虎纹捕鸟蛛毒素对脑缺血模型大鼠海马肿瘤坏死因子凋亡通路的影响

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2014.36.013

中国组织工程研究 ›› 2014, Vol. 18 ›› Issue (36): 5813-5818.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.2014.36.013

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虎纹捕鸟蛛毒素对脑缺血模型大鼠海马肿瘤坏死因子凋亡通路的影响

王一蓉^1，2，毛海峰^1，3，陈嘉勤¹

1湖南师范大学体育学院，湖南省长沙市 410012
2湖南体育职业学院，湖南省长沙市 410019
3江西宜春学院，江西省宜春市 336000

修回日期:2014-06-19 出版日期:2014-08-30 发布日期:2014-08-30
通讯作者: 陈嘉勤，教授，湖南师范大学体育学院，湖南省长沙市 410012
作者简介:王一蓉，女，1982年生，湖南省长沙市人，汉族，2007年湖南师范大学毕业，硕士，主要从事运动生物化学的研究。
基金资助:
国家自然科学基金(30671085)；湖南省科技厅(27040236)共同资助课题

Effects of huwentoxin on tumor necrosis factor apoptotic pathway in the hippocampus of a rat model of cerebral ischemia

Wang Yi-rong^{1, 2}, Mao Hai-feng^{1, 3}, Chen Jia-qin¹

1Institute of Physical Education, Hunan Normal University, Changsha 410012, Hunan Province, China
2Hunan Sports Vocational College, Changsha 410019, Hunan Province, China
3Yichun University, Yichun 336000, Jiangxi Province, China

Revised:2014-06-19 Online:2014-08-30 Published:2014-08-30
Contact: Chen Jia-qin, Professor, Institute of Physical Education, Hunan Normal University, Changsha 410012, Hunan Province, China
About author:Wang Yi-rong, Master, Institute of Physical Education, Hunan Normal University, Changsha 410012, Hunan Province, China; Hunan Sports Vocational College, Changsha 410019, Hunan Province, China
Supported by:
the National Natural Science Foundation of China, No. 30671085; the Hunan Provincial Science and Technology Department Project, No. 27040236

摘要/Abstract

摘要：

背景：虎纹捕鸟蛛毒素经离子通道分析技术证明是一种作用于突触前膜的N型钙离子通道阻断剂。
目的：观察新型钙通道拮抗剂虎纹捕鸟蛛毒素对全脑缺血再灌注损伤模型大鼠海马组织肿瘤坏死因子凋亡通路中肿瘤坏死因子α、肿瘤坏死因子受体Ⅰ、肿瘤坏死因子受体相关死亡结构域、Fas相关死亡结构域蛋白、Caspase 8表达的影响。
方法：采用Pulsinelli“四血管阻断法”构建全脑缺血结合蛛网膜下腔置管大鼠模型，通过留置的PE10管注入虎纹捕鸟蛛毒素或生理盐水。应用电镜、RT-PCR实验技术检测全脑缺血再灌注损伤大鼠海马CA1区锥体细胞超微结构和胞内线粒体形态变化及对海马组织中肿瘤坏死因子α、肿瘤坏死因子受体Ⅰ、肿瘤坏死因子受体相关死亡结构域、Fas相关死亡结构域蛋白、Caspase 8等肿瘤坏死因子凋亡通路相关因子基因表达。
结果与结论：虎纹捕鸟蛛毒素能维持全脑缺血再灌注脑损伤大鼠线粒体基本形态且能不同程度降低肿瘤坏死因子凋亡通路中促凋亡因子肿瘤坏死因子α、肿瘤坏死因子受体Ⅰ、肿瘤坏死因子受体相关死亡结构域、Fas相关死亡结构域蛋白、Caspase 8 mRNA表达。提示天然活性多肽虎纹捕鸟蛛毒素作为一种新型N-型电压依赖性钙通道阻断剂，能有效阻断胞外Ca²⁺的大量内流，使细胞内游离钙降低，减少由于细胞内钙超载而引起的一系列病理损害，从而保护神经细胞，减轻缺血缺氧海马神经细胞的损伤。

