytes

中图分类号:

R318

樊萍，何岚，郝志明，蒲丹，吕晓虹，孙怡宁，胡楠，王研华，丁小明，李杨，薛武军. 构建双基因共表达腺病毒载体转染关节炎模型大鼠的意义[J]. 中国组织工程研究, 2015, 19(18): 2825-2830.

Fan Ping, He Lan, Hao Zhi-ming1, Pu Dan, Lv Xiao-hong, Sun Yi-ning, Hu Nan, Wang Yan-hua,Ding Xiao-ming, Li Yang, Xue Wu-jun. Transfection of double gene co-expressing adenovirus vector into arthritis rats[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2015, 19(18): 2825-2830.

图/表（结果） 4

参考文献

[1] 侯德才,刘元禄,邰东旭,等.骨性关节炎的病因与机制研究进展[J].中医正骨,2006,18(7):73-74.
[2] 辛克弘.透明质酸钠治疗骨关节炎的疗效分析[J].中国社区医师:医学专业,2012,14(1):101.
[3] 王大利,耿成燕,姜丽平,等.关节软骨及骨破坏模型大鼠经盐酸氨基葡萄糖干预的最佳剂量[J].中国组织工程研究与临床康复, 2011,15(28):5145-5148.
[4] 马培奇.美FDA批准布洛芬-法莫替丁复合片剂Duexis治疗类风湿性关节炎和骨关节炎患者[J].上海医药,2011,32(7):344.
[5] Klimiuk PA, Yang H, Goronzy JJ, et al. Production of cytokines and metalloproteinases in rheumatoid synovitis is T cell dependent. Clin Immunol. 1999;90(1):65-78.
[6] Munroe ME, Bishop GA. A costimulatory function for T cell CD40. J Immunol. 2007;178(2):671-682.
[7] Makarov SS. NF-kappa B in rheumatoid arthritis: a pivotal regulator of inflammation, hyperplasia, and tissue destruction. Arthritis Res. 2001;3(4):200-206.
[8] 丁小明,牛晓丽,薛武军,等.共表达IκBα-IRES2-CD40L胞外区双基因的腺病毒载体构建及鉴定[J].细胞与分子免疫学杂志, 2010,26(5):416-419.
[9] 韩冰,张家颖,武广恒,等.大鼠类风湿性关节炎动物模型制备及血沉和组织学检测.吉林医学,2009,30(7):587-588.
[10] Gravallese EM, Manning C, Tsay A, et al. Synovial tissue in rheumatoid arthritis is a source of osteoclast differentiation factor. Arthritis Rheum. 2000;43(2):250-258.
[11] American College of Rheumatology Subcommittee on Rheumatoid Arthritis Guidelines. Guidelines for the management of rheumatoid arthritis: 2002 Update. Arthritis Rheum. 2002;46(2):328-346.
[12] Amano K, Matsubara T, Tanaka T, et al. Long-term safety and efficacy of treatment with subcutaneous abatacept in Japanese patients with rheumatoid arthritis who are methotrexate inadequate responders. Mod Rheumatol. 2015:1-7.
[13] Krasselt M, Baerwald C. The current relevance and use of prednisone in rheumatoid arthritis. Expert Rev Clin Immunol. 2014;10(5):557-571.
[14] Davis JC Jr. Understanding the role of tumor necrosis factor inhibition in ankylosing spondylitis. Semin Arthritis Rheum. 2005;34(4):668-677.
[15] Kapoor M, Martel-Pelletier J, Lajeunesse D, et al. Role of proinflammatory cytokines in the pathophysiology of osteoarthritis. Nat Rev Rheumatol. 2011;7(1):33-42.
[16] González MA, Gonzalez-Rey E, Rico L, et al. Treatment of experimental arthritis by inducing immune tolerance with human adipose-derived mesenchymal stem cells. Arthritis Rheum. 2009;60(4):1006-1019.
[17] Bouffi C, Bony C, Courties G, et al. IL-6-dependent PGE2 secretion by mesenchymal stem cells inhibits local inflammation in experimental arthritis. PLoS One. 2010;5(12): e14247.
[18] Park H, Li Z, Yang XO, et al. A distinct lineage of CD4 T cells regulates tissue inflammation by producing interleukin 17. Nat Immunol. 2005;6(11):1133-1141.
[19] Wolfe F, O'Dell JR, Kavanaugh A, et al. Evaluating severity and status in rheumatoid arthritis. J Rheumatol. 2001;28(6): 1453-1462.
[20] Davila E, Kang YM, Park YW, et al. Cell-based immunotherapy with suppressor CD8+ T cells in rheumatoid arthritis. J Immunol. 2005;174(11):7292-7301.
[21] 罗辉宇,罗爱林.B细胞在类风湿关节炎发病机制中的作用及治疗前景[J].广东医学,2007,28(11):1896-1870.
[22] Menghini R, Campia U, Tesauro M, et al. Toll-like receptor 4 mediates endothelial cell activation through NF-κB but is not associated with endothelial dysfunction in patients with rheumatoid arthritis. PLoS One. 2014;9(6):e99053.
