重组9型腺相关病毒载体转染动脉粥样硬化模型小鼠主动脉：最佳在体表达时间点的确定

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2015.05.014

中国组织工程研究 ›› 2015, Vol. 19 ›› Issue (5): 733-738.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.2015.05.014

• 器官移植动物模型 organ transplantation and animal model • 上一篇下一篇

重组9型腺相关病毒载体转染动脉粥样硬化模型小鼠主动脉：最佳在体表达时间点的确定

谢佳，杨毅宁，马依彤，李晓梅，陈邦党，刘芬，陈清杰，翟慧

新疆医科大学第一附属医院心脏中心，新疆维吾尔自治区乌鲁木齐市 830054

修回日期:2015-01-09 出版日期:2015-01-30 发布日期:2015-03-02
通讯作者: 杨毅宁，博士，主任医师，教授，博士生导师，新疆医科大学第一附属医院心脏中心，新疆维吾尔自治区乌鲁木齐市 830054
作者简介:谢佳，女，1989年生，河南省西平县人，汉族，新疆医科大学在读硕士，主要从事冠状动脉粥样硬化性心脏病基础及临床方面的研究。
基金资助:
国家自然科学基金项目(81160042)

Recombinant adeno-associated virus serotype 9 transfection of atherosclerosis mice: determination of the optimal expression time in vivo

Xie Jia, Yang Yi-ning, Ma Yi-tong, Li Xiao-mei, Chen Bang-dang, Liu Fen, Chen Qing-jie, Zhai Hui

Heart Center, First Affiliated Hospital of Xinjiang Medical University, Urumqi 830054, Xinjiang Uygur Autonomous Region, China

Revised:2015-01-09 Online:2015-01-30 Published:2015-03-02
Contact: Yang Yi-ning, M.D., Chief physician, Professor, Doctoral supervisor, Heart Center, First Affiliated Hospital of Xinjiang Medical University, Urumqi 830054, Xinjiang Uygur Autonomous Region, China
About author:Xie Jia, Studying for master’s degree, Heart Center, First Affiliated Hospital of Xinjiang Medical University, Urumqi 830054, Xinjiang Uygur Autonomous Region, China
Supported by:
the National Natural Science Foundation of China, No. 81160042

摘要/Abstract

摘要：

背景：重组9型腺相关病毒载体对心肌组织具有较高的亲和力，关于携带增强型绿色荧光蛋白报告基因的重组9型腺相关病毒(recombinant adeno-associated virus serotype 9-enhanced green fluorescent protein，rAAV9-eGFP)在动脉粥样硬化模型小鼠主动脉中的表达情况还不确定。
目的：探索携带rAAV9-eGFP转染动脉粥样硬化模型小鼠主动脉最佳的在体表达时间点。
方法：给予30只ApoE^-/-小鼠连续高脂饮食饲养16周建立为动脉粥样硬化模型，然后随机取其中25只通过尾静脉注射转染5.0×10¹¹ vg(virus genomes)rAAV9-eGFP，另5只作为对照组给予生理盐水。转染病毒的动脉粥样硬化模型小鼠分别于转染后14，21，28，35，60 d处死，留取主动脉组织，应用激光共聚焦显微镜观察增强型绿色荧光蛋白荧光表达情况，Western blot法检测主动脉增强型绿色荧光蛋白的蛋白表达，观察增强型绿色荧光蛋白体内表达情况，确定病毒在体表达最佳时间点。
结果与结论：rAAV9-eGFP可有效转染动脉粥样硬化模型小鼠主动脉血管，增强型绿色荧光蛋白可在主动脉组织中表达，其表达强度随着转染时间的增加而逐渐增强，于转染35 d时表达最强，60 d趋于稳定，各时间点主动脉斑块中增强型绿色荧光蛋白表达的水平差异有显著意义(P < 0.001)。表明rAAV9-eGFP可有效在动脉粥样硬化模型ApoE^-/-小鼠主动脉中表达，rAAV9-eGFP可成为动脉粥样硬化治疗的最佳载体。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：肾移植；肝移植；移植；心脏移植；组织移植；皮肤移植；皮瓣移植；血管移植；器官移植；组织工程

