亚油酸与红细胞急性损伤：人工关节置换后隐性失血的发病机制

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2014.48.006

中国组织工程研究 ›› 2014, Vol. 18 ›› Issue (48): 7739-7744.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.2014.48.006

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亚油酸与红细胞急性损伤：人工关节置换后隐性失血的发病机制

袁涛¹，丛宇²，赵建宁^1，2，周利武²，陈双双³，包倪荣²

1南方医科大学南京临床学院，解放军南京军区南京总医院骨科，江苏省南京市 210002；2解放军南京军区南京总医院骨科，江苏省南京市 210002；3解放军第455医院眼科，上海市 200050

收稿日期:2014-09-19 出版日期:2014-11-26 发布日期:2014-11-26
作者简介:袁涛，男，1986年生，湖北省十堰市人，汉族，南方医科大学在读硕士，主要从事人工关节置换术围手术期及术后并发症的基础疾病研究。
基金资助:
江苏省临床科技基金(L2012002)；江苏省自然科学基金(BK2012776)

Linoleic acid and acute red blood cells injury: mechanism of hidden blood loss after artificial joint replacement

Yuan Tao¹, Cong Yu², Zhao Jian-ning^{1, 2}, Zhou Li-wu², Chen Shuang-shuang³, Bao Ni-rong²

1Department of Orthopedics, Nanjing School of Clinical Medicine, Southern Medical University, Nanjing General Hospital of Nanjing Military Region of Chinese PLA, Nanjing 210002, Jiangsu Province, China; 2Department of Orthopedics, Nanjing General Hospital of Nanjing Military Region of Chinese PLA, Nanjing 210002, Jiangsu Province, China; 3Department of Ophthalmology, the 455 Hospital of Chinese PLA, Shanghai 200050, China

Received:2014-09-19 Online:2014-11-26 Published:2014-11-26
About author:Yuan Tao, Studying for master’s degree, Department of Orthopedics, Nanjing School of Clinical Medicine, Southern Medical University, Nanjing General Hospital of Nanjing Military Region of Chinese PLA, Nanjing 210002, Jiangsu Province, China
Supported by:
Clinical Science and Technology Foundation of Jiangsu Province, No. L2012002; Natural Science Foundation of Jiangsu Province, No. BK2012776

摘要/Abstract

摘要：

背景：隐性失血常见于人工关节置换后，所造成的术后贫血严重影响患者康复，关于隐性失血的原因说法有很多，但机制尚不明确。
目的：研究亚油酸对大鼠血液中红细胞的影响，探讨人工关节置换后隐性失血的发病机制。
方法：将50只SD大鼠随机分为5组，对照组(n=10)尾静脉注射乙醇溶液；实验组分为4个组(n=10)，分别尾静脉注射15，30，60，90 mmol/L的亚油酸溶液，构建体内高亚油酸水平大鼠模型。分别在给药前及给药后24，48，72 h从眼眶静脉采集血液样本检测红细胞计数、血红蛋白质量浓度、谷胱甘肽过氧化物酶活力、总超氧化物歧化酶活力及过氧化氢浓度变化。
结果与结论：实验组在给药浓度为60 mmol/L时大鼠红细胞及血红蛋白明显降低，出现显著的隐性失血。在给药后24 h，实验组与对照组相比血红蛋白质量浓度和红细胞计数都降低，且各实验组比对照组变化更显著 (P < 0.05)；谷胱甘肽过氧化物酶活力、总超氧化物歧化酶活力、过氧化氢浓度均明显降低，实验组与对照组之间变化差异有显著性意义(P < 0.05)。给药后48 h，对照组与实验组血液中血红蛋白质量浓度及红细胞计数相对稳定，而谷胱甘肽过氧化物酶活力、总超氧化物歧化酶活力、过氧化氢浓度都明显持续下降，且实验组变化更显著(P < 0.05)。说明血液中亚油酸水平的升高可造成血液中红细胞的急性损伤，通过氧化应激反应，导致隐性失血。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：人工关节；骨植入物；脊柱；骨折；内固定；数字化骨科；组织工程

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关键词: 植入物, 人工假体, 亚油酸, 红细胞损伤, 氧化应激, 隐性失血, 人工关节置换, 谷胱甘肽过氧化物酶, 超氧化物歧化酶, 过氧化氢, 江苏省自然科学基金

Abstract:

