慢性腱病模型大鼠肌腱干细胞体外成脂和成肌腱的分化能力

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2014.45.019

中国组织工程研究 ›› 2014, Vol. 18 ›› Issue (45): 7320-7326.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.2014.45.019

• 干细胞培养与分化 stem cell culture and differentiation • 上一篇下一篇

慢性腱病模型大鼠肌腱干细胞体外成脂和成肌腱的分化能力

陈辉¹，林禹丞¹，徐宏亮²，王宸^1，2，芮云峰^1，2

¹东南大学附属中大医院骨科，江苏省南京市 210000；²东南大学附属中大医院无锡分院骨科，江苏省无锡市 214000

出版日期:2014-11-05 发布日期:2014-11-05
通讯作者: 芮云峰，副主任医师，硕士生导师。东南大学附属中大医院骨科，江苏省南京市 210000
作者简介:陈辉，男，1966年生，汉族，副主任医师，东南大学附属中大医院骨科，硕士。主要研究方向为运动系统软组织附着点部位的组织结构，病理学特征及生物力学特性相关性的研究。
基金资助:
国家自然科学基金青年基金项目(81201422)；江苏省自然科学基金青年基金项目(BK2012334)；东南大学基本科研业务费“创新基金”项目(3290002401)；中国博士后基金资助(2012M520983)；国家大学生创新训练计划(1210286090)；江苏省“六大人才高峰”资助项目(2013-WSW-054)

Adipogenic and tenogenic differentiation of tendon-derived stem cells isolated from an animal model of chronic tendinopathy in vitro

Chen Hui¹, Lin Yu-cheng¹, Xu Hong-liang², Wang Chen^{1, 2}, Rui Yun-feng^1,2

¹Department of Orthopedics, Zhongda Hospital, Southeast University, Nanjing 10000, Jiangsu Province, China; ²Department of Orthopedics, Wuxi Branch, Zhongda Hospital, Southeast University, Wuxi 214000, Jiangsu Province, China

Online:2014-11-05 Published:2014-11-05
Contact: Rui Yun-feng, Associate chief physician, Master’s supervisor, Department of Orthopedics, Zhongda Hospital, Southeast University, Nanjing 10000, Jiangsu Province, China; Department of Orthopedics, Wuxi Branch, Zhongda Hospital, Southeast University, Wuxi 214000, Jiangsu Province, China
About author:Chen Hui, Master, Associate chief physician, Department of Orthopedics, Zhongda Hospital, Southeast University, Nanjing 10000, Jiangsu Province, China
Supported by:
the National Natural Science Foundation of China, No. 81201422; the Natural Science Foundation of Jiangsu Province for the Youth, No. BK2012334; the Fundamental Research Funds for the Innovation in Southeast University, No. 3290002401; China Postdoctoral Research Foundation, No. 2012M520983; National Training Programs of Innovation and Entrepreneurship for Undergraduates, No. 1210286090; the “Six Talent Peaks” of Jiangsu Province, No. 2013-WSW-054

摘要/Abstract

摘要：

背景：慢性腱病是一种常见的肌腱退行性病变，好发于运动员以及肌腱过度劳损的人群。由于慢性腱病的发病机制尚未阐明，临床上还缺乏有效的治疗手段。

目的：体外研究比较慢性腱病大鼠和正常大鼠来源肌腱干细胞成脂、成肌腱分化能力。

方法：从慢性腱病大鼠以及正常大鼠髌腱中分离培养原代肌腱干细胞，传代培养至第3代，体外观察细胞形态学变化。将两种来源肌腱干细胞(P3)单层培养至细胞融合，分为2组，成脂诱导组用成脂诱导培养基培养，对照组用基础培养基培养。成脂诱导分化21 d后，将两种来源肌腱干细胞的成脂诱导组和对照组分别行油红O染色定量分析。实时荧光定量PCR检测各组细胞成脂性基因C/EBPα和PPARγ2的mRNA的表达。将两种来源的肌腱干细胞体外单层培养至70%-80%融合时，行实时荧光定量PCR检测慢性腱病来源肌腱干细胞以及正常肌腱干细胞成肌腱相关基因Col1a1，Scx，Tnmd和Dcn的mRNA的表达。

