乌司他丁对骨水泥颗粒诱导MC3T3-E1鼠前成骨细胞凋亡的干预作用

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2014.43.010

中国组织工程研究 ›› 2014, Vol. 18 ›› Issue (43): 6945-6950.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.2014.43.010

• 组织工程骨及软骨材料 tissue-engineered bone and cartilage materials • 上一篇下一篇

乌司他丁对骨水泥颗粒诱导MC3T3-E1鼠前成骨细胞凋亡的干预作用

茹江英，丛宇，赵建宁，郭亭，俞磊，丁浩，江辉

解放军第二军医大学附属南京临床医学院(解放军南京军区南京总医院)，江苏省南京市 210002

收稿日期:2014-09-19 出版日期:2014-10-15 发布日期:2014-10-15
通讯作者: 赵建宁，教授，博士生导师，解放军第二军医大学附属南京临床医学院(解放军南京军区南京总医院)，江苏省南京市 210002
作者简介:茹江英，男，1976年生，山西省晋城市人，汉族，2006年南通大学毕业，硕士，现工作于武警江苏省总队医院骨科，副主任医师，主要从事关节外科、创伤骨科方面的研究。
基金资助:
江苏省基础研究计划(自然科学基金)-面上研究项目(BK2012776)

Ulinastatin intervention for polymethyl methacrylate-induced MC3T3-E1 mouse preosteoblast apoptosis

Ru Jiang-ying, Cong Yu, Zhao Jian-ning, Guo Ting, Yu Lei, Ding Hao, Jiang Hui

Nanjing Clinical Medical School Affiliated to the Second Military Medical University (Nanjing General Hospital of Nanjing Military Area Command of Chinese PLA), Nanjing 210002, Jiangsu Province, China

Received:2014-09-19 Online:2014-10-15 Published:2014-10-15
Contact: Zhao Jian-ning, Professor, Doctoral supervisor, Nanjing Clinical Medical School Affiliated to the Second Military Medical University (Nanjing General Hospital of Nanjing Military Area Command of Chinese PLA), Nanjing 210002, Jiangsu Province, China
About author:Ru Jiang-ying, Master, Associate chief physician, Nanjing Clinical Medical School Affiliated to the Second Military Medical University (Nanjing General Hospital of Nanjing Military Area Command of Chinese PLA), Nanjing 210002, Jiangsu Province, China
Supported by:
the Natural Science Foundation of Jiangsu Province, No. BK2012776

摘要/Abstract

摘要：

背景：前期研究发现，乌司他丁对RANKL诱导RAW264.7细胞活化为成熟破骨细胞具有一定的抑制作用，并可降低基质金属蛋白酶9的表达，但其对聚甲基丙烯酸甲酯骨水泥促成骨细胞凋亡效应是否有干预作用尚不清楚。
目的：探讨乌司他丁对骨水泥颗粒诱导MC3T3-E1鼠前成骨细胞凋亡及Ⅰ型胶原、骨钙素、基质金属蛋白酶2 mRNA表达的影响。
方法：取第六七代生长状态良好的MC3T3-E1鼠前成骨细胞，分4组培养，骨水泥组加入1 g/L的聚甲基丙烯酸甲酯骨水泥悬液；高、低剂量乌司他丁组在加入1 g/L的聚甲基丙烯酸甲酯骨水泥悬液后，再分别加入 5 000，500 U/mL的乌司他丁；设置单独培养的细胞为空白对照。MTT法检测细胞增殖活性，茜素红染色检测细胞矿化程度，流式细胞仪检测细胞凋亡率，半定量RT-PCR检测细胞中Ⅰ型胶原、骨钙素、基质金属蛋白酶2 mRNA的表达。
结果与结论：与空白对照组比较，骨水泥抑制了MC3T3-E1细胞增殖活性(P < 0.05)，促进了细胞凋亡(P < 0.05)，在加入不同浓度乌司他丁后，细胞增殖活性逐渐增强(P < 0.05)，凋亡率降低(P < 0.05)，且呈剂量时间依赖关系；骨水泥降低了细胞中Ⅰ型胶原、骨钙素表达(P < 0.05)，升高了基质金属蛋白酶2表达(P < 0.05)，在加入 5 000 U/mL乌司他丁后，细胞基质金属蛋白酶2表达降低，Ⅰ型胶原、骨钙素表达升高(P < 0.05)。骨水泥组无矿化结节，其他组均有矿化结节形成。结果表明乌司他丁对骨水泥诱导MC3T3-E1鼠前成骨细胞凋亡具有一定的抑制作用，可促进成骨细胞中Ⅰ型胶原、骨钙素的生成，并降低基质金属蛋白酶2的表达水平。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