BACKGROUND: Hidden blood loss frequently occurs after artificial joint replacement surgery, the resulting anemia may cause serious impact on postoperative rehabilitation. There are many different theories about the hidden blood loss, but the mechanisms are not clear.
OBJECTIVE: To study the effect of linoleic acid on red blood cells of rats and explore the pathogenesis of hidden blood loss after artificial joint replacement surgery.
METHODS: Fifty Spraque-Dawley rats were randomly divided into five groups. Control group (n=10) was injected with alcohol solution via the tail veins. Four test groups (n=10) were injected with 15 mmol/L, 30 mmol/L,
60 mmol/L, 90 mmol/L linoleic acid via the tail veins, to establish high-level linoleic acid models in vivo. Blood samples collected from the orbital vein were determined before injection and at 24, 48, 72 hours after injection. Changes of hemoglobin, red blood cell count, glutathione peroxidase activity, total superoxide dismutase activity and hydrogen peroxide in the blood samples were observed.
RESULTS AND CONCLUSION: Significant hidden blood loss occurred when the concentration was 60 mmol/L in the experimental group, with the hemoglobin and red blood cell count were sharply reduced in blood samples. The hemoglobin and red blood cell count were reduced in all the experimental groups and control group 24 hours after administration, while the experimental groups changed more obviously (P < 0.05); glutathione peroxidase activity, total superoxide dismutase activity and hydrogen peroxide were also significantly reduced in all groups, and the changes showed significant difference among them (P < 0.05). The hemoglobin and red blood cell count were relatively stable in control group and the experimental groups 48 hours after administration, while glutathione peroxidase activity, total superoxide dismutase activity and hydrogen peroxide were significantly decreased, and changes in the experimental groups were more notable (P < 0.05). Experimental findings show that elevated levels of linoleic acid in the blood cause acute oxidative damage of the red blood cells, which eventually lead to acute anemia and hidden blood loss.

中国组织工程研究杂志出版内容重点：人工关节；骨植入物；脊柱；骨折；内固定；数字化骨科；组织工程

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Key words: linoleic acid, erythrocyte, blood loss, surgical, arthroplasty, replacement, superoxide dismutase

中图分类号:

R318

袁涛，丛宇，赵建宁，周利武，陈双双，包倪荣. 亚油酸与红细胞急性损伤：人工关节置换后隐性失血的发病机制[J]. 中国组织工程研究, 2014, 18(48): 7739-7744.

Yuan Tao, Cong Yu, Zhao Jian-ning, Zhou Li-wu, Chen Shuang-shuang, Bao Ni-rong. Linoleic acid and acute red blood cells injury: mechanism of hidden blood loss after artificial joint replacement[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2014, 18(48): 7739-7744.

图/表（结果） 3

2.1 实验动物数量分析 1个对照组和4个实验组共50只大鼠纳入实验，其中90 mmol/L亚油酸组大鼠中有5只大鼠在实验过程中于给药后几分钟死亡，其他各组大鼠均顺利采集样本，并对所有样本进行血红蛋白质量浓度和红细胞计数检测，采集数据。对各组样本的数据分析发现 30 mmol/L亚油酸组、60 mmol/L亚油酸组大鼠血红蛋白质量浓度和红细胞计数发生了显著变化，考虑发生了隐性失血，然后进一步检测分析对照组、30 mmol/L亚油酸组、60 mmol/L亚油酸组大鼠血液中谷胱甘肽过氧化物酶活力、总超氧化物歧化酶活力以及过氧化氢浓度的变化情况，探究隐性失血的机制。

2.2 结果分析实验组通过尾静脉给予不同的药物浓度，成功建立了大鼠隐性失血的模型，随着药物浓度的增加实验组红细胞计数及血红蛋白质量浓度变化愈加明显，当药物浓度为90 mmol/L时，半数大鼠发生死亡，主要表现为呼吸困难、口唇发绀、咯血、抽搐直至死亡，致死原因为肺栓塞。研究数据表明当药物浓度为60 mmol/L血红蛋白质量浓度变化显著(P < 0.05，图1)。

对照组、亚油酸30 mmol/L组和60 mmol/L组血液样本做进一步检验分析。在给药前，各组大鼠体质量及血液检测指标之间无明显差异。给药后24 h，对照组及实验组血液中血红蛋白质量浓度、红细胞计数均有明显的下降(图1，2)，对照组下降分别约(8.5±2.3) g/L，(0.22±0.05)×10¹² L^-1，亚油酸组下降约(16.5±2.0) g/L，(0.65±0.15)×10¹² L^-1，实验组与对照组相比变化更明显(P < 0.05)；对照组和实验组中的谷胱甘肽过氧化物酶活力、总超氧化物歧化酶活力、过氧化氢浓度均明显下降且实验组变化更显著(P < 0.05，图3-5)。