全文链接：

关键词: 实验动物, 心脏及血管损伤模型, 动脉粥样硬化, 组织构建, 9型腺相关病毒, 主动脉, 转染, ApoE^-/-小鼠, 国家自然科学基金

Abstract:

BACKGROUND: Recombinant adeno-associated virus serotype 9 has a high affinity in myocardial tissue, and the expression of recombinant adeno-associated virus serotype 9-enhanced green fluorescent protein (rAAV9-eGFP) in the aorta of atherosclerosis mice is not clear.
OBJECTIVE: To explore the optimal time point of rAAV9-eGFP expression in the aorta of atherosclerosis mice.
METHODS: Atherosclerosis model was established with high-fat diet in 30 ApoE^-/- mice for 16 weeks. Among them, 25 mice were injected with 5.0×10¹¹ vg (virus genomes) rAAV9-eGFP through the tail vein, while the remaining 5 mice were injected with saline, serving as the control group. The virus-transfected mice were killed at 14, 21, 28, 35 and 60 days after transfection, and aortic tissue was harvested. The expression of enhanced green fluorescent protein was detected with laser scanning confocal microscope. Western blot assays were used to detect the expression of enhanced green fluorescent protein in aorta. The expression of enhanced green fluorescent protein in vivo was observed and the optimal expression time point was determined.
RESULTS AND CONCLUSION: rAAV9-eGFP effectively transfected the aorta of atherosclerosis mice, enhanced green fluorescent protein was expressed in aortic tissue, and the expression intensity increased gradually with the increasing transfection time. The highest expression level was found at 35 days after transfection and then maintained stable at 60 days. There were significant differences at different time points after transfection (P < 0.001). These data indicate that rAAV9-eGFP can be effectively expressed in the aorta of atherosclerosis ApoE^-/- mice and rAAV9-eGFP can be regarded as the optimal vector in the treatment of atherosclerosis.

中国组织工程研究杂志出版内容重点：肾移植；肝移植；移植；心脏移植；组织移植；皮肤移植；皮瓣移植；血管移植；器官移植；组织工程

全文链接：

Key words: Viruses, Enhanced Green Fluorescent Protein, Models, Animal, Atherosclerosis

中图分类号:

R318

谢佳，杨毅宁，马依彤，李晓梅，陈邦党，刘芬，陈清杰，翟慧. 重组9型腺相关病毒载体转染动脉粥样硬化模型小鼠主动脉：最佳在体表达时间点的确定[J]. 中国组织工程研究, 2015, 19(5): 733-738.

Xie Jia, Yang Yi-ning, Ma Yi-tong, Li Xiao-mei, Chen Bang-dang, Liu Fen, Chen Qing-jie, Zhai Hui. Recombinant adeno-associated virus serotype 9 transfection of atherosclerosis mice: determination of the optimal expression time in vivo[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2015, 19(5): 733-738.