全文链接：

关键词: 生物材料, 骨生物材料, 乌司他丁, 骨水泥, 成骨细胞, 人工关节, 无菌性松动, 骨溶解, 江苏省自然科学基金

Abstract:

BACKGROUND: Previous studies have indicated that ulinastatin can inhibit RANKL-induced osteoclastogenesis on RAW264.7 cells and also lower matrix metalloproteinase-9 expression and activity. However, it remains be unclear whether ulinastatin has the intervention effect on polymethyl methacrylate (PMMA)-induced MC3T3-E1 mouse preosteoblast apoptosis or not.
OBJECTIVE: To explore the intervention role of ulinastatin on the PMMA-induced MC3T3-E1 mouse preosteoblast apoptosis and its effects on type I collagen, osteocalcin, matrix metalloproteinase-2 mRNA
expression.
METHODS: MC3T3-E1 mouse preosteoblasts at passages 6 and 7 were divided into four groups: blank group (only cultured MC3T3-E1 mouse preosteoblast), PMMA-induced group (MC3T3-E1 mouse preosteoblast+1 g/L PMMA bone cement suspension), low dose ulinastatin group (MC3T3-E1 mouse preosteoblast+1 g/L PMMA bone cement suspension+500 U/mL ulinastatin) and high dose ulinastatin group (MC3T3-E1 mouse preosteoblast+1 g/L PMMA bone cement suspension+5 000 U/mL ulinastatin). MTT method was adopted to detect the proliferation activity of proliferative activity of MC3T3-E1 mouse preosteoblast; alizarin red staining method was used to observe mineralization nodules of MC3T3-E1 mouse preosteoblast among different groups; the change of apoptosis rate for MC3T3-E1 cells was detected by flow cytometry analysis; semi-quantitative RT-PCR was taken to analyze type I collagen, osteocalcin, matrix metalloproteinase-2 mRNA expression level in MC3T3-E1 mouse preosteoblasts among different groups.
RESULTS AND CONCLUSION: Compared with the blank group, PMMA significantly inhibited the proliferation activity of MC3T3-E1 mouse preosteoblast (P < 0.05), and however significantly promoted cells apoptosis (P < 0.05). After addition of different concentrations of ulinastatin (500, 5 000 U/mL), the proliferation activity of MC3T3-E1 mouse preosteoblasts significantly raised (P < 0.05), and cells apoptosis rate significantly decreased (P < 0.05), showing the dose and time-dependent relation. Type I collagen and osteocalcin mRNA expression levels both significantly decreased after co-culture in PMMA group compared with the blank group (P < 0.05), matrix metalloproteinase-2 mRNA expression level, however, significantly increased (P < 0.05). After intervention with 5000 U/mL ulinastatin, type I collagen and osteocalcin mRNA expression levels both significantly increased, while matrix metalloproteinase-2 mRNA expression level significantly decreased (P < 0.05). PMMA group showed no obvious mineralization nodules. Yet, mineralization nodules were formed in the blank group, high and low dose ulinastatin groups. These results indicate that ulinastatin could have the inhibitory effect on the PMMA-induced MC3T3-E1 mouse preosteoblast apoptosis, and it could promote type I collagen and osteocalcin mRNA expression and yet suppress matrix metalloproteinase-2 mRNA expression.

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

全文链接：

Key words: osteoblasts, osteocalcin, matrix metalloproteinase-2

中图分类号:

R318

茹江英，丛宇，赵建宁，郭亭，俞磊，丁浩，江辉. 乌司他丁对骨水泥颗粒诱导MC3T3-E1鼠前成骨细胞凋亡的干预作用[J]. 中国组织工程研究, 2014, 18(43): 6945-6950.