结果与结论：肌腱干细胞体外培养至第3代时，正常肌腱来源的肌腱干细胞保持细长纺锤形的典型的干细胞形态，而慢性腱病来源的肌腱干细胞虽然形态发生改变，但仍保持纺锤形形态。肌腱干细胞(P3)体外成脂诱导分化21 d后，慢性腱病来源的肌腱干细胞胞体变大、变圆，可见大量油红O染色阳性的细胞，油红O染色阳性率显著高于正常大鼠(P =0.004)。实时荧光定量PCR结果显示，慢性腱病大鼠来源肌腱干细胞的成脂性基因(C/EBPα和PPARγ2)mRNA的表达均显著高于正常大鼠(P =0.004)，肌腱特异性基因Col1a1，Scx，Tnmd以及Dcn mRNA表达量均明显低于正常大鼠(P =0.009)。说明与正常大鼠来源的肌腱干细胞相比，慢性腱病来源的肌腱干细胞体外成肌腱分化的能力减弱，而成脂分化的能力增强，此结果为进一步揭示慢性腱病发病机制提供了细胞生物学依据。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

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关键词: 干细胞, 分化, 肌腱干细胞, 慢性腱病, 髌腱, 成脂分化, 成肌腱分化, 油红O染色, 实时定量PCR, 成脂性基因(C/EBPα、PPARγ2), 肌腱特异性基因(Col1a1、Scx、Tnmd以及Dcn), 国家自然科学基金

Abstract:

BACKGROUND: Chronic tendinopathy is a tendon disorder extremely common in athletes and in the general population with repetitive strain injuries of tendons. The pathogenesis of tendinopathy remains unclear and hence treatment of tendinopathy is usually palliative.

OBJECTIVE: To investigate the of adipogenic and tenogenic ability of patellar tendon-derived stem cells isolated from chronic tendinopathy and healthy rats in vitro.

METHODS:Tendon-derived stem cells were isolated from patellar tendons of chronic tendinopathy and healthy rats respectively. The tendon-derived stem cells were cultured to the 3^rd passage in complete culture medium, and cell morphology was observed. The cells were divided into adipogenic induction group and control group. Cells in the adipogenic induction group were cultured in adipogenic induction medium, while those in the control group cultured in complete culture medium. The ability of adipogenic differentiation between tendon-derived stem cells isolated from the tendon of chronic tendinopathy and healthy rats in vitro was examined by oil red O staining and quantification assay. The mRNA expressions of C/EBPα and PPARγ2 were detected by real-time quantitative PCR. When 70%-80% cells were confluent, the mRNA expressions of Col1a1, Scx, Tnmd and Dcn were also detected by real-time quantitative PCR.

RESULTS AND CONCLUSION: At the third passage, slender spindle-shaped cells were seen in both two groups, but there was a little change in the cell morphology in the chronic tendinopathy group. Lipid droplets were formed after the cells were cultured in adipogenic induction medium for 21 days. This was not observed in the control group. We observed more oil red O-positive oil droplets in tendon-derived stem cells from the tendons of chronic tendinopathy rats than healthy rats. The difference between them was statistically significant (P=0.004). The results of real-time quantitative PCR showed that the mRNA expressions of C/EBPα and PPARγ2 in the tendon-derived stem cells from the tendons of chronic tendinopathy rats were significantly higher than those in tendon-derived stem cells from the tendons of healthy rats (P=0.004); the mRNA expressions of Col1a1, Scx, Tnmd and Dcn in the tendon-derived stem cells from the tendons of chronic tendinopathy rats were significantly lower than those in tendon-derived stem cells from the tendons of healthy rats (P=0.009). In conclusion, tendon-derived stem cells from chronic tendinopathy rats showed a higher ability of adipogenic differentiation, but a lower capacity of tenogenic differentiation compared to tendon-derived stem cells from healthy rats, which might contribute to better understand the pathogenesis of tendinopathy.

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Key words: tissue engineering, stem cells, tendinopathy, rats

中图分类号:

R394.2

陈辉，林禹丞，徐宏亮，王宸，芮云峰. 慢性腱病模型大鼠肌腱干细胞体外成脂和成肌腱的分化能力[J]. 中国组织工程研究, 2014, 18(45): 7320-7326.

Chen Hui, Lin Yu-cheng, Xu Hong-liang, Wang Chen, Rui Yun-feng. Adipogenic and tenogenic differentiation of tendon-derived stem cells isolated from an animal model of chronic tendinopathy in vitro[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2014, 18(45): 7320-7326.