图/表（结果） 4

参考文献

[1] Králová A, Králová Lesná I, Poledne R. Immunological aspects of atherosclerosis. Physiol Res. 2014;63 Suppl 3:S335-342.
[2] Salisbury D, Bronas U. Inflammation and immune system contribution to the etiology of atherosclerosis: mechanisms and methods of assessment. Nurs Res. 2014;63(5):375-385.
[3] Lu X, Kakkar V. Inflammasome and atherogenesis. Curr Pharm Des. 2014;20(1):108-124.
[4] Tuttolomondo A, Di Raimondo D, Pecoraro R, et al. Atherosclerosis as an inflammatory disease. Curr Pharm Des. 2012;18(28):4266-4288.
[5] Liu Z, Zhao Y, Wei F, et al. Treatment with telmisartan/ rosuvastatin combination has a beneficial synergistic effect on ameliorating Th17/Treg functional imbalance in hypertensive patients with carotid atherosclerosis. Atherosclerosis. 2014; 233(1):291-299.
[6] Artom N, Montecucco F, Dallegri F, et al. Carotid atherosclerotic plaque stenosis: the stabilizing role of statins. Eur J Clin Invest. 2014;44(11):1122-1134.
[7] Lehrke M, Lebherz C. AAV-mediated gene therapy for atherosclerosis. Curr Atheroscler Rep. 2014;16(9):434.
[8] Skubis-Zegad?o J, Stachurska A, Ma?ecki M. Vectrology of adeno-associated viruses (AAV). Med Wieku Rozwoj. 2013; 17(3):202-206.
[9] Drouin LM, Agbandje-McKenna M. Adeno-associated virus structural biology as a tool in vector development. Future Virol. 2013;8(12):1183-1199.
[10] Tseng YS, Agbandje-McKenna M. Mapping the AAV Capsid Host Antibody Response toward the Development of Second Generation Gene Delivery Vectors. Front Immunol. 2014;5:9.
[11] Werfel S, Jungmann A, Lehmann L, et al. Rapid and highly efficient inducible cardiac gene knockout in adult mice using AAV-mediated expression of Cre recombinase. Cardiovasc Res. 2014;104(1):15-23.
[12] Sun L, Hao Y, Nie X, et al. Construction of PR39 recombinant AAV under control of the HRE promoter and the effect of recombinant AAV on gene therapy of ischemic heart disease. Exp Ther Med. 2012;4(5):811-814.
[13] Park CS, Cha H, Kwon EJ, et al. AAV-mediated knock-down of HRC exacerbates transverse aorta constriction-induced heart failure. PLoS One. 2012;7(8):e43282.
[14] Yang YN, Ji WN, Ma YT, et al. Activation of the ERK1/2 pathway by the CaMEK gene via adeno-associated virus serotype 9 in cardiomyocytes. Genet Mol Res. 2012;11(4): 4672-4681.
[15] Kotchey NM, Adachi K, Zahid M, et al. A potential role of distinctively delayed blood clearance of recombinant adeno-associated virus serotype 9 in robust cardiac transduction. Mol Ther. 2011;19(6):1079-1089.
[16] Miyagi N, Rao VP, Ricci D, et al. Efficient and durable gene transfer to transplanted heart using adeno-associated virus 9 vector. J Heart Lung Transplant. 2008;27(5):554-560.
[17] Kotchey NM, Adachi K, Zahid M, et al. A potential role of distinctively delayed blood clearance of recombinant adeno-associated virus serotype 9 in robust cardiac transduction. Mol Ther. 2011;19(6):1079-1089.
[18] Inagaki K, Fuess S, Storm TA, et al. Robust systemic transduction with AAV9 vectors in mice: efficient global cardiac gene transfer superior to that of AAV8. Mol Ther. 2006;14(1):45-53.
[19] Daugherty A. Mouse models of atherosclerosis. Am J Med Sci. 2002;323(1):3-10.
[20] 刘剑刚,董国菊,史大卓,等.载脂蛋白E基因敲除小鼠不同周龄动脉粥样硬化的病理变化[J].中国动脉硬化杂志,2005,13(6): 689-692.
[21] Hermonat PL, Muzyczka N. Use of adeno-associated virus as a mammalian DNA cloning vector: transduction of neomycin resistance into mammalian tissue culture cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 1984;81(20):6466-6470.