Ru Jiang-ying, Cong Yu, Zhao Jian-ning, Guo Ting, Yu Lei, Ding Hao, Jiang Hui . Ulinastatin intervention for polymethyl methacrylate-induced MC3T3-E1 mouse preosteoblast apoptosis[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2014, 18(43): 6945-6950.

图/表（结果） 3

参考文献

[1] Herberts P,Malchau H.Long-term registration has improved the quality of hip replacement:a review of the Swedish THR Register comparing 160,000 case.Acta Orthop Scand. 2000; 71(2):111-121.
[2] Gallo J,Kaminek P,Ticha V,et al.Particle disease. A comprehensive theory of periprosthetic osteolysis: a review. Biomed Pap Med Fac Univ Palacky Olomouc Czech Repub. 2002;146(2):21-28.
[3] Gallo J,Goodman SB,Konttinen YT,et al.Particle disease: biologic mechanisms of periprosthetic osteolysis in total hip arthroplasty.Innate Immun.2013;19(2):213-224.
[4] Stea S,Visentin M,Granchi D,et al.Apoptosis in peri-implant tissue.Biomaterials.2000;21(13):1393-1398.
[5] MacQuarrie RA,Fang Chen Y,Coles C, et al. Wear-partical- induced oeteoclast osteolysis:the role of particulates and mechanical strain. J Biomed Mater Res B Appl Biomater. 2004;69(1):104-112.
[6] Zambonin G,Colucci S,Cantatore F,et al.Response of human osteoblasts to polymetacrylate in vitro.Calcif Tissue Int. 1998; 62(4):362-365.
[7] Gough JE,Downes S.Osteoblast cell death on metacrylate polymers involves apoptosis.J Biomed Mater Res. 2001;57(4): 497-505.
[8] Schulze C,Lochner K,Jonitz A,et al.Cell viability,collagen synthesis and cytokine expression in human osteoblasts following incubation with generated wear paticles using different bone cements.Int J Mol Med.2013;32(1):227-234.
[9] Cao ZL,Okazaki Y,Naito K,et al.Ulinastatin attenuates reperfusion injury in isolated blood-perfused rabbit heart.Ann Thorac Surg.2000;69(4):1121-1126.
[10] Kobayashi H,Shinohara H,Gotoh J,et al.Anti-metastatic therapy by urinary trypsin inhibitor in combination with an anti-cancer agent.Br J Cancer.1995;72(5):1131-1137.
[11] Yoshioka I,Tsuchiya Y,Aozuka Y,et al.Urinary trypsin inhibitor suppresses surgical stress-facilitated lung metastasis of murine colon26-L5 carcinoma cells. Anticancer Res. 2005; 25(2A):815-820.
[12] Kobayashi H,Shinohara H,Takeuchi K,et al.Inhibition of the soluble and the tumor cell receptor-bound plasmin by urinary trypsin inhibitor and subsequent effects on tumor cell invasion and metastasis.Cancer Res.1994;54(3):844-849.
[13] Takubo T,Kumura T,Nakamae H,et al.Urinary trypsin inhibitor levels in the urine of patients with haematological malignancies. Haematologia (Budap).2001;31(3):267-272.
[14] Wu YJ,Ling Q,Zhou XH,et al.Urinary trypsin inhibitor attenuates Heptic ischemia-reperfusion injury by reducing nuclear factor-kappa B activation.Hepatobiliary Pancreat Dis Int.2009;8(1):53-58.
[15] Inoue K,Takano H,Yanagisawa R,et al.Protective effects of urinary trypsin inhibitor on systemic inflammatory response induced by lipopolysaccharide.J Clin Biochem Nutr. 2008; 43(3):139-142.
[16] Inoue K,Takano H.Urinary trypsin inhibitor as a therapeutic option for endotoxin related inflammatory disorders.Expert Opin Investig Drugs.2010;19(4):513-520.
[17] Umeki S,Tsukiyama K,Okimoto N,et al. Urinastatin (Kunitz-type proteinase inhibitor) reducing cisplatin nephrotoxicity.Am J Med Sci.1989;298(4):221-226.
[18] Ishigami M,Eguchi M,Yabuki S.Beneficial effects of the urinary trypsin inhibitor urinastatin on renal insults induced by gentamicin and mercuric chloride (HgCl2) poisoning. Nephron. 1991;58(3):300-305.
[19] Kobayashi H,Ohi H,Terao T.Prevention by urinastatin of cis-diamminedichloroplatinum-induced nephrotoxicity in rabbits: comparison of urinary enzyme excretions and morphological alterations by electron microscopy.Asia Oceania J Obstet Gynaecol.1991;17(3):277-288.
[20] Yamasaki F,Ishibashi M,Nakakuki M,et al.Protective action of ulinastatin against cisplatin nephrotoxicity in mice and its effect on the lysosomal fragility.Nephron.1996;74(1):158-167.
[21] Ishibashi M,Yamasaki F,Nakakuki M,et al. Cytoprotective effect of ulinastatinon LLC-PK1 cells treated withantimycin A, gentamicin, and cisplatin.Nephron.1997;76(3):300-306.
[22] Inoue K,Takano H.Urinary trypsin inhibitor as a therapeutic option for endotoxinrelated inflammatory disorders.Expert Opin Investig Drugs.2010;19(4):513-520.
[23] Hua G,Haiping Z,Baorong H,et al.Effect of Ulinastatin on the Expression of iNOS, MMP-2, and MMP-3 in degenerated nucleus pulposus cells of rabbits.Connect Tissue Res. 2013; 54(1):29-33.
[24] 葛叶盈,徐云,成建庆,等.乌司他丁对老年髋关节置换患者术后并发症影响的病例对照研究[J].中国骨伤,2011,24(6):459-462.
[25] Lee JY,Lee JY,Chon JY,et al.The effect of ulinastatin on hemostasis in major orthopedic surgery.Korean J Anesthesiol. 2010;58(1):25-30.
[26] Bei K,Du Z,Xiong Y,et al.BMP7 can promote osteogenic differentiation of human periosteal cells in vitro.Mol Biol Rep. 2012;39(9):8845-8851.
[27] Komori T.Regulation of osteoblast differentiation by transcription factors. J Cell Biochem.2006;99(5):1233-1239.
[28] Krane SM,Inada M.Matrix metalloproteinases and bone.Bone. 2008;43(1):7-18.
[29] Chen D,Zhang X,Guo Y,et al.MMP-9 inhibition suppresses wear debris-induced inflammatory osteolysis through downregulation of RANK/RANKL in a murine osteolysis model.Int J Mol Med.2012;30(6):1417-1423.
[30] Mosig RA, Martignetti JA.Loss of MMP-2 in murine osteoblasts upregulates osteopontin and bone siaioprotein expression in a circuit regulating bone homeostasis.Dis Mod Mech.2013;6(2):397-403.
[31] Franco GC,Kajiya M,Nakanishi T,et al.Inhibition of matrix metalloproteinase-9 activity by doxycycline ameliorates RANK ligand-induced osteoclast differentiation in vitro and in vivo.Exp Cell Res.2011;317(10):1454-1464.