[23] Zhang X, Burch E, Cai L, et al. CD40 mediates downregulation of CD32B on specific memory B cell populations in rheumatoid arthritis. J Immunol. 2013;190(12): 6015-6022.
[24] Criswell LA. Gene discovery in rheumatoid arthritis highlights the CD40/NF-kappaB signaling pathway in disease pathogenesis. Immunol Rev. 2010;233(1):55-61.
[25] Liu R, Xu N, Wang X, et al. Influence of MIF, CD40, and CD226 polymorphisms on risk of rheumatoid arthritis. Mol Biol Rep. 2012;39(6):6915-6922.
[26] van der Linden MP, Feitsma AL, le Cessie S, et al. Association of a single-nucleotide polymorphism in CD40 with the rate of joint destruction in rheumatoid arthritis. Arthritis Rheum. 2009;60(8):2242-2247.
[27] Orozco G, Eyre S, Hinks A, et al. Association of CD40 with rheumatoid arthritis confirmed in a large UK case-control study. Ann Rheum Dis. 2010;69(5):813-816.
[28] Liao J, Liang G, Xie S, et al. CD40L demethylation in CD4(+) T cells from women with rheumatoid arthritis. Clin Immunol. 2012;145(1):13-18.
[29] Scheinman R. NF-κB and Rheumatoid Arthritis: Will Understanding Genetic Risk Lead to a Therapeutic Reward? For Immunopathol Dis Therap. 2013;4(2):93-110.
[30] Glehr M, Breisach M, Walzer S, et al. The influence of resveratrol on the synovial expression of matrix metalloproteinases and receptor activator of NF-kappaB ligand in rheumatoid arthritis fibroblast-like synoviocytes. Z Naturforsch C. 2013;68(7-8):336-342.
[31] Wu MY, Yang RS, Lin TH, et al. Enhancement of PLGF production by 15-(S)-HETE via PI3K-Akt, NF-κB and COX-2 pathways in rheumatoid arthritis synovial fibroblast. Eur J Pharmacol. 2013;714(1-3):388-396.
[32] Trenkmann M1, Brock M, Gay RE, et al. Tumor necrosis factor α-induced microRNA-18a activates rheumatoid arthritis synovial fibroblasts through a feedback loop in NF-κB signaling. Arthritis Rheum. 2013;65(4):916-927.
[33] Mattey DL, Nixon NB, Dawes PT. Association of circulating levels of MMP-8 with mortality from respiratory disease in patients with rheumatoid arthritis. Arthritis Res Ther. 2012; 14(5):R204.
[34] Sioud M, Mellbye O, Førre O. Analysis of the NF-kappa B p65 subunit, Fas antigen, Fas ligand and Bcl-2-related proteins in the synovium of RA and polyarticular JRA. Clin Exp Rheumatol.1998;16(2):125-134.
[35] Pinkenburg O, Platz J, Beisswenger C, et al. Inhibition of NF-kappaB mediated inflammation by siRNA expressed by recombinant adeno-associated virus. J Virol Methods. 2004; 120(1):119-122.
[36] Philippe L, Alsaleh G, Suffert G, et al. TLR2 expression is regulated by microRNA miR-19 in rheumatoid fibroblast-like synoviocytes. J Immunol. 2012;188(1):454-461.
[37] Bottini N, Firestein GS. Duality of fibroblast-like synoviocytes in RA: passive responders and imprinted aggressors. Nat Rev Rheumatol. 2013;9(1):24-33.
[38] 姚茹冰,蔡辉.核因子-κB与类风湿关节炎相关性的研究进展[J].医学研究生学报,2006,19(3):267-270.
[39] Ito A, Hirota S, Mizuno H, et al. Expression of vascular permeability factor (VPF/VEGF) messenger RNA by plasma cells: possible involvement in the development of edema in chronic inflammation. Pathol Int. 1995;45(10):715-720.
[40] Pan MH, Lin-Shiau SY, Lin JK. Comparative studies on the suppression of nitric oxide synthase by curcumin and its hydrogenated metabolites through down-regulation of IkappaB kinase and NFkappaB activation in macrophages. Biochem Pharmacol. 2000;60(11):1665-1676.
[41] Fan P, He L, Pu D, et al. Improving therapy effect on arthritic rats by co-expression of CD40LIg and IκBα. Arthritis Rheumatol. 2011;63(S10):442.