[22] Chu D, Sullivan CC, Weitzman MD, et al. Direct comparison of efficiency and stability of gene transfer into the mammalian heart using adeno-associated virus versus adenovirus vectors. J Thorac Cardiovasc Surg. 2003;126(3):671-679.
[23] Pacak CA, Mah CS, Thattaliyath BD, et al. Recombinant adeno-associated virus serotype 9 leads to preferential cardiac transduction in vivo. Circ Res. 2006;99(4):e3-9.
[24] Schinkel S, Bauer R, Bekeredjian R, et al. Long-term preservation of cardiac structure and function after adeno-associated virus serotype 9-mediated microdystrophin gene transfer in mdx mice. Hum Gene Ther. 2012;23(6): 566-575.
[25] Piras BA, O'Connor DM, French BA. Systemic delivery of shRNA by AAV9 provides highly efficient knockdown of ubiquitously expressed GFP in mouse heart, but not liver. PLoS One. 2013;8(9):e75894.
[26] Chaanine AH, Nonnenmacher M, Kohlbrenner E, et al. Effect of bortezomib on the efficacy of AAV9.SERCA2a treatment to preserve cardiac function in a rat pressure-overload model of heart failure. Gene Ther. 2014;21(4):379-386.
[27] 向阳,马依彤,杨毅宁,等.重组9型腺相关病毒载体转染小鼠心脏及对心功能的影响[J].中华微生物学和免疫学杂志,2009,29(10): 899-902.
[28] 高霞,马依彤,杨毅宁,等.9型重组腺相关病毒转染体外培养大鼠心肌细胞的影响[J].细胞与分子免疫学杂志,2010,26(01):18-20.
[29] 杜雷,马依彤,杨毅宁,等.9型重组腺相关病毒转染大鼠心脏成纤维细胞的体外研究[J].心血管康复医学杂志,2010,19(2): 121-125.
[30] Baker AH, Kritz A, Work LM, et al. Cell-selective viral gene delivery vectors for the vasculature. Exp Physiol. 2005;90(1): 27-31.
[31] Bostick B, Ghosh A, Yue Y, et al. Systemic AAV-9 transduction in mice is influenced by animal age but not by the route of administration. Gene Ther. 2007;14(22):1605-1609.
[32] Plump AS, Smith JD, Hayek T, et al. Severe hypercholesterolemia and atherosclerosis in apolipoprotein E-deficient mice created by homologous recombination in ES cells. Cell. 1992;71(2):343-353.
[33] Irie D, Kawahito H1, Wakana N1, et al. Transplantation of periaortic adipose tissue from angiotensin receptor blocker-treated mice markedly ameliorates atherosclerosis development in apoE-/- mice. J Renin Angiotensin Aldosterone Syst. 2014. in press.
[34] Zhang SH, Reddick RL, Piedrahita JA, et al. Spontaneous hypercholesterolemia and arterial lesions in mice lacking apolipoprotein E. Science. 1992;258(5081):468-471.
[35] 康爱君,田枫,张阔,等. 载脂蛋白E基因缺陷(C57BL/6J-ApoE)小鼠血脂及病理组织学观察[J].中国比较医学杂志,2006,16(2): 85-88.
[36] 程军,李金平,田卓,等.ApoE基因敲除小鼠和C57BL/6J小鼠血脂及主动脉组织病理学的对比观察[J].实验动物科学,2008,25(2): 4-6.
[37] 周军,周丽,曾庆仁.高脂饮食诱导APOE和LDLR基因敲除鼠AS斑块形成的分子病理学特征[J].中国现代医学杂志,2009, 19(10): 1460-1464.
[38] Kampschulte M, Stöckl C, Langheinrich AC, et al. Western diet in ApoE-LDLR double-deficient mouse model of atherosclerosis leads to hepatic steatosis, fibrosis, and tumorigenesis. Lab Invest. 2014;94(11):1273-1282.
[39] Prendergast C, Quayle J1, Burdyga T1, et al. Atherosclerosis differentially affects calcium signalling in endothelial cells from aortic arch and thoracic aorta in Apolipoprotein E knockout mice. Physiol Rep. 2014;2(10). pii: e12171.
[40] Kus K, Wisniewska A, Toton-Zuranska J, et al. Significant deterioration of anti-atherogenic efficacy of nebivolol in a double (apolipoprotein E and endothelial nitric oxide synthase) knockout mouse model of atherosclerosis in comparison to single (apolipoprotein E) knockout model. J Physiol Pharmacol. 2014;65(6):877-881.
[41] Getz GS, Reardon CA. Animal models of atherosclerosis. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 2012;32(5):1104-1115.
[42] 刘春喜,李大庆,王荣,等.血管组织自发荧光的去除方法及应用[J].中华病理学杂志,2008,37(4):276-277.