给药后48 h，实验组及对照组血液中的红细胞计数、血红蛋白质量浓度与给药后24 h相比变化差异均无显著

性意义；而谷胱甘肽过氧化物酶活力、总超氧化物歧化酶活力、过氧化氢浓度均明显下降，且实验组的变化与对照组相比差异有显著性意义(P < 0.05，图3-5)。给药72 h后血液样本中的血红蛋白、红细胞计数均相对稳定，而谷胱甘肽过氧化物酶活力、总超氧化物歧化酶活力、过氧化氢浓度有回升趋势。

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引言

游离脂肪酸是脂肪的代谢产物，它能够刺激中性粒细胞产生活性氧簇，如超氧自由基(•O²^-)、过氧化氢(过氧化氢)、羟自由基(•OH)等，活性氧可使类脂中的不饱和脂肪酸发生过氧化反应，破坏细胞膜的结构^[1]。中性粒细胞通过产生ROS清除病原体和异物。生理情况下，机体内氧化与还原处于平衡状态，这对于细胞和器官的保持正常的生理功能有着重要意义。然而当过度的活性氧生成时则会损害含有大量多不饱和脂肪酸的细胞膜^[2]。关于红细胞氧化损伤的机制研究有很多。广泛存在于红细胞膜上的过氧化物氧化还原酶2，能保护红细胞免受氧化损伤，但研究显示5 μmol/L的过氧化氢就可完全氧化该酶^[3]。血红蛋白氧化损伤主要表现为其结构和功能的改变，导致变性和沉淀以及高铁血红蛋白的产生^[4-5]。亲水的过氧化氢还可穿透细胞膜直接氧化血红蛋白而产生ferryl血红蛋白，后者不但丧失携氧能力，而且其自发还原为亚铁血红蛋白的过程非常缓慢，甚至无法恢复到正常的状态^[6]。红细胞中，次氯酸氧化谷胱甘肽和膜蛋白SH组，增加细胞渗透脆性并通过脂质氧化损害细胞变形能力^[7-8]。有研究证实次氯酸对红细胞的的氧化作用使得后者对Stichodactyla heliantusⅡ的溶血诱导效应更加敏感^[3^，^9]。隐性失血常出现于人工关节置换后，所导致的贫血在自体血回输或根据肉眼可见出血量进行异体输血后依然存在，其发生机制尚不明确^[10-12]。然而人工关节置换过程中会造成髓腔压力增高，可以使髓腔内脂肪小滴通过血循环进入心、脑、肺等器官，在病理过程中发挥作用，这一点通过食管超声心动图已得到证实，提示游离脂肪酸可能与红细胞损伤相关^[13]。文章旨在通过向大鼠体内注入游离脂肪酸替代物亚油酸建立血液中高游离脂肪酸模型，并观察红细胞损伤情况，探究隐性失血的发生机制。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：人工关节；骨植入物；脊柱；骨折；内固定；数字化骨科；组织工程
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材料方法

设计：随机对照动物体内实验。

时间及地点：于2013年1月至2014年2月在解放军南京军区南京总医院动物实验中心和中心实验室完成。

材料：

实验动物：体质量为(200±20) g成年雄性Sprague- Dawley大鼠50只，购于解放军南京军区南京总医院动物实验中心，生产许可：SCXK(军)2012-0014；使用许可：SYXK(军)2012-0047，在清洁级环境下饲养。

亚油酸对人工关节置换后隐性失血影响实验用主要试剂及仪器：
试剂及仪器	来源
亚油酸(C18:2)	美国Sigma公司
谷胱甘肽过氧化物酶测试盒	南京建成生物科技有限公司
总超氧化物歧化酶测试盒	南京建成生物科技有限公司
过氧化氢测试盒	南京建成生物科技有限公司
XE-5000全自动血液分析系统	日本SYSMEX公司
通用型离心机Z323	德国Hermle公司
680酶标仪	美国BIO-RAD公司

实验方法：实验组亚油酸试剂用体积分数为20%的乙醇溶解稀释，配制不同浓度的亚油酸溶液。将50只SD大鼠按随机数字表法分为5组，对照组(n=10)：尾静脉注射0.5 mL体积分数 20%的乙醇溶液；实验组分为4个组(n=10)，分别尾静脉注射0.5 mL浓度为15，30，60，90 mmol/L的亚油酸溶液。

标本采集：分别于给药前、给药后24，48，72 h从眼静脉采血0.5 mL，采取的血液样本置于枸橼酸钠抗凝管混匀，行血液常规分析，检测血红蛋白质量浓度、红细胞计数，剩余的血8 h内测定谷胱甘肽过氧化物酶活力、总超氧化物歧化酶活力、过氧化氢浓度。