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关键词: 实验动物, 组织构建, 虎纹捕鸟蛛毒素, 全脑缺血再灌注, 脑缺血模型大鼠, 肿瘤坏死因子α, 肿瘤坏死因子受体Ⅰ, 肿瘤坏死因子受体相关死亡结构域, Fas相关死亡结构域蛋白, Caspase 8, 国家自然科学基金

Abstract:

BACKGROUND: Ion channel analytical technique has verified that huwentoxin is an N-type Ca²⁺ channel blocker affecting on presynaptic membrane.
OBJECTIVE: To observe the effects of N-type Ca2+ channel blocker huwentoxin on expressions of tumor necrosis factor α, tumor necrosis factor receptor I, tumor necrosis factor receptor-related death domain, Fas-related death domain protein and Caspase 8 in the hippocampi of rat models of global cerebral ischemia reperfusion injury.
METHODS: Rat models of global cerebral ischemia and subarachnoid catheter were established using Pulsinelli 4-vessel occlusion and then received infusion of huwentoxin or normal saline via a PE10 tube. Morphological changes in the mitochondria and ultrastructure of pyramidal neurons in the hippocampal CA1 region of rats with global cerebral ischemia reperfusion injury were observed using electron microscope. The expressions of tumor necrosis factor α, tumor necrosis factor receptor I, tumor necrosis factor receptor-related death domain, Fas-related death domain protein and Caspase 8 were measured using RT-PCR.
RESULTS AND CONCLUSION: Huwentoxin could maintain the basic morphology of mitochondria of rats with global cerebral ischemia reperfusion injury and decrease the expressions of tumor necrosis factor α, tumor necrosis factor receptor I, tumor necrosis factor receptor-related death domain, Fas-related death domain protein and Caspase 8 mRNA. Results suggested that huwentoxin as a novel N-type Ca²⁺ channel blocker could block extracellular Ca²⁺ influx, reduce intracellular Ca²⁺ concentration, diminish a series of pathological lesion induced by intracellular Ca²⁺ overload, protect nerve cells, and lessen the injury to nerve cells of hippocampus after ischemia and hypoxia.

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Key words: reperfusion injury, tumor necrosis factor-alpha, receptor, tumor necrosis factor, type I, caspase 8

中图分类号:

R318

王一蓉，毛海峰，陈嘉勤. 虎纹捕鸟蛛毒素对脑缺血模型大鼠海马肿瘤坏死因子凋亡通路的影响[J]. 中国组织工程研究, 2014, 18(36): 5813-5818.

Wang Yi-rong, Mao Hai-feng, Chen Jia-qin . Effects of huwentoxin on tumor necrosis factor apoptotic pathway in the hippocampus of a rat model of cerebral ischemia[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2014, 18(36): 5813-5818.

图/表（结果） 3

2.1 实验动物数量分析 实验选用大鼠48只，分为3组，实验过程无脱失，全部进入结果分析。

2.2 电镜下海马锥体细胞超微结构形态学观察 假手术组：线粒体嵴清晰可见，未见线粒体嵴断裂现象(图1A)；虎纹捕鸟蛛毒素组：线粒体嵴清晰可见，未见明显线粒体嵴断裂现象(图1B)；生理盐水组：可见线粒体嵴模糊不清，出现空泡化现象(图1C)。

2.3 肿瘤坏死因子α、肿瘤坏死因子受体Ⅰ、肿瘤坏死因子受体相关死亡结构域、Fas相关死亡结构域蛋白、Caspase8 mRNA RT-PCR检测结果 见表1，图2。

2.3.1 肿瘤坏死因子受体Ⅰ mRNA 肿瘤坏死因子受体Ⅰ mRNA的表达以生理盐水组最高，虎纹捕鸟蛛毒素组与假手术组随之降低。其中生理盐水组与假手术组比较差异有非常显著性意义(P < 0.01)，虎纹捕鸟蛛毒素组与生理盐水组比较差异有非常显著性意义(P < 0.01)，见图2A，表1。

