放射性心脏损伤模型大鼠接受吡格列酮干预的心脏保护作用

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2015.05.004

中国组织工程研究 ›› 2015, Vol. 19 ›› Issue (5): 674-680.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.2015.05.004

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放射性心脏损伤模型大鼠接受吡格列酮干预的心脏保护作用

宋扬，吴荣，曾越灿，张振勇，杜红梅

中国医科大学附属盛京医院第二肿瘤病房，辽宁省沈阳市 110022

修回日期:2014-11-27 出版日期:2015-01-30 发布日期:2015-03-02
通讯作者: 吴荣，博士，教授，中国医科大学附属盛京医院第二肿瘤病房，辽宁省沈阳市 110022
作者简介:宋扬，女，1988年生，辽宁省朝阳市人，汉族，2014年中国医科大学毕业，硕士，医师，主要从事恶性肿瘤放化疗的治疗。
基金资助:
国家自然科学基金项目(81201803)

Protective effect of pioglitazone in rat models of radiation-induced heart injury

Song Yang, Wu Rong, Zeng Yue-can, Zhang Zhen-yong, Du Hong-mei

Second Ward of Oncology Department, Shengjing Hospital of China Medical University, Shenyang 110022, Liaoning Province, China

Revised:2014-11-27 Online:2015-01-30 Published:2015-03-02
Contact: Wu Rong, M.D., Professor, Second Ward of Oncology Department, Shengjing Hospital of China Medical University, Shenyang 110022, Liaoning Province, China
About author:Song Yang, Master, Physician, Second Ward of Oncology Department, Shengjing Hospital of China Medical University, Shenyang 110022, Liaoning Province, China
Supported by:
the National Natural Science Foundation of China, No. 81201803

摘要/Abstract

摘要：

背景：激活过氧化物酶体增殖物活化受体γ信号途径在心血管系统有许多正效应。血管紧张素Ⅱ与心肌的纤维化密切相关，然而却很少有研究关注激活过氧化物酶体增殖物活化受体γ途径能否通过减弱血管紧张素Ⅱ的表达从而改善放射性心肌损伤。
目的：探索激活过氧化物酶体增殖物活化受体γ后血管紧张素Ⅱ 1型受体对放射性心脏损伤模型大鼠的作用。
方法：60只大鼠随机等分为对照组、吡格列酮组、模型组及照射+低、高剂量吡格列酮组。模型组及照射+低、高剂量吡格列酮组大鼠采用前后对穿照射方法接受6 MV高能X射线照射野心前1.5 cm×1.5 cm，照射剂量300 cGy/min。照射完后6 h时，低、高剂量吡格列酮组大鼠分别接受10，20 mg/kg吡格列酮灌胃，此后每天灌胃1次，连续灌胃30 d；模型组大鼠灌胃2 mL蒸馏水。吡格列酮组大鼠在对应时间灌胃10 mg/kg吡格列酮。
结果与结论：给予吡格列酮干预后，受照射大鼠的心脏组织损伤减轻，心脏纤维化减轻，心脏组织中血管紧张素Ⅱ 1型受体蛋白及mRNA表达水平减少。提示吡格列酮干预可降低血管紧张素Ⅱ1型受体在大鼠放射性心脏损伤中的表达，提示激活过氧化物酶体增殖物活化受体γ途径可能对放射性心脏损伤有保护作用。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：肾移植；肝移植；移植；心脏移植；组织移植；皮肤移植；皮瓣移植；血管移植；器官移植；组织工程

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关键词: 实验动物, 心脏及血管损伤动物模型, 放射治疗, 放射性心肌损伤, 过氧化物酶体增殖物活化受体γ, 过氧化物酶体增殖物活化受体γ激动剂, 吡格列酮, 血管紧张素Ⅱ, 血管紧张素Ⅱ1型受体, 国家自然科学基金

Abstract:

BACKGROUND: There are many positive effects by activation of peroxisome proliferator activated receptor-gamma (PPARγ) signal pathway in cardiovascular system. Angiotensin II is closely related with myocardial fibrosis, however, there are few articles demonstrating that the activation of PPARγ signal pathway can weaken the expression of angiotensin II to improve the radiation-induced heart injury.
OBJECTIVE: To evaluate the effect of angiotensin II type 1 receptor in the rat model of radiation-induced heart injury after PPARγ signal pathway is activated.
METHODS: Sixty rats were randomly and equally divided into five groups: control, pioglitazone, model, radiation + low-dose pioglitazone, radiation + high-dose pioglitazone. In the model, radiation + low-dose pioglitazone, radiation + high-dose pioglitazone groups, rats received 6 MV high energy X-ray irradiation at the range of 1.5 cm × 1.5 cm and the irradiation dose of 300 cGy/min, for 6 hours. Furthermore, rats in the radiation + low-dose pioglitazone and radiation + high-dose pioglitazone groups were given 10 and 20 mg/kg pioglitazone by lavage, for 30 days; rats in the model group were given 2 mL distilled water. In the pioglitazone group, rats were treated with 10 mg/kg pioglitazone by lavage.
RESULTS AND CONCLUSION: After rats were treated with pioglitazone, the heart injury and the heart fibrosis in the irradiated rats were decreased. The expressions of angiotensin II type 1 receptor mRNA and protein in the heart tissue were down-regulated. Experimental findings indicate that, pioglitazone intervention downregulates the expression of angiotensin II type 1 receptor in the rat models of radiation-induced heart injury and activation of PPARγ signal pathway alleviates the radiation-induced heart injury.

中国组织工程研究杂志出版内容重点：肾移植；肝移植；移植；心脏移植；组织移植；皮肤移植；皮瓣移植；血管移植；器官移植；组织工程

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Key words: Radiotherapy Injury, Heart Injury, Angiotensin II, Peroxisome Proliferator Activated Receptor

中图分类号:

R318

宋扬，吴荣，曾越灿，张振勇，杜红梅. 放射性心脏损伤模型大鼠接受吡格列酮干预的心脏保护作用[J]. 中国组织工程研究, 2015, 19(5): 674-680.

Song Yang, Wu Rong, Zeng Yue-can, Zhang Zhen-yong, Du Hong-mei. Protective effect of pioglitazone in rat models of radiation-induced heart injury[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2015, 19(5): 674-680.

图/表（结果） 5

2.1 实验动物数量分析 除对照组和模型组分别死亡1，2只大鼠外，其余大鼠均进入结果分析。

2.2 吡格列酮对放射性心脏损伤大鼠心脏组织病理变化的影响 常规苏木精-伊红染色显示，接受照射的大鼠心脏组织出现较为明显的组织损伤，心肌细胞排列紊乱，部分细胞出现变性及坏死，细胞核排列不规则，而接受吡格列酮干预的大鼠心脏组织损伤程度较模型组减轻(图2)。

Masson染色结果显示，照射后大鼠心脏组织纤维化明显，与模型组相比，接受吡格列酮干预的大鼠纤维化程度明显减轻(P < 0.05)，其中高剂量的吡格列酮干预的效果更明显(图2，表1)。

2.3 吡格列酮对放射性心脏损伤大鼠心脏组织中血管紧张素Ⅱ 1型受体表达水平的影响 免疫组化染色结果显示，与对照组及吡格列酮组相比，照射后大鼠心脏组织中血管紧张素Ⅱ 1型受体表达明显增加；而与模型组相比，照射+低剂量吡格列酮组与照射+高剂量吡格列酮组大鼠心脏组织中血管紧张素Ⅱ 1型受体表达减少，提示吡格列酮在放射性心脏损伤中具有保护作用(图3)。

Western blot结果显示，在相对分子质量43 000-50 000附近有明显蛋白表达条带，与对照组及吡格列酮组相比，模型组大鼠心脏组织中血管紧张素Ⅱ 1型受体蛋白表达水平明显增加(P < 0.05)，而与模型组相比，照射+低剂量吡格列酮组与照射+高剂量吡格列酮组大鼠心脏组织中血管紧张素Ⅱ 1型受体表达水平减少(P < 0.05)，且照射+ 低剂量吡格列酮组大鼠心脏组织中血管紧张素Ⅱ 1型受体蛋白表达水平较照射+高剂量吡格列酮组高(P < 0.05)，但2组仍高于对照组及吡格列酮组(P < 0.05)，见图4。