图/表（结果） 5

2.1 实验动物数量分析实验中共纳入SD大鼠12只，6只大鼠用于构建慢性腱病模型，其余6只大鼠作为对照。慢性腱病大鼠动物模型的构建方法参照Lui等^[9]的实验方法。6只大鼠均造模成功，大鼠处死后取其髌腱用以肌腱干细胞的提取。

2.2 髌腱来源肌腱干细胞的形态学观察有核细胞以 50个/cm²接种后，细胞呈克隆样生长。当传代培养至第3代(P3)时，正常大鼠髌腱来源的肌腱干细胞形态较均一，主要表现为细长的纺锤形(图1A)；慢性腱病模型来源的肌腱干细胞主要表现为多突的纺锤形，细胞核较大(图1B)。

2.3 髌腱来源肌腱干细胞体外成脂诱导分化及其定量检测正常大鼠髌腱来源肌腱干细胞经更换成脂诱导培养液21 d后，成脂诱导组的细胞形态逐渐变的肥大，在少部分细胞胞质内可见被油红O染液染成红色的脂滴形成(图2A)，对照组为阴性(图2B)。慢性腱病大鼠来源的肌腱干细胞经成脂诱导培养21 d后，成脂诱导组的细胞形态逐渐变圆，在大部分细胞胞质内可以看到被油红O染液染成红色的脂滴形成(图2C)，对照组为阴性(图2D)。油红O定量检测结果显示，正常大鼠来源的肌腱干细胞中，成脂诱导组高于对照组(P=0.004)；慢性腱病大鼠来源的肌腱干细胞中，成脂诱导组高于对照组(P=0.004)；同时，慢性腱病大鼠来源肌腱干细胞的成脂诱导组与正常大鼠来源肌腱干细胞的成脂诱导分化组之间的差异有显著性意义(P=0.004) (图3)。

2.4 肌腱干细胞成脂诱导分化后脂肪特异性基因mRNA的表达实时荧光定量PCR 结果检测显示，慢性腱病以及正常大鼠来源肌腱干细胞成脂诱导组的成脂性基因C/EBPα和PPARγ2 mRNA表达均高于对照组(P=0.004)。同时，经21 d成脂诱导培养后慢性腱病大鼠来源肌腱干细胞的成脂性基因(C/EBPα和PPARγ2)mRNA的表达显著的均高于正常大鼠来源的肌腱干细胞(P=0.004)(图4)。

2.5 肌腱干细胞表达肌腱特异性基因mRNA的情况实时荧光定量PCR 检测示，慢性腱病大鼠来源肌腱干细胞的肌腱特异性基因Col1a1、Scx、Tnmd以及Dcn mRNA 表达量均明显低于正常对照组(P=0.009)(图5)。