2.3.2 肿瘤坏死因子受体相关死亡结构域mRNA 肿瘤坏死因子受体相关死亡结构域mRNA的表达以生理盐水组最高，虎纹捕鸟蛛毒素组与假手术组随之降低。其中生理盐水组与假手术组比较差异有非常显著性意义(P < 0.01)，虎纹捕鸟蛛毒素组与生理盐水组比较差异有非常显著性意义(P < 0.01)，见图2B，表1。
2.3.3 Fas相关死亡结构域蛋白mRNA Fas相关死亡结构域蛋白的mRNA表达以生理盐水组最高，虎纹捕鸟蛛毒素组次之，假手术组最低。其中生理盐水组与假手术组比较差异有非常显著性意义(P < 0.01)，虎纹捕鸟蛛毒素组与假手术组比较差异有非常显著性意义(P < 0.01)，虎纹捕鸟蛛毒素组与生理盐水组比较差异虽无显著性意义，但虎纹捕鸟蛛毒素组Fas相关死亡结构域蛋白mRNA的表达较生理盐水组呈下降趋势(表1，图2C)。
2.3.4 Caspase 8 mRNA Caspase 8 mRNA的表达以生理盐水组最高，虎纹捕鸟蛛毒素组与假手术组随之降低。其中生理盐水组与假手术组比较差异有非常显著性意义 (P < 0.01)，虎纹捕鸟蛛毒素组与生理盐水组比较虽无显著性意义，但其Caspase 8 mRNA的表达较生理盐水组呈下降趋势(图2D，表1)。

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引言

以脑细胞缺血缺氧为主症的脑血管病，以其高发病率、高死亡率、高致残率而严重危害人类健康，已成为当前人类三大死亡疾病之一。缺血性脑损伤易造成中枢神经系统的缺血、缺氧，引起神经元凋亡和坏死。细胞凋亡是缺血性细胞死亡的重要途径之一^[1]，它由多种因素启动，但凋亡的信号转导通路却相当保守，死亡受体通路是外在途径。因此，最大限度地阻止脑神经细胞的凋亡是治疗颅脑损伤的重要环节，但目前尚无疗效确切的药物问世。

近一二十年来，缺血性脑损伤已跃居成为中国疾病死亡原因的首位。据北京市心肺血管疾病研究所调查结果^[2]，中国脑血管病的发病率为109.7410万，死亡率为76.7810万，其中缺血性脑血管病占56.6%-80%，且仍在逐年上升。在诸多脑损伤性疾病中，缺血性脑损伤易造成中枢神经系统的缺血、缺氧，引起神经元凋亡和坏死，因此最大限度地阻止神经细胞的凋亡和坏死是治疗脑损伤的重要环节。现已证明Ca²⁺在维持内环境稳定、多种腺体分泌及神经递质的释放中均有重要作用，钙稳态及钙拮抗剂的研究为多种神经系统疾病和神经元损伤治疗提供了依据。

现已证明，细胞内Ca²⁺超载是诱导缺血性脑细胞死亡的主要原因之一^[3]，钙离子通道阻断剂能够抑制Ca²⁺内流，因而被广泛应用于缺血性脑神经元保护研究。虎纹捕鸟蛛毒素是从国内珍稀蜘蛛虎纹捕鸟蛛(Selenocosmia huwena)粗毒中分离纯化的一种多肽类神经毒素，经离子通道分析技术证明是一种作用于突触前膜的N型钙离子通道阻断剂^[4]，与已通过美国FDA批准上市的新型多肽镇痛药芋螺毒素ω-conotoxin，MVIA(合成品SNX-111)具有类似的结构模体和相似的生物学功能^[5-6]。SNX-111现已成为第一个运用于临床治疗神经性头痛和缺血性脑损伤的多肽类钙拮抗剂，并取得了良好的疗效^[7-8]。因而虎纹捕鸟蛛毒素作为国内Ⅰ类镇痛新药开发，在已完成其临床前动物实验并即将进入临床实验的基础上，尽快开展其在神经细胞保护作用方面的研究十分必要。