2.4 吡格列酮对放射性心脏损伤大鼠心脏组织中血管紧张素Ⅱ 1型受体mRNA表达水平的影响 实时荧光定量反转录PCR结果显示，与对照组及吡格列酮组相比，模型组大鼠心脏组织中血管紧张素Ⅱ 1型受体mRNA表达水平明显增加(P < 0.05)，而与模型组相比，照射+低剂量吡格列酮组与照射+高剂量吡格列酮组大鼠心脏组织中血管紧张素Ⅱ 1型受体mRNA表达水平减少(P < 0.05)，且照射+低剂量吡格列酮组大鼠心脏组织中血管紧张素Ⅱ 1型受体mRNA表达水平较照射+高剂量吡格列酮组高(P < 0.05)，但2组仍高于对照组及吡格列酮组(P < 0.05；图5)。血管紧张素Ⅱ 1型受体mRNA表达水平变化与蛋白的表达变化一致。

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引言

放射治疗是治疗恶性肿瘤的必不可少手段，尤其是对于食管癌、乳腺癌、肺癌、纵隔肿瘤等。现代放疗技术的进展虽明显减少了心脏的受照射范围及剂量，然而最近的研究表明，放疗时患有胸腔内或胸壁肿瘤的患者一小部分心脏始终能接受到高剂量，或是整个心脏接受到较低剂量的射线，从而导致放射性心脏损伤^[1-6]，包括心包疾病、瓣膜功能不全、心肌病、传导异常及冠状动脉疾病等。其损伤的机制很复杂，但主要机制是微小血管及冠状动脉的内皮损伤，从而导致心肌细胞纤维化^[7-13]。在大多数实验动物模型中，许多研究表明过氧化物酶体增殖物活化受体γ激动剂能通过介导氧化应激反应抑制许多器官的炎症及纤维化反应^[14]，如肺及心血管系统^[15-17]。作者所在课题组前期研究显示，过氧化物酶体增殖物活化受体γ作为一种纤维化保护蛋白，在放射性心肌纤维化中出现了明显的表达上调，这表明过氧化物酶体增殖物活化受体γ参与了大鼠心脏放射性损伤的形成过程，并且与照射后的心肌纤维化有着密切的联系，但过氧化物酶体增殖物活化受体γ作为一种保护性蛋白，在未用体外激动剂的情况下，其生理性升高不足以抑制致纤维化蛋白的活性。

血管紧张素Ⅱ和醛固酮在常见的心血管疾病中也发挥着重要作用^[18]。在高血压和慢性缺血的心脏重建过程中，由血管紧张素Ⅱ和醛固酮介导的成纤维细胞的增殖及Ⅰ型胶原的合成被认为是很重要的过程。实验表明噻唑烷二酮类(过氧化物酶体增殖物活化受体γ激动剂吡格列酮，罗格列酮等)被报道能减轻经历缺氧-再氧合或用血管紧张素Ⅱ处理的人心脏成纤维细胞的增殖，并且能减少Ⅰ型胶原及基质金属蛋白酶1的表达^[19]。作者所在课题组也有研究表明，血管紧张素Ⅱ-醛固酮系统在心脏放射性损伤中起着重要的病理生理作用^[20-22]。血管紧张素Ⅱ主要与2个受体结合：血管紧张素Ⅱ 1型受体和血管紧张素Ⅱ 2型受体，一般认为，血管紧张素Ⅱ主要是通过激活血管紧张素Ⅱ 1型受体而发挥病理生理作用的^[22]。因此，实验将探索吡格列酮激活过氧化物酶体增殖物活化受体γ后血管紧张素Ⅱ 1型受体在大鼠放射性心脏损伤中的表达变化及意义。

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材料方法

设计：随机对照动物实验。

时间及地点：实验于2013年4月至2014年1月在中国医科大学实验研究中心完成。

材料：

动物：SPF级SD大鼠60只，雌雄各半，鼠龄3个月，体质量178-245 g，购自中国医科大学实验动物中心，动物质量合格证号：SCXK(京)2009-0015；实验单位使用动物许可证号：SYXK(辽)2010-0008。大鼠在SPF级实验室饲养，温度20-25 ℃，湿度50%-55%，光照150 Lux。实验已获得中国医科大学动物伦理委员会的批准。

