肺缺血再灌注损伤模型犬接受去氢骆驼蓬碱干预后无明显肺保护作用

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2014.36.012

摘要/Abstract

摘要：

背景：炎性细胞活化、氧自由基的产生是肺缺血再灌注损伤发生的重要因素。在常用的肺保护液中增加可能具有抑制炎症、抗氧化作用的药物，使保护液进行一定的改良，对肺缺血再灌注损伤的研究及保护移植肺的功能具有重要的意义。
目的：探讨去氢骆驼蓬碱对犬肺缺血再灌注损伤的作用。
方法：将12只健康杂交犬随机分为两组，每组6只。建立犬肺缺血再灌注损伤模型，采用顺灌方式行保护液肺灌注，实验组给予低钾右旋糖苷保护液+去氢骆驼蓬碱溶液灌注，对照组给予低钾右旋糖苷保护液。缺血 2 h后，恢复左肺循环，两组于再灌注后采集左肺组织及血液标本，检测细胞因子水平，计算肺湿/干质量比；收集支气管肺泡灌洗液，观察各项病理指标；连续测量记录主肺动脉压、左肺动脉压和右肺动脉压。
结果与结论：两组于再灌注2，4 h时左肺组织及血液中的白细胞介素17、肿瘤坏死因子α及内皮素1水平差异均无显著性意义(P > 0.05)，两组再灌注4 h后的支气管肺泡灌洗液中性粒细胞数目、淋巴细胞数目、肺泡损伤指数及血管壁水肿程度差异均无显著性意义(P > 0.05)，两组肺湿/干质量比差异均无显著性意义(P > 0.05)，经方差分析，两组主肺动脉压、左肺动脉压及右肺动脉压差异均无显著性意义(P > 0.05)。结果可见通过对细胞因子、病理指标、肺组织湿/干质量比及肺动脉压力分析，去氢骆驼蓬碱在犬肺原位常温缺血再灌注损伤模型中没有明显的肺保护作用。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：肾移植；肝移植；移植；心脏移植；组织移植；皮肤移植；皮瓣移植；血管移植；器官移植；组织工程

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关键词: 实验动物, 组织构建, 去氢骆驼蓬碱, 低钾右旋糖酐液, 缺血再灌注, 损伤, 肺, 常温, 动物模型

Abstract:

BACKGROUND: Inflammatory cell activation and the generation of oxygen free radicals are important factors of lung ischemia-reperfusion injury. Adding the drugs with anti-inflammation and antioxidant effects into the lung preservation solution used, can improve the protection fluid, and play a crucial role in the study of lung ischemia-reperfusion injury and protection of the function of transplanted lung.
OBJECTIVE: To discussion the effect of harmine in canine model of pulmonary ischemia-reperfusion injury.
METHODS: Twelve healthy hybrid dogs were randomly divided into two groups, with six rats in each group. A canine model of lung ischemia-reperfusion injury was established, and the protecting liquid was perfused with the clockwise irrigation method. Control group: low potassium dextran protective fluid; experimental group: low potassium dextran + harmine protective fluid. After 2 hours of ischemia, the left lung circulation was recovered. The left lung tissue and blood samples were collected from two groups of animal models after reperfusion, and their cytokines levels and the lung wet/dry weight ratio were detected and calculated. Bronchoalveolar lavage fluid was collected to observe the pathological indicators. The main pulmonary artery pressure, left and right pulmonary artery pressure were recorded by continuous monitoring.
RESULTS AND CONCLUSION: There were no statistically significant differences in the interleukin-17, tumor necrosis factor α and endothelin 1 content in the left lung tissue and the blood between the two groups at 2 and 4 hours after reperfusion (P > 0.05). After 4 hours of reperfusion in both groups, the neutrophil number, the
number of lymphocytes, alveolar edema index, and vascular wall damage in bronchoalveolar lavage fluid showed no statistically significant differences (P > 0.05). Through the analysis of variance, the main pulmonary artery pressure, left pulmonary artery pressure and right pulmonary artery pressure also had no statistical significance between the two groups (P > 0.05). By the analysis of cytokines, pathological indicators, lung wet/dry weight ratio, and pulmonary arterial pressure, harmine has no significant lung protection effect in canine model of lung ischemia-reperfusion injury.