引言

材料方法

设计：随机动物实验及细胞学实验。

时间及地点：实验于2013年1月至2014年12月在西安交通大学医学院器官移植研究所完成。

材料：

动物：健康清洁级Wistar大鼠20只，雌雄不拘，鼠龄8-10周龄，体质量200-250 g，购自西安交通大学医学院动物中心。实验符合动物伦理学的要求。

病毒载体：pAdCD40LIg-IRES2-IκBα腺病毒载体由西安交通大学医学院第一附属医院肾移植实验室馈赠^[8]。

双基因腺病毒载体转染对类风湿关节炎影响检测使用的主要试剂：
试剂	来源
兔抗鼠核因子κB p65、β-actin单克隆抗体以及PE标记的兔抗鼠CD40L单克隆抗体	ABCAM公司产品
SABC检测试剂盒	武汉博士德公司
鼠白细胞介素2、肿瘤坏死因子α、白细胞介素6、间质金属蛋白酶3和间质金属蛋白酶9的ELISA kit	Bender公司
牛源性Ⅱ型胶原蛋白和弗氏完全佐剂	Sigma公司
淋巴细胞分离液	LYMPHOLYTE公司

方法：

构建关节炎大鼠模型：将Ⅱ型胶原蛋白0.1 mol/L的冰乙酸中，质量浓度为2 g/L，置于4 ℃搅拌过夜，再与弗氏完全佐剂等体积混合并充分乳化，制成含Ⅱ型胶原蛋白浓度为 1 g/L的乳剂。剃除Wistar大鼠背部周围毛，取配置好的乳剂100 μL，自鼠尾部开始，在脊柱两旁皮下多点注射，剂量1 mL/只，1周后加强免疫1次，剂量为0.5 mL/只，建立胶原诱导的免疫性关节炎大鼠模型，建模后7 d可见大鼠四肢关节肿胀明显，足踝皮肤发亮，关节活动受限，提示建模成功^[9]。

腺病毒载体转染关节炎大鼠模型：将构建的的关节炎大鼠模型随机分为2组：未处理组(n=10)和转染组(n=10)。转染组大鼠于建模当天将pAdCD40LIg-IRES2-IκBα腺病毒载体采用四肢末端关节腔注射的方式进行局部感染，感染强度(MOI)为100^[8]，未处理组大鼠注射生理盐水。

关节炎症状评分：采用关节炎指数积分评定法^[10]，于转染后14 d，依据大鼠四肢末端关节红肿程度和范围以及关节肿大和变形情况进行评估。四肢末端关节被分成0-4级。0：无红肿；1：趾关节稍肿；2：小趾关节和足跖肿胀；3：踝关节以下足爪肿胀；4：包括踝关节在内的全部足爪肿胀。关节炎指数积分为四肢关节评分之和，每只大鼠4只足爪的最大积分为16分，关节炎指数积分越高，关节炎症状越严重。