引言

假体无菌性松动是全髋关节翻修手术最常见的原因^[1]。在假体关节界面、假体与骨组织界面或假体与骨水泥界面产生的磨屑颗粒，通过诱导假体周围骨溶解而最终导致假体无菌性松动的发生，故“磨屑病”概念目前已被广泛接受^[2]。近年来，有研究表明骨微环境中的自稳状态失衡是导致假体周围骨溶解的主要原因，可能与破骨细胞的活化、增殖及溶骨作用超过成骨细胞的成骨作用有关^[3]。在假体周围骨质丢失过程中，细胞凋亡机制也起到关键性作用^[4]。在假体周围产生的磨屑颗粒中，聚甲基丙烯酸甲酯是骨水泥的主要成分，它不会引起破骨细胞凋亡^[5]，却能抑制人成骨细胞的增殖与胶原合成^[6]。此外，有研究表明聚甲基丙烯酸甲酯对成骨细胞有促凋亡作用，呈剂量依赖效应^[7-8]。因此，通过抑制成骨细胞凋亡来防治假体周围骨溶解，是药物预防人工关节置换后假体无菌性松动的又一个重要思路。乌司他丁是一种典型的Kuniz型广谱蛋白酶抑制剂，作为一种治疗与内毒素相关疾患(如急性胰腺炎、休克和弥漫性血管内凝血等)的方法，由于确切的疗效且不良反应少而在中国和日本被广泛应用于临床^[9-16]。此外，有研究表明乌司他丁还可预防体内金属和药物所导致肾毒性等不良后果^[17-22]。