参考文献

[1]Ljungqvist A, Schwellnus MP, Bachl N, et al. International Olympic Committee consensus statement: molecular basis of connective tissue and muscle injuries in sport. Clin Sports Med. 2008;27(1):231-239.
[2]Skjong CC, Meininger AK, Ho SS. Tendinopathy treatment: where is the evidence? Clin Sports Med. 2012;31(2):329-350.
[3]De Mos M, Koevoet W, Van Schie HT, et al. In vitro model to study chondrogenic differentiation in tendinopathy. Am J Sports Med. 2009;37(6):1214-1222.
[4]Kannus P, Jozsa L. Histopathological changes preceding spontaneous rupture of a tendon. A controlled study of 891 patients. J Bone Joint Surg Am. 1991;73(10):1507-1525.
[5]Bi Y, Ehirchiou D, Kilts TM, et al. Identification of tendon stem/progenitor cells and the role of the extracellular matrix in their niche. Nat Med. 2007;13(10):1219-1227.
[6]Rui YF, Lui PP, Wong YM, et al. Altered fate of tendon-derived stem cells isolated from a failed tendon-healing animal model of tendinopathy. Stem Cells Dev. 2013;22(7):1076-1085.
[7]Zhang J, Wang JH. Characterization of differential properties of rabbit tendon stem cells and tenocytes. BMC Musculoskelet Disord. 2010;11:10.
[8]Rui YF, Lui PP, Chan LS, et al. Does erroneous differentiation of tendon-derived stem cells contribute to the pathogenesis of calcifying tendinopathy? Chin Med J (Engl). 2011;124(4):606- 610.
[9]Lui PP, Fu SC, Chan LS, et al. Chondrocyte phenotype and ectopic ossification in collagenase-induced tendon degeneration. J Histochem Cytochem. 2009;57(2):91-100.
[10]Rui YF, Lui PP, Li G, et al. Isolation and characterization of multipotent rat tendon-derived stem cells. Tissue Eng Part A. 2010;16(5):1549-1558.
[11]Ramirez-Zacarias JL, Castro-Munozledo F, Kuri-Harcuch W. Quantitation of adipose conversion and triglycerides by staining intracytoplasmic lipids with Oil red O. Histochemistry. 1992;97(6):493-497.
[12]Safran O, Derwin KA, Powell K, et al. Changes in rotator cuff muscle volume, fat content, and passive mechanics after chronic detachment in a canine model. J Bone Joint Surg Am. 2005;87(12):2662-2670.
[13]李奉龙,姜春岩,鲁谊,等.免肩袖损伤模型的建立及初步组织学研究[J].中国组织工程研究,2012,16(20):3685-3689.
[14]Gerber C, Schneeberger AG, Hoppeler H, et al. Correlation of atrophy and fatty infiltration on strength and integrity of rotator cuff repairs: a study in thirteen patients. J Shoulder Elbow Surg. 2007;16(6):691-696.
[15]Cristancho AG, Lazar MA. Forming functional fat: a growing understanding of adipocyte differentiation. Nat Rev Mol Cell Biol. 2011;12(11):722-734.
[16]Linhart HG, Ishimura-Oka K, Demayo F, et al. C/EBPalpha is required for differentiation of white, but not brown, adipose tissue. Proc Natl Acad Sci U S A. 2001;98(22):12532-12537.
[17]Medina-Gomez G, Virtue S, Lelliott C, et al. The link between nutritional status and insulin sensitivity is dependent on the adipocyte-specific peroxisome proliferator-activated receptor-gamma2 isoform. Diabetes. 2005;54(6):1706-1716.
[18]Pepe G, Bue C, Orlandi P, et al. Are the SSTR alleles stable enough to be considered monophyletic and hence reliable anthropogenetic markers? Linkage disequilibrium study on the (ACT)n COL1A2 SSTR. Hum Biol. 1995;67(5):703-715.
[19]Aslan H, Kimelman-Bleich N, Pelled G, et al. Molecular targets for tendon neoformation. J Clin Invest. 2008;118(2):439-444.
[20]Shukunami C, Takimoto A, Oro M, et al. Scleraxis positively regulates the expression of tenomodulin, a differentiation marker of tenocytes. Dev Biol. 2006;298(1):234-247.
[21]Docheva D, Hunziker EB, Fassler R, et al. Tenomodulin is necessary for tenocyte proliferation and tendon maturation. Mol Cell Biol. 2005;25(2):699-705.
[22]Hassell JR, Birk DE. The molecular basis of corneal transparency. Exp Eye Res. 2010;91(3):326-335.
[23]Ameye L, Aria D, Jepsen K, et al. Abnormal collagen fibrils in tendons of biglycan/fibromodulin-deficient mice lead to gait impairment, ectopic ossification, and osteoarthritis. FASEB J. 2002;16(7):673-680.
[24]Li L, Clevers H. Coexistence of quiescent and active adult stem cells in mammals. Science. 2010;327(5965):542-545.

引言

慢性腱病是一种好发于运动员以及肌腱过度劳损人群的肌腱退行性病变^[1]，其主要临床表现是疼痛、局部肿胀以及功能障碍。虽然慢性腱病有着很高的发病率，并且呈现逐年上升的趋势，目前对于慢性腱病的治疗还只是基于有限的临床经验以及理论上的推导，多数疗效甚微^[2]。慢性腱病患者的临床组织学标本研究发现，病变肌腱的主要病理学特征是细胞数的增多，细胞基质的紊乱，蛋白多糖的沉积，Ⅰ型胶原的降解，甚至可以观察到有软骨骨样沉积物以及脂肪的浸润^[3-4]。肌腱干细胞(tendon-derived stem cells，TDSCs)是来源于肌腱组织的间充质干细胞，2007年首先由Bi等^[5]从人和小鼠的肌腱中分离取得，体外培养时该细胞群具有克隆形成能力、自我更新及多向分化潜能等干细胞的普遍特性。在体外，肌腱干细胞可以被诱导向脂肪细胞、软骨样细胞、骨细胞分化；在裸鼠模型中，肌腱干细胞还可以形成肌腱样组织，软骨样组织以及腱-骨连接样组织等^[6-7]。本课题组前期通过一系列组织学和细胞学研究后提出：肌腱中肌腱干细胞的错误分化可能是慢性腱病潜在的细胞生物学发病机制^[6^，^8]。