文章拟通过虎纹捕鸟蛛毒素蛛网模下腔注射，观察其对全脑缺血再灌注大鼠海马CA1区锥体细胞超微结构和胞内线粒体形态变化、海马组织肿瘤坏死因子凋亡通路中相关因子mRNA表达的影响，从肿瘤坏死因子凋亡信号转导通路方面深入探讨虎纹捕鸟蛛毒素对大鼠全脑缺血损伤模型神经保护作用的可能分子机制，为开发一种临床神经细胞保护新药提供理论研究基础。

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材料方法

设计：随机对照动物实验。

时间及地点：实验于2010年9月至2012年1月在湖南师范大学体育学院完成。

材料：

实验动物与分组：五六周龄健康雄性SD大鼠48只，体质量180-250 g，由中南大学湘雅医学院实验动物中心提供。大鼠随机分为3组：假手术对照组、生理盐水组、虎纹捕鸟蛛毒素组，每组16只，其中8只用于电镜观察，另8只用于RT-PCR检测。

虎纹捕鸟蛛毒素：由湖南师范大学蛋白质化学研究室分离纯化，深圳科兴公司制药厂加工成冻干粉针，规格 400 µg/瓶，批号000418，纯度99.5%，临用前用灭菌生理盐水配制，4 ℃冰箱保存。

实验方法：

阻断4根血管制作全脑缺血大鼠模型及药物干预：采用Pulsinelli“四血管阻断”全脑缺血损伤模型结合蛛网膜下腔置管经适当改进建立大鼠全脑缺血模型^[9-10]。麻醉大鼠，暴露第1颈椎，烧灼椎动脉。随即进行蛛网膜下腔置管：暴露寰枕后膜，将蛛网膜小心勾一小孔，插入PE管至蛛网膜下腔，进管深度约2 cm，外端约留5 cm长，埋管，缝合切口。手术24 h后，进行双侧颈总动脉夹闭，约10 min后松开动脉夹^[11]，缺血再灌注24 h。

给药途径为经留置的PE10管注入蛛网膜下腔。假手术组同上手术过程，不烧灼椎动脉，不夹闭不给药；虎纹捕鸟蛛毒素组(1.0 μg/kg)于颈总动脉夹闭后立即给药^[11]，生理盐水组于夹闭后注入等量生理盐水。虎纹捕鸟蛛毒素组与生理盐水组大鼠缺血再灌注后3 d，每天给药或等量生理盐水1次。

电镜标本制备：建模第4天麻醉后断颈处死大鼠，剪开大鼠颅骨取出大脑，沿正中线切开，取左半球剥离大脑皮层取出海马，放入3%戊二醛中4 ℃预固定2 h，经电镜材料常规处理后，上机观察。

RT-PCR测试方法：

海马总RNA分离与鉴定：Trizol试剂法提取海马组织总RNA，按试剂盒说明书操作。紫外分光光度法测定提取的总RNA的吸光度(A)值，A₂₆₀/A₂₈₀>1.7；琼脂糖凝胶电泳显示28S、18S、5S 3条电泳条带，表明所提取的总RNA无降解，可作为反转录反应的模板。

引物设计与合成：根据Gene Bank核酸数据库中大鼠肿瘤坏死因子α、肿瘤坏死因子受体Ⅰ、肿瘤坏死因子受体相关死亡结构域、Fas相关死亡结构域蛋白、Caspase8 cDNA序列，用生物软件Primer3.0自行设计PCR引物，由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。