前期研究发现，乌司他丁对RANKL诱导RAW264.7细胞活化为成熟破骨细胞具有一定的抑制作用，且可降低基质金属蛋白酶9的表达水平，但乌司他丁是否对聚甲基丙烯酸甲酯促成骨细胞凋亡效应具有保护作用尚不清楚。本实验通过体外实验，探讨乌司他丁对聚甲基丙烯酸甲酯颗粒诱导MC3T3-E1鼠前成骨细胞凋亡的干预作用，以期能为药物防治假体周围骨溶解提供新的思路。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程
全文链接：

材料方法

设计：体外细胞学观察实验。

时间及地点：实验在解放军第二军医大学南京临床医学院(南京军区南京总医院)骨科研究所完成。

材料：

乌司他丁降低骨水泥诱导的MC3T3-E1细胞凋亡实验用主要材料、试剂：
材料及试剂	来源
商业纯聚甲基丙烯酸甲酯骨水泥颗粒、MTT试剂盒	美国Sigma公司
内毒素检测试剂盒	厦门市鲎试剂实验厂有限公司
小鼠颅顶前成骨细胞亚克隆14 (MC3T3-E1 Subclone 14)细胞株	中科院上海细胞研究院细胞资源中心
乌司他丁注射液(批号，03070901)	广东天普生化医药股份有限公司
改良型a-MEM培养基	美国Thermo公司
RT-PCR反转录试剂盒，Taq DNA聚合酶，DNA marker	立陶宛MBI公司(Fermentas)
Trizol提取液	美国invotrigen公司
PCR扩增的上下游引物合成、茜素红S	上海生工生物技术有限公司
AKP试剂盒、ELISA试剂盒	南京建成生物工程研究所
细胞凋亡试剂盒	美国BIOVISION公司

实验方法：

骨水泥颗粒的准备：商业纯聚甲基丙烯酸甲酯骨水泥颗粒直径范围在0.3-1.1 μm内，体积分数75%乙醇浸泡 48 h，离心管(2 000 r/min)离心15 min×3次，吸弃上层乙醇，PBS洗涤3次，离心后紫外线持续照射去除残留液体；将颗粒置入小玻璃瓶中进行高压蒸汽消毒处理；用含体积分数10%FCS的改良型a-MEM培养基将聚甲基丙烯酸甲酯配制成0.1 g/L悬液，-80 ℃保存备用(用时摇匀)。

细胞培养及药物干预：将第六七代生长状态良好的 MC3T3-E1细胞，以1.5×10⁵/孔接种于6孔细胞培养板，加体积分数10%FCS至改良型a-MEM培养基成培养液，在 37 ℃、体积分数5%CO₂及饱和湿度下培养，24 h换液。将细胞分4组培养，进行以下实验：骨水泥组将配制的聚甲基丙烯酸甲酯颗粒悬液，在低频超声振荡下充分混匀后，加入与细胞共同培养；高、低剂量乌司他丁组在加入骨水泥待细胞贴壁后，再分别加入5 000，500 U/mL乌司他丁；同时设单独细胞培养的空白对照组。

噻唑蓝(MTT)比色法检测细胞增殖情况：取对数生长期MC3T3-E1细胞，以1×10⁵的细胞密度加入培养液，接种于96孔板中，培养液体积为每孔100 μL，置于37 ℃、体积分数5%CO₂培养箱中预培养24 h后，按实验分组培养24，48，72 h，每孔加入110 μL无血清RPMI1640培养基配制的3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴盐(噻唑蓝，MTT)试剂(5 g/L)，在37 ℃、体积分数5%CO₂条件下继续培养4 h，弃上清后加入二甲亚砜(150 μL/孔)孵育 10 min，在酶标仪570 nm波长处计算吸光度A值，检测各组MC3T3-E1细胞增殖活性的变化。