最新的研究发现，慢性腱病大鼠来源的肌腱干细胞比正常大鼠肌腱干细胞更易向软骨细胞以及成骨细胞分化^[6]。慢性腱病主要是由细胞介导的病理过程^[8]，而肌腱中固有的肌腱细胞是一种分化成熟的终末期细胞，并不具备多向分化的潜能，因而慢性腱病模型来源的肌腱干细胞具有更高的成软骨、成骨分化的能力可以解释病变肌腱中的软骨化及骨化现象。然而，慢性腱病的临床标本中为何会出现脂肪浸润?发生脂肪浸润的细胞学机制仍不清楚，慢性腱病大鼠来源的肌腱干细胞是否比正常的肌腱干细胞具有更高的成脂分化能力尚未见研究报道。

因此，实验通过建立慢性腱病大鼠模型，然后分别从疾病模型大鼠和正常大鼠的髌腱组织中分离提取肌腱干细胞，体外比较2种来源肌腱干细胞的成脂和成肌腱分化能力，旨在为进一步揭示慢性腱病的细胞学发病机制提供理论依据。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程
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材料方法

设计：细胞学体外观察实验。

时间及地点：于2014年1至6月在东南大学医学院外科学实验中心完成。

材料：

实验动物：实验取8周龄SD大鼠12只，雌雄不限，体质量为250-300 g，其中6只用来取正常髌腱来源的肌腱干细胞，6只用于注射Ⅰ型胶原酶构造慢性腱病模型并分离培养髌腱来源肌腱干细胞，由江苏省农科院提供，许可证号：SCXK(苏)2007-0004。实验中对动物的处置符合科技部颁发的《关于善待实验动物的指导性意见》的相关要求。

方法：

Ⅰ型胶原酶诱导的大鼠慢性腱病模型的建立：慢性腱病大鼠模型的构建和鉴定参照Lui等^[9]的实验方法，将大鼠以体积分数2.5%戊巴比妥(4.5 mg/kg)麻醉后，去除下肢的毛发，再将大鼠的膝关节屈曲90°以更好的显露髌腱，慢性腱病模型诱导组(n=6)选用30G型号的针头向大鼠双侧髌腱内注射20 μL溶组织梭菌来源的Ⅰ型胶原酶(质量浓度为0.015 g/mL，溶于生理盐水中)。正常对照组(n=6)选用30G型号的针头向大鼠双侧髌腱内注射20 μL生理盐水。注射完成后将大鼠放回笼中自由活动，2周后将所有注射过Ⅰ型胶原酶以及生理盐水的大鼠处死，取大鼠的髌腱用于分离培养肌腱干细胞。

大鼠肌腱干细胞的分离培养：大鼠髌腱来源肌腱干细胞的分离培养及干细胞特性鉴定参照Rui等^[6^，^10]的方法。将SD大鼠断颈处死，浸入体积分数75%乙醇中5 min，无菌条件下去除髌腱的腱骨移行部分和肌腱与肌肉交界部分，取髌腱中段用于细胞的分离与培养。小心移除肌腱表面的腱膜之后将样本放入无菌PBS中，用眼科剪将肌腱剪成 1 mm×1 mm×1 mm小块状，放入培养皿中，体积分数0.3%Ⅰ型胶原酶消化约2.5 h，用70 μm的滤器滤过形成单细胞悬液。用PBS洗涤2次后，以300×g，离心5 min后去除上清，所得细胞沉淀用基础培养基重悬(含LG-DMEM，体积分数10%FBS，100 U/mL青霉素，100 mg/L链霉素)。将细胞悬液以50个有核细胞/cm²的细胞密度接种到面积为20 cm²的培养皿中^[10]，培养3 d后用无菌PBS洗涤细胞2次以去除未贴壁的细胞。培养7-10 d后用体积分数0.25%胰蛋白酶消化克隆样生长的细胞，标记为原代细胞。传代细胞生长浓度铺满培养瓶底达90%后传代，弃培养液，无菌PBS 清洗2次，体积分数0.25% 胰蛋白酶消化3-5 min，加入基础培养基终止消化；细胞悬液以181×g离心5 min，弃上清，加入2 mL基础培养基重悬细胞，细胞计数按5×10³/cm²细胞浓度接种至细胞培养瓶。取第3代细胞作干细胞特性鉴定并用于后续实验^[6]。倒置相差显微镜观察细胞形态变化。