血液标本处理：将采集的血液标本2 h内送检，通过全自动血液分析系统测量红细胞计数、血红蛋白质量浓度；剩余的血液标本通过试剂盒所指导的测量方法，用荧光测定法测量谷胱甘肽过氧化物酶活力、黄嘌呤氧化酶法测量总超氧化物歧化酶活力、分光光度法测量过氧化氢浓度变化。

主要观察指标：对采集的血液样本进行检验分析，观察实验组和对照组大鼠血液在给药前、给药后24，48，72 h，血液样本中的血红蛋白、红细胞计数、谷胱甘肽过氧化物酶、超氧化物歧化酶、过氧化氢变化情况。

统计学分析：由第五作者对实验数据进行统计分析，计量样本资料比较采用配对样本t 检验，数据以x(_)±s表示，所有数据应用SPSS 17.0软件进行统计学分析，P < 0.05为差异有显著性意义。

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讨论

慢性肾功能不全、慢性寄生虫感染造成的体内氧化应激已被证明可以导致红细胞损伤性慢性贫血，其发生机制为游离脂肪酸诱导的慢性红细胞氧化损伤。研究发现髋膝关节置换可在人体内产生大量游离脂肪酸，本实验试图证明游离脂肪酸可诱导急性的红细胞损伤性贫血，导致髋膝关节置换后的隐性失血。关于隐性失血的原因和机制有很多说法，Pattison等^[14]推测术后隐性失血至少部分是溶血的结果，但溶血的原因并不清楚。Haien等^[15-17]发现血液自体回输会造成溶血，研究中发现平均自体回输1.3 L，血浆中血红蛋白水平达到 50 mg/L。由于结合珠蛋白的存在，该水平的溶血不足以造成血红蛋白尿^[18]，但可造成自体回输血量不足。而且Shen等^[19]的研究证明自体血回输组与非输血组之间在隐性失血上差异无显著性意义。值得注意的是，Tetro等^[20-23]报道止血带的使用是造成隐性失血的可能原因，该研究显示未使用止血带患者的隐性失血较使用者低16%，但隐性失血的绝对值仍达到600 mL。除此之外，“第三间室”理论也试图对这一现象做出解释。Sehat等^[24-25]指出使用标记的红细胞发现难以解释的失血是由于血液进入周围组织间隙的原因。然而人工髋关节置换后通常使用加压包扎和负压吸引装置，很难相信血液会渗入高压力的软组织间隙，而非负压力的吸引装置中。因此隐性失血的原因机制有待进一步研究。

此次实验通过尾静脉注射亚油酸建立大鼠体内高游离脂肪酸模型，检测红细胞计数、血红蛋白质量浓度的变化情况判断红细胞损伤情况，同时测量谷胱甘肽过氧化物酶活力、总超氧化物歧化酶活力、过氧化氢变化趋势研究隐性失血的发生机制。

红细胞计数及血红蛋白质量浓度变化是判断红细胞损

伤的良好指标，实验研究中对照组、亚油酸组红细胞计数、血红蛋白质量浓度都有降低，且实验组变化与对照组相比变化更显著，说明实验组红细胞损伤较明显，发生了隐性失血。由于实验所采集血液样本占SD大鼠体内血液含量的2.8%-4.2%，血标本采集会直接导致红细胞计数、血红蛋白质量浓度降低，同时静脉注入乙醇稀释液，也可能会引起红细胞体积增大，出现细胞溶解、破裂，所以对照组红细胞计数、血红蛋白质量浓度也有一定程度的下降；实验组变化较对照组更明显，且差异有显著性意义，根据给药后24，48，72 h对照组的血红蛋白质量浓度和红细胞计数变化结果发现，在采集同等量的血液样本后变化明显减缓，表明第一次给药前采集样本时因刺激导致大鼠机体内广泛应激反应，同时由于采样失血，对照组和实验组均发生了明显变化，但实验组由于药物试剂作用变化较对照组更显著，提示实验组有隐性失血发生，亚油酸与红细胞损伤密切相关。

亚油酸是人体内含量最丰富的多不饱和脂肪酸，其结构中不饱和双键的存在，极易受到自由基的攻击而发生氧化^[26-28]；由于不饱和脂肪酸氧化的特殊性，可诱导产生大量的自由基和活性物质^[29-31]，当活性氧大量产生，并超过清除能力时，活性氧可以释放到细胞外，并攻击周围的细胞和组织，造成损伤^[32]。

游离脂肪酸引起红细胞损伤的机制尚不明确，在本实验中通过检测谷胱甘肽过氧化物酶活力、总超氧化物歧化酶活力、过氧化氢浓度在实验过程中的变化，探讨亚油酸诱导的氧化应激对红细胞损伤的作用。