药物：吡格列酮，片剂，购自杭州中美华东制药有限公司，批准文号：国药准字H20050500。将吡格列酮溶解在蒸馏水中，按1 g/L药物浓度配制。

方法：

实验动物分组：将60只大鼠应用随机数字表法随机分为5组：对照组、吡格列酮组、模型组及照射+低、高剂量吡格列酮组，每组12只。

放射性心脏损伤动物模型的建立：模型组及照射+低、高剂量吡格列酮组大鼠给予水合氯醛(3 mL/kg)腹腔注射麻醉，麻醉后心脏彩超定位，放置于直线加速器(德国西门子公司)下照射。使用6 MV高能X射线，采用前后对穿照射的方法，源皮距100 cm，心脏彩超扫描确定照射野心前区1.5 cm×1.5 cm(图1)，照射剂量300 cGy/min。

药物干预：照射完后6 h时，低、高剂量吡格列酮组大鼠分别接受10，20 mg/kg吡格列酮灌胃，此后每天灌胃1次，每7 d测量一次体质量，根据体质量的改变调整吡格列酮的灌药量，连续灌胃30 d，分笼饲养。模型组大鼠灌胃2 mL蒸馏水。吡格列酮组大鼠在对应时间灌胃10 mg/kg吡格列酮。

取材：照射后3个月，水合氯醛过量麻醉处死大鼠，取其心脏组织，用生理盐水洗净血液后，用剪刀将其横断，一半迅速放于体积分数4%中性甲醛固定液中固定，48 h后转入体积分数70%乙醇中保存；另一半放入-80 ℃深冻冰箱中保存。

苏木精-伊红染色：将固定好的心脏组织修材、脱水、透明、包埋制成蜡块，切片，厚度约4 µm。60 ℃预热10- 20 min。常规脱蜡水合。苏木精复染1-10 min，水洗。盐酸乙醇分化。水洗返蓝。伊红溶液复染。梯度乙醇脱水，二甲苯透明，中性树胶封固^[23]。

Masson染色：将固定好的心脏组织修材、脱水、透明、包埋制成蜡块，切片，厚度约4 µm。固定于Bouin氏液(苦味酸饱和液(1.22%)75 mL+甲醛25 mL+冰醋酸5mL)，流水冲洗过夜，常规脱水包埋。切片脱蜡至水；Weiger氏铁苏木精染5-10 min。流水稍洗。盐酸乙醇分化1 min。流水冲洗。丽春红酸性品红液染5-10 min。蒸馏水稍冲洗。1%磷钼酸水溶液处理约5 min。苯胺蓝液或绿液复染5 min。体积分数1%冰醋酸处理1 min。梯度乙醇脱水，二甲苯透明，中性树胶封固^[24]。所有切片观察分别由2人独立在光镜下完成，每人均选择10个具有代表性的400倍视野，首先计数免疫组化标记定位准确的阳性细胞占总细胞比例(%)并记分。0：0-9%；1：10%-39%；2：40%-69%；3：70%-89%；4：90%-100%。其次，按染色强度(Ⅰ)进行评分。0：没有染色；1：弱，但明确的染色；2：中度染色；3：显着的染色；4：强染色，然后由公式(% ×Ⅰ)来计算总得分，平均主观得分由非参数Kruskal-Wallis检验分析^[16]。

免疫组织化学观察大鼠心脏组织血管紧张素Ⅱ 1型受体表达：按SP法进行免疫组化染色^[25]，染色步骤按说明书进行，抗体的工作浓度为1∶320。用PBS代替一抗作阴性对照，用预试验中已知的阳性片作阳性对照。

Western blot法检测大鼠心脏组织血管紧张素Ⅱ 1型受体表达：提取大鼠心脏组织蛋白并测定蛋白浓度，SDS-PAGE凝胶电泳，转膜，5%脱脂牛奶封闭2 h。兔抗血管紧张素Ⅱ 1型受体单克隆抗体(1∶2 000；北京博奥森生物技术有限公司)孵育PVDF，4 ℃过夜；1×TBST洗5 min ×5次；将HRP标记山羊抗兔IgG抗体(1∶2 000；北京中杉金桥有限公司)室温孵育2 h；1×TBST洗5 min×5次；ECL显影；以GAPDH作为内参照物。实验重复3次。