大鼠肌腱干细胞成脂诱导分化实验：取传代培养至第3代的细胞，正常大鼠以及慢性腱病模型大鼠来源的肌腱干细胞分别以4×10³/cm²的细胞浓度接种于6孔板，基础培养基培养直至细胞融合。当细胞生长融合时，将基础培养基换成成脂诱导培养基(含体积分数10%FBS、500 nmol/L地塞米松、500 μmol/L异丁基甲基黄嘌呤、50 μmol/L吲哚美辛、10 mg/L胰岛素的LG-DMEM)，对照组继续使用基础培养基。每隔3 d更换培养基，培养至第21天时，将两组细胞分别行油红O染色检测脂滴生成，并行定量检测，通过实时定量PCR检测成脂相关基因(C/EBPα和PPARγ2)mRNA的表达。

油红O染色及其定量检测：细胞培养至21 d时行染色，吸去所有6孔板中细胞表面培养液，无菌PBS冲洗2遍；用体积分数70%的乙醇室温固定10 min；双蒸水轻柔冲洗两遍；随后用体积分数0.3%油红O溶液1 mL/孔室温染色2 h，吸去未结合的染料，用双蒸水漂洗并轻微振荡5 min，重复3次；吸去多余的双蒸水，倒置显微镜观察并拍照。油红O染色定量检测的方法参考Ramirez等^[11]的文献，染色结束之后，用异丙醇溶液1 mL/孔室温孵育1 h，取萃取充分的溶液用紫外分光光度计在510 nm波长处读取吸光值。

实时荧光定量PCR 检测成脂分化各基因表达：细胞培养至21 d时行实时定量PCR检测。使用Rneasy Mini Kit试剂盒分别提取正常来源和慢性腱病来源肌腱干细胞成脂诱导组和对照组的总RNA。根据First Strand cDNA试剂盒说明将RNA反转录为cDNA，通过测量紫外线波长260 nm及280 nm处的吸光度得到cDNA浓度。各目的基因(C/EBPα和PPARγ2)的引物序列和最佳退火温度见表1。参照SYBR Green qPCR SuperMix试剂盒说明，使用ABI Stepone Plus 软件上机，循环条件如下：95 ℃下变性10 min，在95 ℃ 20 s，最佳退火温度30 s，72 ℃ 30 s，共45个循环，最后在60-95 ℃(加热速率0.18 ℃/s)。实验结果通过Relative Quantification Software进行分析，靶基因以β-actin作为内参，相关基因表达通过 2^-^?CT公式计算。

实时荧光定量PCR检测成肌腱分化各基因表达：取传代培养至第3代的正常大鼠和慢性腱病大鼠来源的肌腱干细胞，以5×10³/cm²的细胞浓度接种于6孔板。基础培养基培养，细胞生长至70%-80%时，使用Rneasy Mini Kit试剂盒提取两组肌腱干细胞的总RNA, 根据First Strand cDNA试剂盒说明将RNA反转录为cDNA，通过测量波长260 nm及280 nm处的吸光度得到cDNA浓度。各目的基因(Col1a1，Scx，Tnmd和Dcn)的引物序列和最佳退火温度见表1。参照SYBR Green qPCR SuperMix试剂盒说明，使用ABI Stepone Plus软件上机，循环条件如下：95 ℃下变性10 min，在95 ℃ 20 s，最佳退火温度30 s，72 ℃ 30 s，共45个循环，最后在60-95 ℃(加热速率0.18℃/s)。实验结果通过Relative Quantification Software进行分析，靶基因以β-actin作为内参，相关基因表达通过 2^-^?CT公式计算。

主要观察指标： ①慢性腱病大鼠以及正常大鼠髌腱来源肌腱干细胞传代后(P3)细胞形态学观察。②对两种来源肌腱干细胞体外成脂诱导分化后油红O染色以及定量分析结果。③两种来源肌腱干细胞成脂诱导分化后成脂特异性基因C/EBPα和PPARγ2的mRNA表达量。④慢性腱病模型以及正常大鼠肌腱干细胞表达肌腱特异性基因Col1a1、Scx、Tnmd以及Dcn mRNA的比较结果。

统计学分析：所有的数据以x(_)±s表示，采用SPSS 16.0 统计软件进行数据分析。两组间比较采用Mann-Whitney U检验，检验水准α=0.05。

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讨论

作者既往的实验发现，将有核细胞以低密度接种到培养皿之后，干细胞的增殖速度较快，呈克隆集落样贴壁生长，传代至第3代时，细胞主要表现为均一的具有成纤维细胞特征的长梭形，细胞高表达具有间充质干细胞特性的表面标志物，具有克隆形成、体外增殖能力以及多向分化的能力^[10]。本次实验中，细胞培养至第3代，观察细胞形态，正常肌腱来源的肌腱干细胞保持典型的干细胞形态，而慢性腱病来源的肌腱干细胞虽然形态发生改变，但仍保持纺锤形形态。两种不同来源肌腱干细胞均具有克隆形成、体外增殖的能力以及多向分化的潜能。因此，实验选用传代培养至第3代的两种来源的肌腱干细胞来进行成脂诱导分化和成肌腱分化能力的比较。