关节液淋巴细胞CD40L表达的测定：首先分离关节液中的淋巴细胞。于转染后14 d，通过关节腔穿刺抽取两组大鼠关节滑液100 μL，用20 U/mL的肝素抗凝，3 000 r/min离心10 min，弃上清，沉淀物加PBS洗涤2次，用淋巴细胞分离液混合，1 500 r/min离心15 min，吸取单核细胞层，PBS重悬。加入等量的10 g/L多聚甲醛，固定30 min，离心后加入PBS洗涤，以去除多余的多聚甲醛。细胞计数后，调整浓度至每个EP管内溶液体积为500 μL，细胞数为1×10⁶个。加入10 μL PE标记的抗鼠CD40L单克隆抗体， 4 ℃避光孵育30 min，PBS洗涤2遍以去除未结合抗体，然后使用PBS重悬至1 mL的EP管。以兔同型IgG2作为对照抗体。然后上机检测，每个样本分析10 000个细胞数。用CellQuest Software version 2.0 for MACOS(美国BD公司) 进行数据分析处理。

关节滑膜组织核因子κB表达的测定：于转染后14 d， 2组大鼠麻醉处死，取出四肢末端关节滑膜组织，将组织块置于1.0-2.0 mL匀浆器中球状部位，用干净的剪刀将组织块尽量剪碎。加400 μL单去污剂裂解液于匀浆器中，进行匀浆。裂解30 min后收集蛋白，每孔上样量为20 μg，电泳完毕后半干转膜至醋酸纤维膜，用50 g/L脱脂奶粉封闭1 h。根据蛋白Marker, 将膜在适当的位置剪开，做好标记，置于包含1∶200稀释的兔抗鼠核因子κB p65抗体中4 ℃过夜，经加Tween-TBST洗涤后, 以1∶200的HRP-羊抗兔二抗室温孵育1 h，充分洗膜后作ECL化学发光(Pierce公司)， X射线(Kodak公司)曝光显影。

关节液细胞因子水平的测定：于转染后14 d，通过关节腔穿刺抽取两组大鼠关节滑液100 μL，3 000 r/min离心10 min，吸取上清液，ELISA法测定关节炎中白细胞介素2、白细胞介素6、肿瘤坏死因子α、间质金属蛋白酶3和间质金属蛋白酶9的水平，检测方法按试剂盒的说明书要求进行。

主要观察指标：①关节炎评分评估大鼠关节炎症状。②流式细胞法检测关节炎淋巴细胞CD40L表达。③Western-blot法检测滑膜组织核因子κB p65表达。④ELISA法检测关节液炎性细胞因子水平。

统计学分析：数据以x(_)±s表示，两组均数之间比较用两样本t 检验，使用SPSS 11.5软件(美国SPSS公司)分析处理。P < 0.05为差异有显著性意义。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：肾移植；肝移植；移植；心脏移植；组织移植；皮肤移植；皮瓣移植；血管移植；器官移植；组织工程

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讨论

对类风湿关节炎常规治疗药物主要有非类固醇抗炎药、细胞毒药物以及糖皮质激素^[11-13]。研究发现，上述药物在临床应用中存在一些问题，如不良反应较大，不良反应较多，用药不够灵活，容易产生药物依赖，停药后症状容易反弹等。近年来涌现的生物制剂如肿瘤坏死因子α拮抗剂^[14-15]，虽然明显改善了类风湿关节炎的治疗效果，但也只能通过拮抗细胞因子达到缓解症状的效果，并不能从根本上治疗类风湿关节炎，而且其治疗效果有待提高。因此，寻找一种更加有效的治疗类风湿关节炎的方法十分必要，而本实验尝试通过转基因技术，通过转染抑制炎症基因并持续表达，试图达到类风湿关节炎的治疗效果。