谷胱甘肽过氧化物酶是存在于机体内的一种重要的催化过氧化氢分解的酶，它能特异性的催化还原型谷胱甘肽对过氧化氢的还原反应，可以起到保护细胞膜结构和功能完整的作用^[8^，^33-34]。通过酶促反应速度来表示谷胱甘肽过氧化物酶的活力，它可以反映脂质过氧化的程度，间接地反映机体细胞受氧自由基损伤的严重程度^[35-37]。血液中高水平的FFA会抑制氧化型谷胱甘肽向还原型谷胱甘肽转化，从而减慢谷胱甘肽过氧化物酶清理过氧化氢的速度^[38-39]，本实验中在给药后24 h，实验组与对照组谷胱甘肽过氧化物酶活力、过氧化氢浓度均下降，但实验组变化明显高于对照组，说明亚油酸所诱导的氧化反应在体内产生作用，对氧化还原物质有所消耗，降低谷胱甘肽过氧化物酶的活力。究其原因可能是采血过程中对大鼠的强烈刺激，产生全身应激性反应，可以通过增强促肾上腺皮质激素释放激素和肾上腺皮质之间的相互作用，使体内糖皮质激素的分泌量增加；当下丘脑垂体肾上腺轴兴奋时，促进促肾上腺皮质激素释放激素的分泌，作用于腺垂体使肾上腺皮质的分泌量增多，进而增加糖皮质激素的分泌。糖皮质激素能有效的促进糖异生，由于它对胰高血糖素、儿茶酚胺等的脂肪动员有允许作用，可提血管对儿茶酚胺的敏感性，同时对稳定溶酶体膜也发挥一定的作用，糖异生和脂肪运动可加速氧化作用，谷胱甘肽过氧化物酶积极分解氧化物质，反应过程中其活力降低。血液中对亚油酸含量增高，机体对其分解代谢的过程则加剧了体内的氧化反应，因此实验组谷胱甘肽过氧化物酶活力变化较实验组显著。

超氧化物歧化酶对机体的氧化与抗氧化平衡起着很关键的作用，它能清除超氧阴离子(O₂^-·)，从而保护细胞免受氧化性损伤，血液中的超氧化物歧化酶对超氧阴离子自由基有特异性抑制作用^[35^，^40]，实验中所测定的总超氧化物歧化酶的活力，可反映机体清除氧自由基的能力。有研究表明游离脂肪酸可刺激中性粒细胞产生过氧化氢和次氯酸，后两者可氧化耗竭红细胞膜表面的超氧化物歧化酶、谷胱甘肽过氧化物酶及总抗氧化能力，同时造成血红蛋白氧化变性^[41]。亚油酸组在给药48 h后，检测发现红细胞表面的谷胱甘肽过氧化物酶活力、总超氧化物歧化酶活力值持续下降，这说明在实验组中亚油酸所诱导的氧化应激反应导致总超氧化物歧化酶、谷胱甘肽过氧化物酶耗竭而明显下降，而与此同时过氧化氢受 Mn-超氧化物歧化酶(Mn-SOD)和 Zn-超氧化物歧化酶(Zn-SOD)的作用转化为H₂O和O₂，或经谷胱甘肽作用直接转化为H₂O，最终导致过氧化氢浓度也明显降低。在实验过程中通过连续检测观察，发现实验组过氧化氢浓度在给药24 h后急剧下降，随着时间的推迟下降幅度减慢，在给药后72 h后则回升，这足以说明在给药后由于高浓度亚油酸对机体的刺激，可引起机体内一系列的氧化还原应激防御反应，导致红细胞的破坏，随后亚油酸被分解代谢，机体内刺激源的消失，大鼠体内的血红蛋白质量浓度、红细胞计数通过自身代偿逐步增加，谷胱甘肽过氧化物酶、总超氧化物歧化酶的活力回归平衡状态。

亚油酸作为游离脂肪酸的重要组成成分，能够诱导机体产生大量活性氧物质，引起机体红细胞的急性损伤。在临床髋膝关节置换后常出现的隐性失血与游离脂肪酸的代谢产物密切相关，这也提示围手术期积极行抗氧化治疗可能会降低置换后隐性失血量，同时进一步的临床探究也有利于解释隐性失血的病理机制。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：人工关节；骨植入物；脊柱；骨折；内固定；数字化骨科；组织工程
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亚油酸与红细胞急性损伤：人工关节置换后隐性失血的发病机制

Linoleic acid and acute red blood cells injury: mechanism of hidden blood loss after artificial joint replacement

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