脂肪浸润是慢性腱病患者肌腱的特征之一，在兔的肩袖损伤模型以及犬的慢性肌腱损伤的模型中都观察到有脂肪的沉积^[12-13]。多项研究均证实，肌腱的萎缩以及脂肪的浸润是造成肌腱损伤后弹性下降，容易断裂的主要原因之一^[14]。实验推测肌腱中脂肪浸润的现象可能是由于肌腱干细胞在某种调控因素的作用下向脂肪细胞分化，最终形成了脂肪的积聚，导致肌腱愈合的失败。实验利用油红O染色定量分析比较两种来源肌腱干细胞成脂分化能力大小，并用实时定量PCR的方法检测脂肪细胞表型基因的表达。实验中所选用的成脂相关性基因C/EBPα和PPARγ2目前被认为是调控间充质干细胞成脂分化过程中最为重要的转录因子^[15]，有来自遗传的证据显示C/EBPα和PPARγ2任一基因敲除都会使小鼠的脂肪组织发育产生严重缺陷^[16-17]。在本次实验中，慢性腱病来源的肌腱干细胞在体外成脂诱导21 d后，胞体变大、变圆，可见大量油红O染色阳性的细胞，油红O染色阳性率显著高于正常大鼠来源的肌腱干细胞；实时定量PCR结果显示，慢性腱病来源的肌腱干细胞不论是否进行体外成脂诱导，其脂肪细胞表型基因C/EBPα和PPARγ2的表达均高于正常大鼠来源的肌腱干细胞。这说明在体外相同的诱导条件下，慢性腱病来源的肌腱干细胞比正常的肌腱干细胞更容易向脂肪细胞分化。

Bi等^[5]和Rui等^[10]的研究证实，肌腱干细胞除了高表达间充质干细胞的表面标志CD44，CD90，低表达CD34，CD31以外，还高表达肌腱相关性基因，主要有Col1a1，Scx，Tnmd，Dcn以及tenascin C等。Col1a1是Ⅰ型胶原合成的第一链， Scx特异地表达于所有介导肌肉与骨骼附着的肌腱和其它结缔组织中，包括四肢的近端和远端肌腱、腱膜、躯干和颈部肌腱等^[19]。Tnmd是肌腱发育中一个重要的分子标志，它的表达部位与Scx高度一致，时间上稍有滞后^[20]。在Tnmd基因敲除的小鼠肌腱中发现，肌腱细胞的增殖明显减慢，细胞密度减低，胶原纤维的排列紊乱，由此可见Tnmd在肌腱细胞的增殖和胶原纤维的成熟中起重要的调节作用^[21]。Decorin(Dcn)是一种富含亮氨酸的小分子蛋白多糖，由富含亮氨酸的核心蛋白和一条糖胺聚糖链组成，广泛存在于结缔组织的细胞外基质中，虽然Dcn不是肌腱组织所特有的，但是它对于维持肌腱正常的生理代谢至关重要^[22-23]。因此，实验中选取了较有代表性的4种肌腱相关基因来比较慢性腱病大鼠和正常大鼠来源干细胞的成肌腱分化能力。实时定量PCR实验结果显示：慢性腱病大鼠来源的肌腱干细胞的Col1a1，Scx，Tnmd以及Dcn的mRNA表达均低于正常大鼠来源的肌腱干细胞。这说明慢性腱病大鼠来源的肌腱干细胞成肌腱分化的能力较正常大鼠来源的肌腱干细胞降低。

成体干细胞在组织内有沉默态和激活态两种存在形式，干细胞的增殖和分化在维持内环境稳定，参与组织损伤修复方面有着重要的作用^[24]。在肌腱的损伤修复过程中，主要是肌腱干细胞被激活，通过成肌腱分化定向分化为肌腱细胞来维持肌腱正常的生理功能。实验推测，慢性腱病大鼠的肌腱干细胞成肌腱分化的能力减弱，就使得肌腱修复过程中定向分化为肌腱细胞的数目减少，从而可能导致了肌腱愈合的失败。