实时荧光定量反转录PCR检测大鼠心脏组织血管紧张素Ⅱ 1型受体 mRNA表达水平：血管紧张素Ⅱ 1型受体上游引物：5’-CCC TGG CTG ATT TAT GCT TT-3’，下游引物：5’-TTA CAT AGG TGG TTG CCG AA-3’，扩增片段长度：162 bp；GAPDH上游引物：5’-TGA CAT CAA GAA GGT GGT GA-3’，下游引物：5’-TCA TAC CAG GAA ATG AGC TT-3’，扩增片段长度：177 bp。实验步骤按说明书(日本Takara公司)进行。

主要观察指标：大鼠心肌细胞中的血管紧张素Ⅱ 1型受体蛋白及mRNA的表达情况。

统计学分析：采用SPSS 13.0统计学软件进行数据处理。数据以x(_)±s表示，多个样本均数间的比较采用方差分析；非正态资料采用非参数检验，结果以α=0.05为检验水准。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：肾移植；肝移植；移植；心脏移植；组织移植；皮肤移植；皮瓣移植；血管移植；器官移植；组织工程

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目前认为放射性心脏损伤是心脏在胸部接受放射治疗的过程中，不可避免地受到不同程度的照射，产生的生理及病理改变。本课题组前期的研究证明，大鼠的心脏在15-20 Gy照射后，放射性心脏疾病在1-3个月的照射后出现，疾病的严重程度和照射剂量、照射范围、射线种类、个体差异及照射后的时间等相关^[20-22]。过氧化物酶体增殖物活化受体是一类由配体激活的核转录因子，是核受体超家族中的一个亚家族，目前认为过氧化物酶体增殖物活化受体共有3种亚型，即α、β/δ及γ^[26]。过氧化物酶体增殖物活化受体γ主要在脂肪细胞及免疫细胞中表达，参与脂类代谢及脂肪细胞分化^[27-29]。过氧化物酶体增殖物活化受体γ与多种疾病密切相关，如动脉粥样硬化、肿瘤及糖尿病等。过氧化物酶体增殖物活化受体的激动剂可以调节脂类代谢及胰岛素的敏感性，作为治疗糖尿病药物，其已被广泛应用于临床。然而实验发现过氧化物酶体增殖物活化受体也在肺脏、心脏及肝脏等器官中具有抗炎及抗纤维化的作用^[30-33]。Fliegner等^[34]通过构建大鼠心肌梗死模型，发现过氧化物酶体增殖物活化受体γ蛋白在心肌梗死区域表达上调，并且主要在心肌细胞和成纤维细胞中表达。作者所在课题组通过构建放射性心脏损伤的大鼠模型，发现过氧化物酶体增殖物活化受体γ作为一种保护性蛋白，与放射性心脏损伤负相关，在未用体外激动剂的情况下，过氧化物酶体增殖物活化受体γ生理性升高不足以抑制致纤维化蛋白的活性^[20]。令人惊喜的是，Chintalgattu等^[35-37]研究发现，对心肌梗死大鼠应用过氧化物酶体增殖物活化受体γ激动剂曲格列酮可以降低大鼠心脏成纤维细胞中的血管内皮生长因子的表达并抑制炎性因子的产生，减少炎症因子的活性，预防血管紧张素Ⅱ与其受体的结合，从而降低心脏纤维化的产生。这些结果提示过氧化物酶体增殖物活化受体γ在心脏疾病中对心肌细胞可以起到保护作用。在放射性心脏损伤的大鼠模型中应用过氧化物酶体增殖物活化受体γ激动剂的意义目前尚未有报道。