中国组织工程研究杂志出版内容重点：肾移植；肝移植；移植；心脏移植；组织移植；皮肤移植；皮瓣移植；血管移植；器官移植；组织工程

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Key words: models, animal, reperfusion injury, lung, dextrans, harmine

中图分类号:

R318

张皓，齐海，李元明，陈家骅. 肺缺血再灌注损伤模型犬接受去氢骆驼蓬碱干预后无明显肺保护作用[J]. 中国组织工程研究, 2014, 18(36): 5805-5812.

Zhang Hao, Qi Hai, Li Yuan-ming, Chen Jia-hua. Harmine has no lung-protective effects in a canine model of lung ischemia-reperfusion injury[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2014, 18(36): 5805-5812.

图/表（结果） 6

2.1 肺组织及血液中白细胞介素17、肿瘤坏死因子α、内皮素1水平分析 实验组(低钾右旋糖苷+去氢骆驼蓬碱保护液灌洗组)与对照组(低钾右旋糖苷保护液灌洗组)中肺组织及血液的白细胞介素17、肿瘤坏死因子α、内皮素1水平进行比较，经方差齐性检验，方差齐(P > 0.05)，采用两样本t 检验。经分析，两组白细胞介素17、肿瘤坏死因子α、内皮素1水平差异均无显著性意义(P > 0.05，表1)。从实际测得数据均值来看，再灌注2 h时，实验组中左肺组织及血液的白细胞介素17、肿瘤坏死因子α及血液中的内皮素1水平较对照组有所降低，说明肺损伤程度较对照组有所减轻；再灌注4 h时，实验组中左肺组织及血液的白细胞介素17、肿瘤坏死因子α、内皮素1水平较对照组有所升高，说明肺损伤程度较对照组有所加重。

2.2 再灌注4 h后肺组织内病理指标分析 实验组与对照组中再灌注4 h的肺泡损伤指数、血管壁水肿程度、支气管肺泡灌洗液(BALF)中性粒细胞及淋巴细胞数目进行比较。经方差齐性检验，两组肺泡损伤指数进行比较方差不齐 (P =0.013)，采用t' 检验，其余采用两样本t 检验。经分析，两组中的肺泡损伤指数、血管壁水肿程度、支气管肺泡灌洗液中性粒细胞及淋巴细胞数目差异均无显著性意义(P > 0.05，表2)。从实际测得数据均值来看，实验组中的肺泡损伤指数、灌洗液中性粒细胞数目较对照组有所降低，说明肺损伤程度有所减轻；而血管壁水肿程度、灌洗液淋巴细胞数目较对照组有所升高，说明肺损伤程度有所加重。

2.3 再灌注4 h后左肺湿/干质量比分析 实验组与对照组再灌注4 h后的左肺组织湿/干质量比分别为6.092± 1.870和5.695±0.174，经方差齐性检验，方差齐(P > 0.05)，采用两样本t 检验。经分析，两组肺湿/干质量比差异无显著性意义(t=0.518，P > 0.05)。从实际测得数据均值来看，实验组肺湿/干质量比较对照组有所升高，说明实验组肺水肿程度较对照组有所加重(图1)。

2.4 肺动脉压力分析 采用单因素方差分析，两组的主肺动脉压、左肺动脉压及右肺动脉压差异均无显著性意义(P > 0.05，表3)。从图2，3可以看出，实验组的左肺动脉压均值在开放循环和开放后30 min最高，随后出现下降，在开放后150 min出现回升，之后缓慢下降后维持在26 mm Hg左右；对照组左肺动脉压均值在开放循环后出现缓慢上升，在开放后120 min达到峰值，随后出现缓慢下降后维持在30 mm Hg左右。从实际测得的数据均值来看，实验组的主肺动脉压、左肺动脉压及右肺动脉压均值低于对照组，说明实验组肺循环阻力较对照组有所降低，肺血管收缩程度较对照组有所减轻，机制可能与血管舒张因子的生成、释放有关，有待于进一步研究证实。单从本实验肺动脉压力进行分析，实验组的肺保护程度比对照组好。