引言

动脉粥样硬化是以血管内皮细胞损伤、血管平滑肌细胞和成纤维细胞增生、巨噬细胞聚集以及细胞内外脂质沉积为主的一种复杂病理过程^[1-2]。动脉粥样硬化形成是一个漫长的炎症反应过程^[3-4]。动脉粥样硬化的发病原因目前尚不明确。目前临床上大多数使用药物来治疗动脉粥样硬化^[5-6]，而腺相关病毒介导的基因有望成为治疗动脉粥样硬化的新途径^[7]。

腺相关病毒载体是目前最常用的用于基因治疗的病毒载体，病毒具有缺乏致病性、免疫原性低、稳定性等特点，可作为用于基因治疗应用的递送载体^[8-9]。因此，腺相关病毒是一种很有前途的基因传递载体系统^[10]。近年来，腺相关病毒已成为基因治疗研究的热点，特别是在心血管疾病机制探讨和治疗研究中的应用较广泛^[11-13]。

高效靶向的将目的基因传递至主动脉组织是开展动脉粥样硬化疾病基因治疗的关键。既往的研究中重组9型腺相关病毒在心脏基因治疗应用较多^[14-18]，在主动脉组织中研究相对缺乏，尤其是在动脉粥样硬化模型小鼠主动脉血管中，目前含增强型绿色荧光蛋白报告基因的重组9型腺相关病毒(recombinant adeno-associated virus serotype 9-enhanced green fluorescent protein，rAAV9-eGFP)转染对主动脉斑块是否具有转染作用未见相关报道。

实验以动脉粥样硬化模型的ApoE^-/-小鼠为研究对象，选用重组9型腺相关病毒为载体，以增强型绿色荧光蛋白为报告基因，体内转染主动脉血管，测定rAAV9-eGFP在体内的表达情况，为今后利用rAAV9-eGFP载体开展动脉粥样硬化的基因治疗奠定实验基础。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：肾移植；肝移植；移植；心脏移植；组织移植；皮肤移植；皮瓣移植；血管移植；器官移植；组织工程
全文链接：

材料方法

设计：随机对照动物实验。

时间及地点：实验于2014年3至10月在新疆医科大学第一附属医院新疆心血管病研究重点实验室完成。

材料：

实验动物：健康SPF级ApoE^-^/^-小鼠30只，雄性，鼠龄6或7周，体质量16-20 g，购自北京维通利华实验动物技术有限公司，实验动物许可证号：SCXK(京)2012-0001。动物饲养环境温度为22-25 ℃，相对湿度60%，光-暗周期12 h。所有实验过程均已通过新疆医科大学第一附属医院伦理委员会批准。

方法：

动脉粥样硬化模型的建立：ApoE^-/-小鼠形成动脉粥样硬化斑块不仅局限于主动脉根部，在冠状动脉、主动脉弓及其分叉处、颈总动脉及其分叉处、胸主动脉、腹主动脉、双肾动脉分叉处均可形成斑块，与人类全身动脉粥样硬化好发处相近。高脂饮食会加速ApoE^-/-小鼠动脉粥样硬化形成的进程，且比普通饮食小鼠动脉粥样硬化形成的面积大、程度重，节约造模时间3-6周，一般ApoE^-/-小鼠大约15周龄即开始形成纤维斑块，并且复合病变如出血、血栓形成亦更容易在高脂饮食小鼠中出现。因此，在动物膳食中采用高脂饮食，会加速模型的形成，不仅节省时间，而且对于不稳定斑块的研究可提供更可靠、模拟性更强的模型。因此实验给予所有ApoE^-/-小鼠高脂膳食结构的饲料饮食(脂肪21%、胆固醇0.15%，购自北京科澳协力饲料有限公司，合格证号：SCXK(京)2009-0012)连续16周，建立动脉粥样硬化模型^[19-20]。

标本留取：高脂饮食喂养16周建立动脉粥样硬化模型，随机取其中25只小鼠采用5.0×10¹¹ vg(virus genomes)/只的rAAV9-eGFP，经小鼠尾静脉注射入体内，另5只作为对照组给予生理盐水。于转染病毒后14，21，28，35，60 d，各取5只小鼠，留取主动脉标本，取材前小鼠禁食12 h，采用腹腔注射氯胺酮(100 mg/kg)、甲苯噻嗪(20 mg/kg)、阿托品(1.2 mg/kg)的混合液，麻醉生效后，显微镜下剖开小鼠胸腔，暴露主动脉，从主动脉根部游离主动脉，分离出头臂动脉，取出头臂动脉于40 g/L多聚甲醛中固定2 h后用于制作冰冻切片，切片厚度为6 μm，用于检测增强型绿色荧光蛋白的表达；余主动脉组织液氮中冻存后转入-80 ℃冰箱保存，用于Western blot检测增强型绿色荧光蛋白表达。