茜素红染色检测成骨细胞的矿化程度：通过在倒置显微镜下观察被茜素红染色为桔红色的矿化结节，反映成骨细胞的矿化程度。将第六七代生长状态良好的MC3T3-E1细胞，以5×10⁹ L^-¹/孔接种于6孔细胞培养板，经DMEM完全培养基培养72 h后，换无血清DMEM再培养24 h，按实验分组共培养10，20 d后，吸弃孔中的培养液，PBS清洗3次后，用体积分数95%乙醇固定15 min，加入0.1%茜素红-Tris-HCl染色剂(pH 8.9)孵育30 min；PBS再次清洗3次后自然干燥，用甘油明胶封固，拍照记录并在倒置显微镜下观察矿化结节。

流式细胞仪检测细胞凋亡情况：各组细胞培养24 h后收获细胞，10 mL PBS洗涤3次，离心(1 000 r/min)持续 5 min后弃上清液，加入50 mg/L PI染液100 μL，置入温箱内，避光40 min，放入4 ℃冰箱内过夜，经MODFIT软件去除细胞碎屑后，用流式细胞仪(AnnexinV/PI法)检测细胞凋亡情况，通过CellQuest软件记录、分析实验结果，实验重复进行3次。

半定量RT-PCR检测Ⅰ型胶原、基质金属蛋白酶2和骨钙素的mRNA表达情况：共培养9 d后，采用Trizol法提取各组培养细胞中的总RNA，根据RT-PCR反转录试剂盒的使用说明，RNA被反转录为cRNA后进行PCR扩增。采用如下50 μL反应体系：三蒸水36 μL，PCR缓冲液5 μL，dNTP 4 μL，MgCl₂ 1.5 μL，上游引物1 μL，下游引物1 μL，cDNA 1 μL(100 ng)和Taq聚合酶0.5 μL(表1)。扩增程序为：94 ℃预变性2 min及变性30 s、55 ℃退火30 s、72 ℃延伸50 s(共30个循环)和4 ℃保持。取10 μL RT-PCR产物进行1%琼脂糖凝胶电泳分析。采用Image ProPlus软件软件测定电泳条带的平均吸光度值，计算各组条带的平均吸光度值与GAP平均吸光度值的比值后进行组间比较。

主要观察指标：各组MC3T3-E1细胞增殖活性、成骨细胞的分化、凋亡及细胞内基质金属蛋白酶2、骨钙素及Ⅰ型胶原mRNA的表达水平。

统计学分析：应用SPSS 17.0统计软件对数据进行分析，计量资料以x(_)±s表示，多组间比较采用单因素方差分析，两组间比较采用t 检验，以P < 0.05为差异有显著性意义。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

全文链接：

讨论

目前诸多研究表明，与假体磨屑相关的炎症反应触发和放大机制在假体周围多种来源的炎症细胞反应中发挥着重要作用，最终结局导致破骨吸收效应超过成骨生成作用^[1-4]。但实际上，炎症反应是一个高度自我调节的过程，为阻止假体周围骨组织的继发性损伤，炎症反应过程同时伴有组织保护反应和再生机制的启动，各种不同的细胞因子、趋化因子、激素和特定的细胞群(包括巨噬细胞、树突状细胞和干细胞等)，都在试图平衡和保护组织结构并减少