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引言

随着医学技术的发展，器官移植在临床上成为了现实和可能。肺移植对于终末期肺部疾病是一种有效的治疗方法^[1]，然而，肺缺血再灌注损伤的出现，成为早期移植肺失败的主要原因，导致移植后发生原发性移植肺功能障碍^[2]。肺缺血再灌注损伤是某种原因使肺组织遭受一定时间的缺血，恢复血液灌流(再灌注)后，缺血、缺氧引起的肺损伤没有减轻，反而加重的病理现象^[3]。它常见于肺移植、肺叶切除、体外循环等，尤其在肺移植手术中发生率最高^[4-6]。因此，减轻肺缺血再灌注损伤以及阐明其发病机制已经成为亟待解决的难题。

多年来，针对如何减轻肺缺血再灌注损伤进行了大量的实验和临床研究，但极少具有应用价值^[7]。研究证实，目前最为有效、稳定的办法是行保护液肺灌注。常用的肺保护液分两类，一类是细胞内液型(高钾低钠)保护液，以EC(Euro-Collins)液为代表；另一类为细胞外液型(低钾高钠)保护液，以低钾右旋糖酐(LPD)液为主。1991年，第2届国际终末期肺疾病移植会议明确EC液作为临床肺保护液^[8]。但学者们对两类不同保护液的肺保护作用看法不一，大多数认为：细胞内液型保护液含有高浓度K⁺，可抑制血管内皮细胞及平滑肌细胞膜内K⁺外流，导致细胞膜静息电位的绝对值减小，易使细胞膜外Na⁺内流，引起细胞膜去极化、发生动作电位，触发Ca通道开放、Ca²⁺向膜内流动，造成平滑肌细胞收缩、内皮细胞释放内皮素，从而导致血管收缩，增加肺循环阻力和促进肺部水肿，进而加重肺损害。而含有低浓度K⁺的低钾右旋糖酐液无此现象^[9]。对于K⁺浓度的适宜性问题，Bando等^[10]和Muller等^[11]进行了深入研究，证实了细胞外液型保护液优于细胞内液型保护液，提出了灌注液K⁺的浓度不应太高也不应太低，最适宜在20-40 mmol/L。除此之外，低钾右旋糖酐液在保护肺泡上皮功能和内皮细胞新陈代谢方面与EC液比较也有一定的优势^[12]。Gamez等^[13]通过临床研究报道，在肺移植后早期恢复阶段，低钾右旋糖酐液可以明显降低约50%的肺缺血再灌注损伤发生率。因此对于肺保护来说，特别是在早期移植物功能的保护方面，细胞外液型保护液较细胞内液型更有应用价值^[14]。现今，临床治疗和实验研究中多使用低钾右旋糖酐液作为肺保护液的首选，除低浓度钾对血管有保护作用外，还认为含有的葡萄糖可以为细胞供能以及增加能量储备，提高移植肺的功能。Chu等^[15]提出，在保护液中添加其他保护成分比单纯使用肺保护液更有价值。如有学者报道在低钾右旋糖酐液中增加参附注射液、谷胱甘肽、西地那非等，都取得了较好的肺保护效果。因此在肺保护液中添加药物成分，对其进行改良，成为减轻肺缺血再灌注损伤研究的重点和方向。

去氢骆驼蓬碱又称为哈尔明碱(harmine，HM)，为β-咔啉类生物碱，是植物骆驼蓬种子中的主要成分^[16-17]。近几年，不少学者对去氢骆驼蓬碱的药理作用进行了研究，得出不同的结论。Khan等^[16]发现去氢骆驼蓬碱对用肾上腺素和氯化钾溶液处理后收缩的大鼠离体胸部大动脉有血管舒张作用，其机制与促进血管内皮细胞释放血管舒张因子及微弱的与Ca²⁺通道结合，非竞争性抑制Ca²⁺内流作用有关。Berrougui等^[18]研究认为骆驼蓬碱能够舒张血管，去氢骆驼蓬碱则无此作用。Moura等^[19]研究提出去氢骆驼蓬碱可以作为活性氧的清除剂。Chen等^[20]及Yamazaki等^[21]研究发现去氢骆驼蓬碱可以抑制肿瘤坏死因子α、诱导型一氧化氮合酶的产生，来发挥抗炎作用。Bi等^[22]通过小鼠实验发现去氢骆驼蓬碱能够减轻肠系膜缺血再灌注损伤，提出活性氧增多和炎性细胞活化在缺血再灌注损伤中扮演重要角色，认为β-咔啉类生物碱具有潜在的抗氧化能力。