慢性腱病来源的肌腱干细胞通过何种机制向脂肪细胞错误分化，这种分化过程是否可逆仍需要进一步的研究。调控肌腱干细胞分化的因素有很多，主要包括有生物力学刺激，生物活性因子，细胞外基质的成分变化、细胞间的相互作用等。实验推测由于一系列理化因素，在慢性腱病的发病过程中肌腱干细胞发生了错误的分化，而针对这一发病机制，如何调控肌腱干细胞使其增强向肌腱细胞分化，抑制向脂肪细胞、成骨细胞、软骨细胞的错误分化还需要进一步探讨。

综上所述，与正常大鼠来源的肌腱干细胞相比，慢性腱病来源的肌腱干细胞体外成肌腱分化的能力减弱，而成脂分化的能力增强。文章的结果为进一步揭示慢性腱病发病机制提供了细胞生物学依据。

慢性腱病模型大鼠肌腱干细胞体外成脂和成肌腱的分化能力

Adipogenic and tenogenic differentiation of tendon-derived stem cells isolated from an animal model of chronic tendinopathy in vitro

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[1]	蒲锐, 陈子扬, 袁凌燕. 不同细胞来源外泌体保护心脏的特点与效应[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(在线): 1-.
[2]	林清凡, 解一新, 陈婉清, 叶振忠, 陈幼芳. 人胎盘源间充质干细胞条件培养液可上调缺氧状态下BeWo细胞活力和紧密连接因子的表达[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(在线): 4970-4975.
[3]	张秀梅, 翟运开, 赵杰, 赵萌. 类器官模型国内外数据库近10年文献研究热点分析[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(8): 1249-1255.
[4]	侯婧瑛, 于萌蕾, 郭天柱, 龙会宝, 吴浩. 缺氧预处理激活HIF-1α/MALAT1/VEGFA通路促进骨髓间充质干细胞生存和血管再生[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(7): 985-990.
[5]	史洋洋, 秦英飞, 吴福玲, 何潇, 张雪静. 胎盘间充质干细胞预处理预防小鼠毛细支气管炎[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(7): 991-995.
[6]	梁学奇, 郭黎姣, 陈贺捷, 武杰, 孙雅琪, 邢稚坤, 邹海亮, 陈雪玲, 吴向未. 泡状棘球绦虫原头蚴抑制骨髓间充质干细胞向成纤维细胞的分化[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(7): 996-1001.
[7]	樊全宝, 罗惠娜, 王丙云, 陈胜锋, 崔连旭, 江文康, 赵明明, 王静静, 罗冬章, 陈志胜, 白银山, 刘璨颖, 张晖. 低氧培养犬脂肪间充质干细胞的生物学特性[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(7): 1002-1007.
[8]	耿瑶, 尹志良, 李兴平, 肖东琴, 侯伟光. hsa-miRNA-223-3p调控人骨髓间充质干细胞成骨分化的作用[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(7): 1008-1013.
[9]	伦志刚, 金晶, 王添艳, 李爱民. 过氧化物还原酶6干预骨髓间充质干细胞增殖及体外向神经谱系诱导分化[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(7): 1014-1018.
[10]	朱雪芬, 黄成, 丁健, 戴永平, 刘元兵, 乐礼祥, 王亮亮, 杨建东. 胶质细胞神经营养因子诱导骨髓间充质干细胞向功能性神经元分化的机制[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(7): 1019-1025.
[11]	段丽芸, 曹晓沧. 人胎盘间充质干细胞来源细胞外囊泡调节肠炎小鼠肠黏膜胶原的沉积[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(7): 1026-1031.
[12]	裴丽丽, 孙贵才, 王弟. 丹酚酸B抑制骨髓间充质干细胞氧化损伤及促进分化为心肌样细胞[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(7): 1032-1036.
[13]	邹刚, 徐志, 刘子铭, 李豫皖, 杨继滨, 金瑛, 张骏, 葛振, 刘毅. 人脱细胞羊膜支架促进Scleraxis修饰人羊膜间充质干细胞体外成韧带分化[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(7): 1037-1044.
[14]	管倩, 栾佐, 叶豆, 杨印祥, 汪兆艳, 王倩, 姚瑞芹. 人少突胶质前体细胞传代过程中形态学的变化[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(7): 1045-1049.
[15]	李偲, 赵婷, 谭戈, 郑雨林, 张若男, 吴艳, 唐俊明. 血小板源生长因子BB可促进骨骼肌成肌细胞增殖、分化与迁移[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(7): 1050-1055.