炎症反应。换句话说，局部组织自稳机制的失平稳，可能是假体磨屑导致假体周围骨溶解的理论基础^[3]。

乌司他丁是一种典型的Kuniz型广谱蛋白酶抑制剂，作为人体肝脏分泌的一种糖蛋白，其可通过清除氧自由基、抑制炎症递质释放、稳定溶酶体膜、改善组织灌注和微循环的作用来达到保护机体的作用^[9]。研究表明人体在正常生理状态下仅存在少量有活性的乌司他丁，而在炎症、肿瘤及应激状态下则显著增多，对炎症反应、肿瘤侵袭起到明显抑制作用^[15-16]。近年来，有学者发现乌司他丁对兔退变髓核细胞中诱生型一氧化氮合酶、基质金属蛋白酶2和基质金属蛋白酶3的表达具有抑制作用，可能对慢性炎症导致的椎间盘退变的防治具有潜在应用价值^[23]。另有报道老年患者围手术期应用乌司他丁能在一定程度上预防术后并发症发生^[24]；同时骨科大手术麻醉后即时静脉输注乌司他丁可显著减少术后早期出血量^[25]。乌司他丁作为一种与内毒素相关疾患的治疗选择，由于其确切的疗效且不良反应少而在中国和日本被广泛应用于临床^[9-16]。但关于乌司他丁是否在假体磨屑诱导炎症级联反应所导致的假体周围骨溶解中具有抑制作用尚不清楚。本实验旨在探讨乌司他丁对聚甲基丙烯酸甲酯颗粒诱导MC3T3-E1鼠前成骨细胞凋亡的干预作用。本实验MTT结果显示：0.1 g/L的聚甲基丙烯酸甲酯对MC3T3-E1细胞增殖活性有显著抑制作用，呈时间依赖关系；在加入不同浓度乌司他丁24 h和48 h后，MC3T3-E1细胞增殖活性逐渐增强；流式细胞仪检测结果显示，与空白对照组相比，骨水泥组细胞凋亡率均明显升高(P < 0.01)，加入5 000 U/mL乌司他丁后，细胞凋亡率较骨水泥组明显降低(P < 0.05)，结果表明乌司他丁对聚甲基丙烯酸甲酯颗粒诱导MC3T3-E1鼠前成骨细胞凋亡具有保护作用，且呈剂量依赖关系。
成骨细胞的主要功能是分泌碱性磷酸酶，促进合成Ⅰ型胶原、骨钙素及其他细胞外基质，并最终矿化为骨组织^[26]。成骨细胞分化的标志是的Ⅰ型胶原表达，而骨钙素是一种可调控基质钙化的骨基质蛋白，被认为是成熟成骨细胞的标志^[26-27]。此外，成骨细胞分化晚期逐步分化成熟并形成矿化结节，它是成骨细胞成骨功能的一个金指标。本实验结果显示，各组共培养9 d后，骨水泥组对成骨细胞的增殖、分化和成熟有抑制作用，这与Schulze等^[8]报道的结果相一致；在加入不同浓度乌司他丁(500，5 000 U/mL)后，与骨水泥组相比，低、高剂量乌司他丁组中Ⅰ型胶原、骨钙素的mRNA表达均明显增加，而高剂量乌司他丁组较骨水泥组差异有显著性意义(P < 0.01)。茜素红染色检测结果表明，乌司他丁具有促进成骨细胞分化、增殖及成熟的功能。基质金属蛋白酶在骨生理发育、病理重建过程中具有重要性作用，它不仅参与介导成骨细胞对成熟破骨细胞的活化、迁移和贴附等过程，而且可对骨基质成分进行直接降解^[3，28-29]。基质金属蛋白酶2(明胶酶A)主要在成骨细胞中表达，具有降解变性Ⅰ-Ⅲ型胶原明胶的特异能力，活化的基质金属蛋白酶2定位于穿透基质的细胞突出部位，在酶解基底膜及细胞间基质主要成分Ⅳ型胶原中发挥“钻头”样作用。正常情况下成骨细胞表达低水平的基质金属蛋白酶2，其在骨骼发育及骨重建方面，如骨小管网络形成和骨基质矿化中具有重要调节作用；Mosig等^[30]研究发现，基质金属蛋白酶2基因缺如的成骨细胞在分化中，上调细胞外基质家族中重要成员骨桥蛋白和骨唾液酸蛋白表达水平，呈现出成骨基因表达模式，但基质金属蛋白酶2过度表达则会导致骨丢失增多。有研究表明假体周围界膜中基质金属蛋白酶1、2、3、9、10、12、13和(MT-1)-MMP的过表达与假体周围骨溶解的发生有关^[31]。如何抑制成骨细胞对基质金属蛋白酶2的过度表达成为研究关注的焦点。本实验RT-PCR结果显示，聚甲基丙烯酸甲脂可增加促溶骨因子的表达，而加入乌司他丁后，一方面可减少促溶骨因子基质金属蛋白酶2的表达，另一方面可通过增加Ⅰ型胶原和骨钙素的表达而发挥促成骨作用。本实验具有重要的理论及实际意义，为通过药物防治假体周围骨溶解提供新思路，但乌司他丁抑制成骨细胞分化中基质金属蛋白酶2 mRNA表达的确切机制及通路有待更深入的研究及动物实验进一步验证。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程
全文链接：