冰冻切片结合激光共聚焦显微镜检测增强型绿色荧光蛋白表达：rAAV9-eGFP转染动脉粥样硬化模型主动脉血管后，取各组小鼠头臂动脉经40 g/L多聚甲醛固定2 h后，用PBS冲洗3次，每次5 min，置于15%蔗糖中脱水，4 ℃冰箱过夜，次日置换PBS后制作冰冻切片，6 μm连续冰冻切片。随后组织切片经蒸馏水浸润，置于0.5%滂胺天空蓝中浸泡10 min，PBS洗3次，每次5 min，用滤纸吸干周围水分，滴加DAPI复染细胞核5 min，PBS洗3次，每次5 min，吸干周围水分，滴加抗荧光淬灭剂对组织进行封固，在激光共聚焦显微镜下拍照观察增强型绿色荧光蛋白的绿色荧光表达情况。计算转染效率(即增强型绿色荧光蛋白阳性表达面积与主动脉斑块面积的百分比)。

Western blot检测动脉粥样硬化模型ApoE ^-^/^-小鼠主动脉组织中增强型绿色荧光蛋白表达：收集主动脉组织，用液氮研磨法研磨后提取总蛋白，采用BCA蛋白定量分析试剂盒对各提取蛋白进行蛋白定量，进行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)，将蛋白按照40 μg的上样量加入各孔中，100 V恒压电泳30 min，待所有的样品跑过积层胶后，再以120 V恒压电泳约至1.5 h，电泳结束后，将凝胶蛋白转移至0.45 μm的PVDF膜上，以100 mA恒流转膜2 h。经0.5 mL/L TBST配制的体积分数5%脱脂牛奶室温封闭2 h后，分别与绿色荧光蛋白及GAPDH一抗(以 1∶1 000与体积分数5%牛血清蛋白进行稀释)，添加抗体后于4 ℃孵育过夜。次日以0.05%TBST洗膜3次，每次10 min，添加相应二抗，室温孵育2 h后以0.05%TBST洗膜3次，滴加显色液及显影后，Bio-Rad成像系统拍照，Image Lab 4.0软件(Bio-Rad公司)测定条带绿色荧光蛋白与内参GAPDH的吸光度值，以两者的平均吸光度比值表示目的蛋白表达水平。实验重复3次。

主要观察指标：主动脉斑块组织中增强型绿色荧光蛋白的表达水平。

统计学分析：实验结果均采用SPSS 18.0软件(美国SPSS公司)进行统计分析，计量资料以x(_)±s表示，多组间数据比较采用单因素方差分析，以P < 0.05为差异有显著性意义。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：肾移植；肝移植；移植；心脏移植；组织移植；皮肤移植；皮瓣移植；血管移植；器官移植；组织工程

全文链接：

讨论

在医学研究领域中，腺相关病毒被用于多种疾病的基因治疗的研究(包括体内、体外实验)。腺相关病毒自1984年首次使用以来，一直被认为是一种有效的基因治疗载体^[21]。研究发现，腺相关病毒在体内实验心脏组织中的表达更有效和持久稳定，病毒表达可持续3个月以上，和腺病毒载体相比具有显著优点^[22]。

目前腺相关病毒可分为1-9型腺相关病毒，共9种血清型，不同的血清型具有不同的组织嗜向性，研究表明，腺相关病毒9对心肌有很强的靶向亲和力，是目前心脏疾病基因治疗的最佳载体^[23-26]。课题组前期报道，rAAV9-eGFP可在小鼠心脏中和大鼠心肌细胞中高效表达^[27-29]，证实rAAV9-eGFP对心肌具有较高的转染效率，是心脏疾病基因传递的理想载体，所以目前有关腺相关病毒9的研究主要是在心脏组织中。而对主动脉血管的研究相对较少，尤其是在动脉粥样硬化模型小鼠的主动脉血管中。Baker等^[30]报道采用腺相关病毒转导于动脉壁中相对比较困难。有相关研究发现，腺相关病毒9可在C57BL/10小鼠主动脉中表达，但和其他组织相比表达效率较低^[31]。与Baker等报道基本一致。目前国内外尚缺少此方面的研究。

