雌激素受体基因多态性与老年妇女的骨密度

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2015.02.004

摘要/Abstract

摘要：

背景：雌激素受体α基因多态性与骨质疏松的发生相关有一定的关系，但是对于危险基因型的研究还存在商榷余地。
目的：分析雌激素受体基因多态性与老年妇女骨密度的相关性。
方法：选择检查的老年健康妇女120例，提取全血基因组DNA，选择限制性内切酶PvuⅡ和XbaⅠ进行酶切，分析基因型的分布与频率。同时选择双能X射线骨密度仪测股骨颈、大转子及Ward三角处的骨密度值。
结果与结论：XbaⅠ酶切基因型XX 6例，Xx 78例，xx 36例；PvuⅡ酶切PP 32例，Pp 50例，pp 38例。不同基因型老年妇女的年龄、绝经年龄与体质量指数值对比差异无显著性意义(P > 0.05)。PvuⅡ酶切PP基因型妇女的大转子与ward三角处的骨密度值明显大于Pp及pp妇女(P < 0.05)；而XbaⅠ酶切基因多态性在老年妇女中股骨颈、大转子与Ward三角的骨密度均无显著差异(P > 0.05)。说明雌激素受体基因多态性与老年妇女骨密度有一定的相关性，P等位基因对老年妇女大转子与Ward三角处的骨密度的维持有一定作用。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

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关键词: 组织构建, 骨组织工程, 老年妇女, 骨质疏松症, 骨密度, 雌激素受体, 基因多态性

Abstract:

BACKGROUND: Estrogen receptor α gene polymorphisms is certainly associated with osteoporosis, but there is still questionable for the study of risk genotypes.
OBJECTIVE: To analyze the correlation between estrogen receptor gene polymorphism and bone mineral density in elderly women.
METHODS: Totally 120 healthy elderly women were enrolled to extract the whole blood genomic DNA that was digested using Pvu II and Xba I, the distribution and frequency of genotypes were analyzed. Meanwhile, dual-energy X-ray absorptiometry measurements of bone mineral density with the femoral neck, greater trochanter and Ward’s triangle and were done.
RESULTS AND CONCLUSION: Xba I digested genotypes included the XX in 6 cases, Xx in 78 cases, xx in 36 cases; Pvu II digested genotypes included the PP in 32 cases, Pp in 50 cases, pp in 38 cases. The age, menopause age and body mass index showed no differences among the different genotypes of elderly women (P > 0.05). The bone mineral density values in the trochanter and Ward’s triangle at Pvu II digested PP genotype were significantly greater than those at Pp and pp genotypes (P < 0.05); while no significant differences were found in the bone mineral density values at different Xba I digested genotypes in elderly women (P > 0.05). These findings suggest that estrogen receptor gene polymorphism has certain correlation with the bone mineral density in elderly women, P alleles has certain effect to maintain the bone mineral density of the trochanter and Ward’s triangle in elderly women.

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Key words: Receptors, Estrogen, Genes, Bone density, Osteoporosis, Aged

中图分类号:

R318

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图/表（结果） 2

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引言

老年妇女的卵巢功能开始减退，雌激素的合成也日渐减少，由此可给老年妇女带来心慌、潮热、盗汗、骨质疏松、失眠等症状。
    骨质疏松症多发病于骨脆性增加的老年人，其是一种以骨质低下和骨组织微结构退化为临床表现的骨代谢疾病，已成为全球性公共卫生问题之一^[1-2]。
    在骨质疏松的诊治中，临床表现很难进行明确诊断。而在生物学指标中，骨密度是反映骨质疏松症骨量减少的可靠指标，从而能够有效诊断骨质疏松症，骨密度降低会使骨质疏松性骨折危险增加^[3]。
    据统计，一般妇女在绝经后的5年内，每年丢失骨钙1.5%-2%：第6-10年，每年丢失1%-2%；第10-20年，每年丢失1%，也就使得这一人群成为骨质疏松的主要患者   源^[4]。随着人们生活水平的提高与老年妇女人口的增加，老年妇女骨质疏松症的发病情况受到了越来越多的关注^[5-7]。

已有的研究认为骨质疏松是一种多基因的疾病，受遗传和局部细胞因子等因素的控制，为此需要合理选择各种骨质疏松候选基因，从而有效评估骨质疏松性骨折的危险性^[8-9]。

雌激素受体是介导雌激素发挥生物效应的核内生物大分子，也是配体依赖转录活性因子超家族成员之一。其在生物组成中，雌激素受体有α、β两种亚型，二者区别在于其C末端配体结合区和N末端活性转化区不同。但目前对雌激素受体β所知甚少，文章所提到的雌激素受体即指雌激素受体α^[10-11]。