乌司他丁对骨水泥颗粒诱导MC3T3-E1鼠前成骨细胞凋亡的干预作用

Ulinastatin intervention for polymethyl methacrylate-induced MC3T3-E1 mouse preosteoblast apoptosis

PDF

可视化

摘要/Abstract

引用本文

使用本文

图/表（结果） 3

参考文献

相关文章 15

引言

材料方法

讨论

文章快阅

延伸阅读

编辑推荐

Metrics

本文评价

[1]	张宇, 田少奇, 曾国波, 胡川. 初次下肢全关节置换后发生心肌梗死的危险因素[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(9): 1340-1345.
[2]	陈心敏, 李文标, 熊凯凯, 熊晓燕, 郑利钦, 李木生, 郑永泽, 林梓凌. 钉道强化股骨近端防旋髓内钉治疗老年A3.3型股骨转子间骨折：最佳骨水泥量有限元分析[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(9): 1404-1409.
[3]	袁俊, 杨家福. 局部氨甲环酸浸润在非骨水泥全膝关节置换过程中止血效果的评价[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(6): 873-877.
[4]	侯广原, 张继学, 张志军, 孟祥晖, 段文, 高维陆. 骨水泥强化椎弓根螺钉内固定治疗伴骨质疏松腰椎退行性疾病的1年随访[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(6): 878-883.
[5]	李黎, 马力. 磁性壳聚糖微球固定化乳糖酶及其酶学性质[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(4): 576-581.
[6]	刘飞, 崔宇韬, 刘贺. 局部抗生素递送系统治疗骨髓炎的优势与问题[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(4): 614-620.
[7]	钟远鸣, 万通, 钟锡锋, 吴卓檀, 何炳坤, 吴思贤. 弯角与单侧椎弓根入路椎体成形治疗骨质疏松性椎体压缩骨折有效性与安全性的Meta分析 [J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(3): 456-462.
[8]	成世高, 王万春, 蒋栋, 李腾飞, 李洵, 任炼. 标准柄与加长柄骨水泥型假体置换治疗高龄转子间骨折的比较[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(3): 362-367.
[9]	王卫刚, 杨植栋, 冯宗权, 王鼎. 膝关节固定平台单髁假体置换的中期随访评价[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(3): 368-373.
[10]	王秋霏, 顾叶, 彭育沁, 薛峰, 巨荣, 朱锋, 王熠军, 耿德春, 徐耀增. 人工假体磨损颗粒作用下Wnt/β-catenin信号通路对成骨细胞的影响[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(24): 3894-3901.
[11]	唐小凯, 李伟明. Nel样分子1型蛋白在脊柱融合术后促进骨性融合的作用与机制[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(24): 3914-3920.
[12]	孟令杰, 钱辉, 盛晓磊, 陆剑锋, 黄建平, 祁连港, 刘宗宝. 3D打印建模联合骨水泥成形微创治疗塌陷Sanders Ⅲ型跟骨骨折[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(24): 3784-3789.
[13]	冯冠成, 方剑明, 吕浩然, 张东升, 韦家冬, 俞兵兵. 骨水泥弥散分布方式如何影响经皮椎体成形后的早期疗效[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(22): 3450-3457.
[14]	刘鋆, 杨龙, 王伟宇, 周玉虎, 吴颖, 卢涛, 舒莉萍, 马敏先, 叶川. 聚3-羟基丁酸酯4-羟基丁酸酯/聚乙二醇/氧化石墨烯组织工程支架的制备和性能评价[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(22): 3466-3472.
[15]	刘畅, 李大同, 刘元, 孔令擘, 郭瑞, 杨利学, 郝定均, 贺宝荣. 急性症状性骨质疏松性胸腰椎压缩骨折椎体强化手术后疗效欠佳：与骨水泥、骨密度、邻近骨折的关系[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(22): 3510-3516.