自1992年由PIump等^[32]利用胚胎干细胞基因敲除技术成功培育出ApoE^-^/^-小鼠以来，ApoE^-^/^-小鼠广泛应用于动脉粥样硬化病理过程和药物干预的研究中^[33]。载脂蛋白是多种与脂蛋白摄入相关的低密度脂蛋白受体基因家族的重要配体，载脂蛋白缺失导致酯化胆固醇颗粒的聚集。ApoE^-^/^-小鼠动脉粥样硬化病变处细胞类型如巨噬细胞、T 细胞和平滑肌细胞等与人类近似，且动脉粥样硬化病变遍布动脉树，在动脉粥样硬化研究领域中发挥着重要作用^[34]。高脂饮食喂养ApoE^-^/^-小鼠，形成脂质条纹和纤维增生病变的时间较常规饮食组或同龄同性别C57BL/6J小鼠更快^[20,35-37]，并且血脂水平与正常小鼠比较显著升高^[38]。因此ApoE^-^/^-小鼠是动脉粥样硬化研究领域最强有利的模型^[39-41]。

实验采用重组9型腺相关病毒为载体，以增强型绿色荧光蛋白为报告基因，将rAAV9-eGFP转染到动脉粥样硬化ApoE^-^/^-小鼠主动脉中，观察rAAV9-eGFP对主动脉的转染情况及最佳表达时间点，以评价载体转导的靶向性和有效性。实验通过5.0×10¹¹vg/只的rAAV9-eGFP转染于动脉粥样硬化模型主动脉中，病毒转染后连续观察至60 d，实验结果表明，rAAV9-eGFP随着转染时间的延长而逐渐增强。在激光共聚焦显微镜下观察在表达转染14 d后可见少量rAAV9-eGFP阳性表达，随着时间逐渐增加，于转染35 d时绿色荧光表达达到高峰，荧光强度也逐渐增强，随后绿色荧光一直表达至60 d，仍有较强的绿色荧光，表明rAAV9-eGFP可在主动脉斑块内长期稳定表达，而未转染病毒的生理盐水组的血管未检测到绿色荧光。

由于主动脉的管壁较厚，含有丰富的弹性纤维，具有可扩张性和弹性^[42]，所以在观察荧光表达时可表现出自发荧光。实验采用滂胺天空蓝溶液处理后，增强型绿色荧光蛋白本身转染的绿色荧光清晰可见，消除了血管的自发荧光，而未经滂胺天空蓝处理的血管可出现很强的自发荧光，结果与刘春喜等^[42]报道的研究相一致。证实应用滂胺天空蓝后可消除血管自发荧光，是一种理想的去除自发荧光的方法。

实验结果显示rAAV9-eGFP转染动脉粥样硬化模型的主动脉后，Western blot 检测表明增强型绿色荧光蛋白可在主动脉血管内正确表达，其表达情况与激光共聚焦显微镜观察结果一致，亦随着转染时间的延长表达逐渐增强，各时间点之间比较有显著差异。

综上所述，动脉粥样硬化的形成与发展是一个慢性的过程，而rAAV9-eGFP病毒载体可在动脉粥样硬化模型小鼠主动脉血管中长期稳定的表达外源基因，所以rAAV9-eGFP可成为动脉粥样硬化基因治疗的最佳载体，为基因靶向干预治疗动脉粥样硬化提供新的思路和理论依据。

实验在体内水平证实rAAV9-eGFP对动脉粥样硬化模型小鼠主动脉有表达作用，没有评价病毒对主动脉血管的安全性，存在一定的局限性，这为下一步实验指明了方向。

重组9型腺相关病毒载体转染动脉粥样硬化模型小鼠主动脉：最佳在体表达时间点的确定

Recombinant adeno-associated virus serotype 9 transfection of atherosclerosis mice: determination of the optimal expression time in vivo