RT-PCR：RT-PCR操作按常规进行。第1步反转录反应：反应总体积20 μL，取10 μL RNA于72 ℃变性2 min，冰浴2 min，再在EP管内加入4 μL MgCl₂、2 μL 10 * Buffer、2 μL dNTP、0.5 μL inhibitor、1 μL AMV反转录酶和1 μL Oligo primer，放入恒温箱内42 ℃、90 min，99 ℃、5 min，-20 ℃保存。第2步PCR反应：总反应体系为20 μL。往 20 μL EP管加80 μL无菌水，稀释至100 μL，作为cDNA模板；取1 μL cDNA模板，加入5×Buffer 4 μL，2.5 mmol/L dNTP 0.25 μL，GAPDH3’ 0.5 μL，GAPDH5’ 0.5 μL，上游引物1 μL，下游引物1 μL，Taq酶0.125 μL，无菌水 11.5 μL。PCR扩增条件：94 ℃ 5 min，94 ℃ 45 s，60 ℃ 45 s，72 ℃ 1 min，30个循环，72 ℃延伸10 min。第3步琼脂糖凝胶电泳：8 μL PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳，EB染色后，紫外灯下观察并拍照。用SimplePCI图像分析系统对电泳条带的灰度和面积进行分析，将标本灰度值和面积乘积与看家基因GAPDH的灰度和面积乘积的比值作为标本的半定量结果。以上检测过程均严格按照试剂盒说明书操作。

主要观察指标：①电镜下海马锥体细胞超微结构形态学观察。②大鼠海马组织肿瘤坏死因子α、肿瘤坏死因子受体Ⅰ、肿瘤坏死因子受体相关死亡结构域、Fas相关死亡结构域蛋白、Caspase8 mRNA RT-PCR结果分析。

统计学分析：实验数据以x(_)±s表示，采用SPSS 11.5统计软件进行分析，样本均数的比较采用单因素方差分析。P < 0.05为差异有显著性意义，P < 0.01为差异有非常显著性意义。

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讨论

虎纹捕鸟蛛毒素即是一种新型N型钙离子通道阻断剂^[12]，与第一个运用于临床治疗和缺血性脑损伤的多肽类钙拮抗剂SNX-111具有类似的结构模体和相似的生物学功能。在前期实验中，作者构建了大鼠全脑缺血再灌注损伤结合蛛网膜下腔置管动物模型^[13]，并在此模型上应用虎纹捕鸟蛛毒素对大鼠进行蛛网膜下腔注射并检测脑匀浆中超氧化物歧化酶、CAT活力及丙二醛浓度的变化。作者发现^[14]：虎纹捕鸟蛛毒素能使全脑缺血再灌注大鼠脑组织超氧化物歧化酶、CAT活力升高，丙二醛浓度降低。自由基是诱导缺血性脑细胞死亡的罪魁祸首之一^[1]，结果显示虎纹捕鸟蛛毒素能抑制氧自由基的产生，表明虎纹捕鸟蛛毒素可能具有抗缺血性脑损伤方面的作用。因此，在此研究基础上，继续开展其在神经细胞保护作用方面的研究十分必要。

细胞凋亡是生物体细胞受基因精确调控的主动消亡过程，有多种分子参与，多重信号转导通路介导其调控机制。目前，一般认为参与缺血性脑损伤细胞凋亡调控的有3条信号转导通路，分别是线粒体通路、死亡受体通路和内质网通路^[15]。线粒体是真核细胞内一种重要和独特的细胞器，近几年的资料已从多方面证明线粒体参与对凋亡的调控^[16-17]。在凋亡过程中，线粒体出现一系列的功能及形态变化，如线粒体膜通透性孔道的开放，跨膜电位的耗散，细胞色素C的释放，线粒体嵴断裂，空泡化等等，最终导致线粒体功能丧失，促进了细胞死亡^[18]。本实验的电镜结果显示，假手术组及虎纹捕鸟蛛毒素组大鼠海马细胞的线粒体嵴清晰可见，而生理盐水组线粒体嵴模糊不清，出现空泡化现象。因此作者认为虎纹捕鸟蛛毒素蛛网膜下腔注射能维持全脑缺血再灌损伤大鼠海马神经细胞线粒体基本正常形态。