当前研究认为雌激素受体α基因多态性与骨质疏松的发生相关有一定的关系，但是对于危险基因型的研究还存在商榷余地^[12]，有报道PX基因型是骨质疏松的易感基因型，其中发现PpPX可降低骨质疏松的发病风险，但是对于XX基因型的研究也认为其为易感基因^[13-14]。

骨转换是极其复杂的生理过程，需要许多细胞、激素、细胞因子协同完成，细胞、激素、细胞因子中的任一环节的化都影响骨量的获得和骨转换的平衡。而细胞、激素、细胞因子相关环节显然都受控于基因，而受控于多基因的可能性要比单基因大。为此从基因角度探讨骨质疏松问题并对它的发生做出预测，就必须对相关基因的多态性进行全面研究。

本研究应用分子生物学PCR-RFLP方法分析了雌激素受体α受体的PvuⅡ和XbaⅠ两种酶切基因型分布的多态性，分析雌激素受体基因多态性与老年妇女骨密度的相关性，为预防老年妇女骨质疏松症提供参考，现报告如下。

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材料方法

1 对象和方法 Subjects and methods

设计：相关性分析。

时间及地点：观察对象来源于广东医学院附属福田医院2009年8月至2013年12月健康体检的老年妇女。

对象：随机选择本院检查的老年健康妇女120例，年龄60-76岁，平均(68.09±2.13)岁；绝经平均年龄为(53.23±3.76)岁；绝经年限为(14.98±6.34)年。

纳入标准：所有妇女无亲缘关系；详细询问既往史及进行体格检查；年龄≥60岁；知情同意；血、尿常规，肝、肾功能正常。

排除标准：风湿性关节炎、类风湿性关节炎和痛风性关节炎；创伤、畸形和疾病造成的软骨损害；肝、肾疾病、糖尿病、高血压；6个月内使用雌激素、糖皮质激素类药物。

材料：选择TaqDNA聚合酶为泰克金公司产品，限制性内切酶PvuⅡ和XbaⅠ为生工公司产品。

双能X射线骨密度仪(Lunar iDXA)为美国通用电器公司生产。

方法：

基因多态性分析：雌激素受体α受体的引物序列为：正向5’-CTG CCA CCC TAT CTG TAC TTT TCC TCT CC-3’，反向5’-TCT TTC TCT GCC ACC CTG GCG TCG ATT ATC TGA-3’。在检查中，首先配置快速提取全血基因组DNA的溶液，提取全血基因组DNA。然后进行常规的聚合酶链反应(PCR)，雌激素受体α受体反应体系共50 μL，组方：无菌去离子水34.3 μL，10×PCR缓冲液5 μL， 2.5 mmol/L dNTP 4 μL，引物20 pmol/L，模板DNA 100 ng，TaqDNA聚合酶1 U。反应条件：预变性94 ℃， 5 min；94 ℃ 30 s，60 ℃ 60 s，72 ℃ 90 s，共反应了25个循环，延伸72 ℃ 5 min。

在酶切反应中，选择限制性内切酶PvuⅡ和XbaⅠ内切酶进行单酶切，酶切产物经0.8%琼脂糖电泳，在紫外灯下进行观察。XbaⅠ酶切产物电泳出现3种带型(基因型)：XX 1条带(1 300 bp)，Xx 3条带(1 300 bp、900 bp、400 bp)，xx 2条带(900 bp、400 bp)。PvuⅡ酶切产物电泳出现3种带型(基因型)：PP 1条带(1 300 bp)，Pp 3条带(1 300 bp、850 bp、450 bp)，pp 2条带(850 bp、450 bp)。

骨密度分析：受试对象均采用仰卧位，选择双能X射线骨密度仪测量股骨颈、大转子及Ward三角处的骨密度值，测量3次，取平均值。

主要观察指标：①雌激素受体基因多态性的分布。②不同基因型老年妇女的一般资料对比。③不同基因型老年妇女的骨密度值对比。
统计学分析：选择SPSS 13.0软件进行分析，基因频率比较采用卡方检验。年龄、绝经年龄、骨密度与体质量指数值等计量资料以x(_)±s表示，以多种基因与骨密度及其Z值等之间的比较经秩和检验或者采用t 检验，以P < 0.05为显著性差异标准。

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讨论

妇女在绝经后特别是老年后，其雌激素的分泌量迅减，而雌激素又是钙吸收的必要物质。这就使得妇女在绝经后体钙的流失量迅增。骨质疏松症是发病率老年妇女的常见病，病理学与临床上主要表现为骨的微结构破坏、骨量减少、骨强度下降、脆性下降以至骨折危险性增加^[15]。骨质疏松症的致残率极高，严重影响患者的生活质量和劳动力，给家庭和社会带来了巨大的负面影响和沉重负担^[16-17]。