PDF

可视化

摘要/Abstract

引用本文

使用本文

图/表（结果） 4

参考文献

相关文章 15

引言

材料方法

讨论

文章快阅

延伸阅读

编辑推荐

Metrics

本文评价

[1]	程明光, 张超宇, 庄康乐, 阮鹏, 左逸, 周正春, 孔祥, 葛建军, 程光存. 体外构建Stanford A型主动脉夹层3D三维动态模拟图及个体化组织工程血管[J]. 中国组织工程研究, 2023, 27(3): 335-338.
[2]	宗明锐, 刘海燕, 李冰, 武秀萍. 羧甲基壳聚糖在口腔组织工程中的应用[J]. 中国组织工程研究, 2023, 27(3): 447-452.
[3]	欧航君, 赵广建, 潘裕佳, 龚才伟, 赵权威, 刘大男. 构建Ⅲ型纤连蛋白结构域包含蛋白5过表达慢病毒载体抑制内皮细胞凋亡[J]. 中国组织工程研究, 2023, 27(2): 216-222.
[4]	杨丽娟, 姚娜, 鲁睿文, 刘晓宇, 王宝军. 博来霉素联合血管紧张素Ⅱ建立小鼠主动脉夹层模型[J]. 中国组织工程研究, 2023, 27(14): 2194-2199.
[5]	马雯晴, 张惠荣, 刘辉, 董丽丽, 杨眷娣. 敲低NIPBL基因调控小鼠骨髓间充质干细胞向软骨的分化[J]. 中国组织工程研究, 2023, 27(10): 1477-1483.
[6]	谢梦生, 龙燕鸣, 李晓捷. 慢病毒下调酪蛋白激酶2相互作用蛋白1表达的骨髓间充质干细胞修复骨质疏松大鼠牙槽骨缺损[J]. 中国组织工程研究, 2023, 27(10): 1528-1533.
[7]	赵菊芬, 马荣, 曹佳, 于传扬, 陶翔, 王嘉, 王立斌. 过氧化物酶体增殖物激活受体γ共激活因子1β对乳腺癌干细胞干性表达的调控[J]. 中国组织工程研究, 2023, 27(1): 59-65.
[8]	李为明, 许青文, 李奕俊, 孙岩波, 崔进, 徐鹏远. 深层海水通过激活PI3K/Akt通路促进糖尿病小鼠创伤的愈合[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(5): 724-729.
[9]	邹明明, 倪莉, 周立宇, 李迪, 赛吉拉夫, 韦善文, 张鹏飞. 子宫内电穿孔转染胎鼠脑室管膜下区神经干细胞的条件优化[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(30): 4879-4883.
[10]	颉丽英, 刘司麒, 吴明芮, 高尔和, 韩之波, 左琳. 人脐带间充质干细胞移植治疗心肌肥厚模型小鼠[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(30): 4826-4833.
[11]	王丹丹, 禹亚彬, 刘世奇, 严雨楼, 张建淮. 人脐带间充质干细胞向肝细胞分化过程中长链非编码RNA核富集转录本1的作用[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(30): 4847-4851.
[12]	田敏, 刘玉婷, 谢立科, 曹阳, 吕红彬. 叔丁基对苯二酚对2型糖尿病模型大鼠各器官的保护作用[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(29): 4616-4623.
[13]	孙锦鹏, 刘军, 白云峰, 华峰, 王浩然, 郑宏瑞, 吴涛. 细胞信号转导抑制因子3影响青少年特发性脊柱侧凸畸形软骨内的成骨活性[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(26): 4160-4165.
[14]	马静, 郑利萍, 孙吉, 杨晓琴, 蒲林云, 袁暾, 梁洁. 胸主动脉共用覆膜和裸支架系统体内血栓形成的评价[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(22): 3474-3479.
[15]	郭晓鹏, 刘莹松, 尚晖. 丝素蛋白/纳米羟基磷灰石/淫羊藿苷可促进移植骨髓间充质干细胞增殖分化为髓核样细胞[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(22): 3528-3534.