在类风湿关节炎的病程中，淋巴细胞被认为扮演了重要的角色^[16-19]。有研究显示，在类风湿关节炎患者的关节滑膜组织中可观察到有大量T淋巴细胞聚集，这些T淋巴细胞表达大量的CD40L，可与单核细胞表面CD40结合，促进单核细胞的游走渗出，并促进其产生肿瘤坏死因子α等炎性细胞因子表达，从而引起关节滑膜组织的炎症反应^[20]。CD40/CD40L不仅仅是T细胞活化重要的共刺激信号，它还向B细胞提供活化的第二信号，也是B细胞重要的共刺激信号。B细胞可分泌自身抗体，炎性细胞因子(肿瘤坏死因子α，白细胞介素6)，趋化因子，并通过抗原递呈激活T细胞，从而促进关节组织炎症反应^[21]。此外，研究显示，CD40/CD40L信号的激活还能使VEGF的表达上调，从而促进血管翳的形成，进一步促进炎症的发生和发展。CD40/CD40L信号还参与了基质金属蛋白酶的分泌，从而导致关节软骨的破坏^[22-28]。可见，共刺激信号CD40/ CD40L系统在类风湿关节炎病理过程中所起的作用不可忽视。阻断B7/CD28共刺激信号的药物CTLA4Ig治疗类风湿关节炎已取得了一定的进展，目前其已被美国FDA列为治疗类风湿关节炎的药物，可见阻断共刺激信号能够延缓类风湿关节炎的病变，成为类风湿关节炎治疗的新靶点。

除了共刺激信号，核因子κB对类风湿关节炎的重要意义也受到人们的注意^[29-32]。研究显示类风湿关节炎患者滑膜组织抽取物中的核因子κB活性明显增高，表明滑膜组织中核因子κB的高表达状态在类风湿关节炎发生发展中起着关键的作用^[33-38]。有关研究普遍认为核因子κB在类风湿关节炎中的作用主要通过以下途径：核因子κB活化后可增强白细胞介素1β、肿瘤坏死因子α、白细胞介素6、白细胞介素8、黏附分子、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子、环氧化酶2等基因的转录水平，同时核因子κB活化又是类风湿关节炎患者滑膜细胞表达的许多炎症递质如肿瘤坏死因子α、白细胞介素1等炎症细胞因子表达增强的正反馈结果，两者构成反馈机制，导致类风湿关节炎炎症反应和结构破坏得以维持与进展^[39]。可见，核因子κB可视为调控炎症反应的“瓶颈”，抑制核因子κB活化及其炎性递质的生成，不失为一种较好的治疗类风湿关节炎的途径。IκBα是核因子κB激活途径中主要的调节分子，可以抑制核因子κB的上调，在中心环节上抑制炎症反应的产生，从而延缓类风湿关节炎炎症反应的发生和发展。

转基因技术的不断发展，使得基因治疗是一种极具潜力的治疗类风湿关节炎的方法，利用腺病毒载体表达一些炎症抑制基因，使其持续表达目的蛋白，阻断炎症通路，从根本上阻止类风湿关节炎的病理变化。此外，以往的研究显示，腺病毒载体转染诸如内皮细胞等表皮细胞，会引起CD40/CD40L通路表达上调，而这种作用恰恰是通过核因子κB的^[40]。采用腺病毒载体单一阻断CD40/CD40L通路效果可能不理想，需联合阻断核因子κB才能达到预期效果。在进行体内或体外转基因治疗的各种细胞，与其他载体相比，腺病毒载体的转染效果是比较高的，可以在低温下(4 ℃)可以结合到靶细胞的表面。由于腺病毒衣壳多肽的结构稳定性，病毒颗粒可以纯化并浓缩到1×10¹³ pfu/L。腺病毒载体在转基因治疗领域中的另一优势是腺病毒基因组并不整合到人类细胞的基因组中，而是作为非复制性遗传物质存在于靶细胞核内染色体以外。所以，激活人类癌基因或灭活抑癌基因的可能性比较小，引起细胞恶变的概率比较小。

本实验显示，采用双基因共表达载体局部转染关节炎大鼠模型后，关节液中淋巴细胞中促进活化的CD40L表达明显降低，而且关键的炎性分子核因子κB也显著减弱，因而关节炎中的各种言行细胞因子水平显著降低，从而减轻了关节炎的症状及评分，达到了治疗效果。作者以往的研究也显示，使用双基因共表达腺病毒载体转染大鼠后，对关节炎症状的减轻要显著优于单基因腺病毒载体转染^[41]，提示采用双基因共表达同时阻断两个靶点，对关节炎的抑制具有发达效应。本实验用关节腔注射的局部转染方法，虽然也取得了良好的治疗效果，但由于类风湿关节炎是一种全身性的免疫性疾病，理论上全身转染的效果较好，但由于全身转染对全身的免疫系统影响较大，风险较高，对安全性要求高。局部转染相对较安全，但由于仅能抑制局部炎症反应，因此治疗效果有限。因此，如何选择安全有效的转染方式还有待进一步观察。