死亡受体属于肿瘤坏死因子受体超家族。其中最典型的死亡受体之一是肿瘤坏死因子受体。肿瘤坏死因子通过肿瘤坏死因子受体Ⅰ介导其生物学活性，当与肿瘤坏死因子结合后，肿瘤坏死因子受体Ⅰ三聚体化，然后募集一个衔接蛋白肿瘤坏死因子受体相关死亡结构域，肿瘤坏死因子受体相关死亡结构域再募集其他几个衔接分子Fas相关死亡结构域蛋白，TRAF-2(TNFR-associated factor-2)和RIP(Receptor interactive protein)。Fas相关死亡结构域蛋白又称MORIT，是一个接头分子，是由208个氨基酸残基组成的相对分子质量23 000的蛋白质，它通过C端的DD与肿瘤坏死因子受体相关死亡结构域的DD结合，然后通过N端的死亡效应结构域(DED)与Caspase 8酶原中的类似结构结合，然后是Caspase 8前体的寡聚化，最终导致Caspases级联反应，诱导细胞凋亡^[19]；TRAF-2和RIP通过NFKB途径发挥抗凋亡作用。

综上所述，肿瘤坏死因子受体Ⅰ涉及到促凋亡及抗凋亡两种截然不同的信号转导途径，究竟肿瘤坏死因子受体Ⅰ活化后细胞是生存还是死亡则取决于双方信号水平的强弱对比即时机的不同^[20]。Berti等^[21]用实时定量RT-PCR检测了SD鼠大脑中动脉闭塞后3，6，12，24，72 h肿瘤坏死因子α和其他一些细胞因子、黏附分子mRNA的变化。结果发现，与未损伤半球相比，损伤区肿瘤坏死因子αmRNA的表达在3-24 h均上调，在6 h时达最高峰，与对照组相比升高了5倍，说明肿瘤坏死因子α参与了缺血性脑损伤过程。Wang等^[22]认为脑损伤后的早期阶段，肿瘤坏死因子αmRNA的过度表达对损伤的组织有害；而在损伤后的恢复时期，肿瘤坏死因子αmRNA的低水平表达则能加速损伤组织的修复过程。

文章侧重于虎纹捕鸟蛛毒素对全脑缺血再灌损伤大鼠肿瘤坏死因子凋亡通路中的促凋亡途径的影响进行探讨。实验结果显示：全脑缺血损伤性再灌注3 d后，生理盐水组大鼠海马组织促凋亡因子mRNA表达水平均出现了不同程度的上调，而以虎纹捕鸟蛛毒素蛛网膜下腔治疗性注射，从启动/起始阶段、中间衔接阶段及效应阶段有效保护中枢神经细胞，使其mRNA表达水平均较生理盐水组下降，表明虎纹捕鸟蛛毒素具有明显的抗神经细胞凋亡作用。

综上所述，虎纹捕鸟蛛毒素能维持线粒体基本形态，降低肿瘤坏死因子凋亡通路中促凋亡因子肿瘤坏死因子α、肿瘤坏死因子受体Ⅰ、肿瘤坏死因子受体相关死亡结构域、Fas相关死亡结构域蛋白、Caspase8 mRNA表达，其作用机制可能是虎纹捕鸟蛛毒素作为一种新型N型钙通道阻断剂，能有效阻断胞外Ca²⁺的大量内流，使细胞内游离钙降低，减少由于细胞内钙超载而引起的一系列病理损害，从而保护神经细胞，尤其是中枢神经细胞正常的结构与功能^[23-24]。但其确切作用机制有待进一步深入研究。

死亡受体介导的信号转导通路与脑缺血再灌注损伤密切相关。阐明肿瘤坏死因子死亡受体通路在全脑缺血再灌注损伤中的作用机制对于有效防治由此造成的中枢神经系统损害具有重要的理论意义，也为其临床治疗提供新思路和治疗手段。

虎纹捕鸟蛛毒素对脑缺血模型大鼠海马肿瘤坏死因子凋亡通路的影响

Effects of huwentoxin on tumor necrosis factor apoptotic pathway in the hippocampus of a rat model of cerebral ischemia

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