肾素血管紧张素系统在多种生理、病理条件下有重要作用，体现在血压调节^[38]、血管平滑肌细胞增殖及炎症反应^[39]。血管紧张素Ⅱ是肾素血管紧张素系统中主要的活性肽，是一个已知的调节血压的生物活性物质，在心血管疾病中起着十分重要的病理生理作用，这些心血管疾病包括高血压、心力衰竭、动脉粥样硬化、心肌梗死和心脏肥大等。血管紧张素Ⅱ是肾素血管紧张素醛固酮系统的重要组成部分，它可以促进血管内皮细胞增生，诱导细胞迁移，引导胶原沉积，最终导致纤维化的病理过程^[40-42]。血管紧张素Ⅱ的细胞效应至少由2种细胞亚型介导，血管紧张素Ⅱ 1型受体和血管紧张素Ⅱ2型受体，它们是7次跨膜G蛋白偶联受体亚家族的成员^[43]。血管紧张素Ⅱ主要通过血管紧张素Ⅱ1型受体参与调解血压稳态及血管平滑肌细胞增殖^[44]。越来越多的证据表明，血管紧张素Ⅱ通过多种途径和机制影响心血管系统。血管紧张素Ⅱ可以通过反应性氧物诱导多效应性血管反应^[45-46]。反应性氧物的产生由NADPH驱动，反应氧起着细胞内、细胞外第二信使的作用，调节大量下游信号分子，如蛋白酪氨酸磷酸酶、蛋白酪氨酸激酶、转录因子、有丝分裂原激活蛋白激酶以及离子通道^[37]。激活血管紧张素Ⅱ1型受体可以增加Ca²⁺内流，内流Ca²⁺的移动会激活急性应答过程，如血管平滑肌收缩；同时，激活血管紧张素Ⅱ1型受体可以触发多个复杂的相互作用的细胞信号传导途径诱导细胞增殖、肥大，包括通过磷脂酶C、磷脂酶D、磷脂酶A2的信号活化，通过内皮生长因子、血小板源性生长因子和胰岛素样生长因子受体的受体酪氨酸激酶的活化。配体和血管紧张素Ⅱ 1型受体结合也会诱导非受体酪氨酸激酶的活化，这些激酶有c-src激酶、局灶性粘附激酶(FAK)和富脯氨酸酪氨酸激酶2^[40]。血管紧张素Ⅱ通过刺激其他生长因子、血管收缩因子的生成而起着介导炎性介质的作用，通过诱导前列腺素和血管内皮生长因子的释放来提高血管的渗透性，或者通过诱导细胞骨架蛋白的重排来提高血管的通透性，从而触发炎症过程。由此可见，血管紧张素Ⅱ是通过多种途径和机制影响心血管系统，而这些途径和机制也有重叠和交叉的地方。本课题组研究发现，血管紧张素Ⅱ-醛固酮在放射性心脏损伤中扮演着重要的生理病理作用^[21]。

心肌纤维化的发生和发展是一个复杂的过程，Zhao等^[41]证明激活过氧化物酶体增殖物活化受体γ途径可以通过下调血管紧张素Ⅱ 1型受体表达而减弱血管紧张素Ⅱ诱导的胶原合成导致的纤维化，从而在受体水平抑制肾素-血管紧张素系统的活性。

实验结果显示，应用吡格列酮干预后可以减轻放射性损伤模型大鼠的心脏损伤、心脏纤维化减轻，且心脏组织血管紧张素Ⅱ 1型受体mRNA和蛋白表达水平减少，且随着给药剂量的增加，这种作用越明显。表明吡格列酮能通过它的抗纤维化作用降低了血管紧张素Ⅱ 1型受体的表达，减轻大鼠的放射性心脏损伤，第一次在放射性心脏损伤的大鼠模型中证实了激活过氧化物酶体增殖物活化受体γ途径可以下调血管紧张素Ⅱ 1型受体表达，而减弱血管紧张素Ⅱ诱导的胶原合成导致的纤维化。

综上所述，吡格列酮干预可降低血管紧张素Ⅱ 1型受体在大鼠放射性心脏损伤中的表达，提示激活过氧化物酶体增殖物活化受体γ途径可能对放射性心脏损伤有保护作用。但是具体通过何种信号通路及机制实现这一调节过程仍需更深入的研究。后续实验将进一步探讨应用过氧化物酶体增殖物活化受体γ拮抗剂与放射性心脏损伤的关系，为临床上预防及治疗放射性心脏损伤提供参考。

放射性心脏损伤模型大鼠接受吡格列酮干预的心脏保护作用

Protective effect of pioglitazone in rat models of radiation-induced heart injury

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