实验应用DNA重组技术，获得CD40LIg-IRES2-IκBα双基因表达的腺病毒载体，鉴定后转染到关节炎动物模型的关节滑膜细胞，在阻断T细胞共刺激信号的同时，抑制核因子κB介导的炎症反应，从而在理论上使阻断共刺激信号和抑制炎症反应两条途径同时发挥作用，为类风湿关节炎的基因治疗奠定理论基础。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：肾移植；肝移植；移植；心脏移植；组织移植；皮肤移植；皮瓣移植；血管移植；器官移植；组织工程
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[1]	肖国庆, 刘选泽, 严钰皓, 钟喜红. 后交叉韧带替代型假体全膝关节置换术后屈曲受限的影响因素[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(9): 1362-1367.
[2]	彭智浩, 冯宗权, 邹勇根, 牛国庆, 吴峰. 活动平台单髁置换后下肢力线与外侧间室骨关节炎进展的关系[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(9): 1368-1374.
[3]	黄泽晓, 杨妹, 林诗炜, 何和与. 血清n-3多不饱和脂肪酸水平与全膝关节置换早期股四头肌肌力变化的相关性[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(9): 1375-1380.
[4]	黄登承, 王志科, 曹学伟. 体外冲击波疗法治疗中老年膝骨关节炎短期疗效对比的荟萃分析[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(9): 1471-1476.
[5]	李嘉程, 梁学振, 刘金豹, 许波, 李刚. 骨性关节炎mRNA差异表达谱及竞争性内源RNA调控的网络分析[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(8): 1212-1217.
[6]	柴乐, 吕建兰, 胡劲涛, 胡华辉, 许庆军, 余进伟, 全仁夫. 诱导急性脊髓损伤模型大鼠炎症反应信号通路的变化[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(8): 1218-1223.
[7]	耿秋东, 葛海雅, 王和鸣, 李楠. 基于网络药理学探讨龟鹿二仙胶治疗骨关节炎的作用及机制[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(8): 1229-1236.
[8]	刘翔翔, 黄云梅, 陈文列, 林如辉, 卢小冬, 李钻芳, 许亚晔, 黄美雅, 李西海. 早期骨关节炎模型大鼠半月板白区细胞的超微结构变化[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(8): 1237-1242.
[9]	顾霞, 赵敏, 王平义, 李一梅, 李文华. 低氧诱导因子1α与低氧相关疾病信号通路的关系[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(8): 1284-1289.
[10]	王正东, 黄娜, 陈婧娴, 郑作兵, 胡鑫宇, 李梅, 苏晓, 苏学森, 颜南. 丁酸钠抑制氟中毒可诱导小胶质细胞活化及炎症因子表达增多[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(7): 1075-1080.
[11]	谢文佳, 夏天娇, 周卿云, 刘羽佳, 顾小萍. 小胶质细胞介导神经元损伤在神经退行性疾病中的作用[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(7): 1109-1115.
[12]	史洋洋, 秦英飞, 吴福玲, 何潇, 张雪静. 胎盘间充质干细胞预处理预防小鼠毛细支气管炎[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(7): 991-995.
[13]	段丽芸, 曹晓沧. 人胎盘间充质干细胞来源细胞外囊泡调节肠炎小鼠肠黏膜胶原的沉积[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(7): 1026-1031.
[14]	赵中溢, 李勇阵, 陈峰, 季爱玉. 同期双侧全膝关节置换和单髁置换治疗创伤性关节炎的比较[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(6): 854-859.
[15]	刘少华, 周观明, 陈希聪, 肖可明, 蔡剑, 刘效仿. 前交叉韧带缺陷对固定平台单髁置换后中期疗效的影响[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(6): 860-865.