目前国内外文献报道中，尚未见有关去氢骆驼蓬碱对肺缺血再灌注损伤作用的研究。本实验对低钾右旋糖酐液进行改良(加入去氢骆驼蓬碱液)，以犬模拟临床肺移植过程中出现的肺缺血再灌注损伤，通过观测白细胞介素17、肿瘤坏死因子α、内皮素1、肺泡损伤指数、支气管肺泡灌洗液中性粒细胞及淋巴细胞数目、肺湿/干质量比、肺动脉压等实验指标，探讨去氢骆驼蓬碱对犬肺缺血再灌注损伤的影响及可能机制。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：肾移植；肝移植；移植；心脏移植；组织移植；皮肤移植；皮瓣移植；血管移植；器官移植；组织工程
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材料方法

设计：随机对照动物实验。

时间及地点：实验于2009年9月至2012年11月在新疆医科大学第二附属医院外科实验中心完成。

材料：

实验动物：健康成年杂交犬12只，雌雄不限，体质量20-31 kg，平均(27.333±3.339) kg，犬龄12-16个月，平均(13.668±1.435)个月，由新疆医科大学第二附属医院外科实验中心提供。实验前1周进行动物观察，手术前给予禁食12 h，禁水4 h。12只犬的体质量、性别、年龄经统计学分析差异无显著性意义。该实验方案经过新疆医科大学第二附属医院实验动物伦理委员会审查并批准，所有实验动物得到了人道关怀。

实验方法：

实验分组：对实验犬依次编号(1-12号)，按照随机排列表方法将12只犬分为实验组和对照组，每组6只。实验组为低钾右旋糖苷+去氢骆驼蓬碱保护液灌洗组；对照组为低钾右旋糖苷保护液灌洗组。

建立犬肺原位常温缺血再灌注损伤动物模型：①术前准备：室温27 ℃，呼吸机、心电监护仪安放于手术台一侧，手术器械摆放在手术托盘上，犬禁食12 h，禁水4 h。②麻醉处理：实验犬肌注阿托品，静脉给予芬太尼(10 μg/kg)、丙泊酚(2 mg/kg)进行药物麻醉。麻醉起效后，取仰卧位、备皮，四肢固定于手术台上。插导尿管接尿袋，行气管插管接呼吸机，机械通气：潮气量15-20 mL/kg，频率20次/min，氧浓度为60%。行持续心电监测，于左或右侧颈外静脉处插管，给予生理盐水溶液滴注维持。③手术操作：备皮区碘伏消毒3遍，铺无菌巾。选择双侧第4或第5肋间，作横行切口，离断胸骨进入胸腔。纵行切开心包并悬吊(左侧部分悬吊)，解剖肺动脉主干及左右各支、左右肺静脉上中下各支及左主支气管并充分游离、暴露。主肺动脉近心端插入测压管，荷包缝合固定，持续记录犬主肺动脉压、左右肺动脉压(测定时阻断对侧)，采用间歇测定法，每30 min/次。左肺动脉远心端置入灌注管，荷包缝合固定。测压管、灌注管内推注低分子肝素钠(1 mL/kg)。阻断前左肺充气膨胀，右肺动脉绕带备阻断。用阻断钳夹闭左肺动脉近心端，直角钳阻断左主支气管，缝线结扎左肺淋巴管及左侧支气管动静脉。左肺上中下叶静脉近心端阻断，远心端造口。从左肺动脉灌注管内灌注37 ℃保护液，压力维持在18 mm Hg (1 mm Hg=0.133 kPa)，灌洗量以60 mL/kg计算，采用顺灌方式进行。实验组予低钾右旋糖苷保护液+去氢骆驼蓬碱溶液灌注，对照组予低钾右旋糖苷保护液。左肺常温阻断2 h后，予相应灌洗液左肺血管冲洗。拔出灌注管，结扎左肺动脉荷包缝合，左肺各支静脉造口处缝线打结闭合。最后开放左肺动脉及左主支气管，恢复左肺循环，呼吸机调整为双肺通气。④标本留取：左肺再灌注2 h后，取双侧等量肺组织，制备成肺组织匀浆标本。抽血液10 mL于抗凝试管并放置在离心机中，以转速1 500 r/min进行离心。5 min后取出试管，将上层血清吸出留取血清标本。左肺再灌注4 h后，取各犬左侧等量肺组织，用于肺组织湿/干质量比(W/D)的测定。其余标本留取方法同上。实验结束后，从气管中插入灌洗管至左肺组织，留置支气管肺泡灌洗液标本。将所有标本存放于-80 ℃冰箱中，以备检测。