骨质疏松是一种复杂的、是发病基质还没有彻底被了解的骨代谢性疾病。该病涉及遗传、内分泌代谢疾病、运动医学和生物力学、妇科疾病、生物化学、分子生物学、老年病以及营养学、放射医学等。

研究表明，老年妇女绝经与骨质疏松症关系密切，人类成骨细胞及破骨细胞均存在雌激素受体，女性绝经后雌激素水平降低导致骨丢失加速是绝经后骨质疏松发病的主要原因，同时雌激素受体与骨质疏松有一定的关系^[18-19]。而雌激素与骨代谢有着密切的联系，它是女性一生用以维持优质健康骨骼的关键激素，能帮助钙的吸收，对骨生成产生直接作用，使骨吸收和重建达到平衡。而妇女进入老年期后，女性的卵巢功能开始减退，体内的雌激素水平下降，骨量开始丢失，从而影响了骨骼的健康。不仅如此，妊娠期及哺乳期的女性也面临着骨钙流失的风险，因此老年女性也应多补充钙，防止骨钙大量流失。

一般来说，低峰值骨量结合高骨丢失率可导致骨质疏松，而活动与负重、日光、种族和遗传因素、雌激素、甲状旁腺激素、降钙素、活性维生素D、甲状腺素、摄钙量低、微量元素缺乏、维生素缺乏、年龄和性别因素、孕娠因素等都与骨质疏松有关。

分子生物学研究表明雌激素受体位于胞核或胞浆内，当其与雌激素结合就可以形成二聚体，通过与靶基因中的雌激素反应元件(ERE)特异性结合，可刺激靶基因转录，从而促细胞增殖和分化，发挥相应的生物学功能^[20-22]。众所周知，在一种基因决定一种性状，而基因多态性使得同类基因对同一种信号的反应存在不同的差异。雌激素受体有α、β两种亚型，二者区别在于其C末端配体结合区和N末端活性转化区不同，本文选择的都是雌激素受体α类型^[23]。

研究表明雌激素受体基因的重要突变会导致骨质疏松，而雌激素受体基因多态性也可能与骨密度的大小有关，对于骨质疏松的影响也不相同^[24]。本文通过酶切分析显示PvuⅡ与XbaⅠ内切酶的应用均有3种结果：PP、Pp、pp；XX、Xx、xx，120例老年妇女多表现为Pp与Xx基因型。基因多态性分布频率与日本人、朝鲜人相似，而与欧美白人差异显著^[25]。并且不同基因型老年妇女的年龄、绝经年龄与体质量指数对比差异都无显著性意义(P > 0.05)，为下一步研究打下了基础。

骨质疏松症是一种累及骨、滑膜及关节周围支持结构的疾病，其严重受损可导致软骨变薄，从而引起关节损伤的加重。而人类成骨细胞及破骨细胞均存在雌激素受体，老年妇女绝经后雌激素水平降低导致骨丢失加速是绝经后骨质疏松发病的主要原因^[26]。

本文PvuⅡ酶切PP基因型妇女的大转子与ward三角处的骨密度值明显大于Pp及pp妇女(P < 0.05)，而XbaⅠ酶切基因多态性在老年妇女中股骨颈、大转子与Ward三角的骨密度均无显著差异(P > 0.05)。说明雌激素雌激素受体α的PP基因型的大转子与Ward三角的骨密度可能有一定的影响，而对其他部位的峰值骨密度无明显作用。

补充雌激素有助于预防骨质疏松，老年女性适当补充雌激素可以缓解这些症状，同时预防骨质疏松。但是补充雌激素也存在一定风险，若要补充一定要找到专科医生合理用药。另外，骨质疏松的发病机制是非常复杂的，治疗时不单是使用雌激素的问题，可能还需要钙剂、维生素D、降钙素等药物治疗。

研究显示糖尿病患者雌激素受体基因多态性与骨密度相关，健康对照组与糖尿病患者雌激素受体基因型分布有显著性差异，p、X等位基因对骨量具有保护作用，雌激素受体基因型与骨密度相关^[27]。而睾酮在大鼠骨代谢过程中不仅刺激骨形成，而且抑制骨吸收过程，比如雄性大鼠去睾28周后骨质疏松形成，生化检查示骨形成降低、骨吸收增加^[28]。

绝经后妇女随着年龄的增长、绝经年限的延长和绝经引起雌激素水平的下降，是绝经后妇女骨量丢失加速的重要病理生理机制之一^[29]。同时当前也有研究显示维生素D受体基因、胶原基因和白细胞介素6基因等编码的蛋白质，都参与了调控骨代谢活动^[30-31]。其中维生素D受体基因在不多的研究中就极其显著地表现出与骨量的相关性；胶原基因和白细胞介素6基因与骨转换的关系也与临床雌激素水平下降引起的高骨转换率相吻合^[31-33]，因此有必要进行下一步多方位研究。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

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