肺组织及血液白细胞介素17、肿瘤坏死因子α、内皮素1的测定：将再灌注2，4 h时采集的肺组织匀浆及血液标本从-80℃冰箱中取出，运用ELISA检测试剂盒，对样品浓度进行测定。操作步骤如下：①取出酶联板，设立空白孔、标准孔及待测样品孔。空白孔加样品稀释液100 μL，标准孔加标准品100 μL，待测样品孔加实验标本100 μL。②每孔加检测溶液A、B工作液100 μL，酶标板加上覆膜，在 37 ℃电热恒温培养箱内反应60 min。③温育60 min后，弃去孔内液体，甩干并洗板。④每孔加底物溶液90 μL，酶标板加上覆膜，在37 ℃环境下避光显色。⑤每孔加终止溶液50 μL，进行终止反应，即蓝色变为黄色。⑥用酶联仪在 450 nm波长下进行比色，计算吸光度值。⑦得出数值后，在电脑上运用软件(curve expert 1.3)绘制曲线，对白细胞介素17、肿瘤坏死因子α、内皮素1水平进行计算分析。

肺组织湿/干质量比(W/D)测定：再灌注4 h后，取左肺组织用天平进行称质量，记录数值，然后放于80 ℃烘箱中24 h，取出肺组织再称质量，两者前后比值即为肺组织湿/干质量比。

肺泡损伤指数的计算：采用Murata等^[23]报道的方法，取适量肺组织，放入体积分数为10%甲醛标本固定液中 24 h，常规制备石蜡切片及经过苏木精-伊红染色后，在200倍光学显微镜下进行观察，连续计数10个视野下的肺泡总数并寻找损伤的肺泡(肺泡内出现红细胞或/和白细胞数>2称为肺泡损伤)。计算损伤肺泡数/肺泡总数×100%，即肺泡损伤指数，作为衡量和评价肺组织损伤轻重的指标。

血管壁水肿程度及支气管肺泡灌洗液(BALF)中性粒细胞、淋巴细胞数目的测定：观察肺部血管及周围组织肿胀情况，分别测量血管腔的内外径，两者的比值用来反映血管壁水肿程度。支气管肺泡灌洗：犬肺缺血再灌注4 h后，在颈部气管下段作一T形切口，缓慢插入灌洗管，当遇到轻微阻力时，表明插管已达气管隆突部位，轻轻向左旋转插管，稍用力即可进入左主支气管，再次遇到阻力时停止插管，切口处与灌洗管结扎固定，从灌洗管中给予生理盐水溶液缓慢注入。灌洗完毕后，用注射器回抽灌洗液，回抽时应缓慢，避免过度用力导致人为损伤气道。重复灌洗、回收液体3次后，将灌洗液标本离心(转速：1 500 r/min)。10 min后，从离心机中取出标本，去除上清液，留取细胞沉淀物进行涂片、苏木精-伊红染色，放于显微镜下观察并计数中性粒细胞、淋巴细胞数目。

主要观察指标：肺组织及血液白细胞介素17、肿瘤坏死因子α、内皮素1水平；肺组织湿/干质量比、肺泡损伤指数、支气管肺泡灌洗液中性粒细胞及淋巴细胞数目、肺动脉压。

统计学分析：运用SPSS 20.0统计软件进行分析，所有实验数据采用x(_)±s表示。两组间计量资料比较，先行正态性检验，判断是否服从正态分布(不服从则行数据转换，再进行判断)，资料服从正态分布后，行方差齐性检验(Levene’s Test)。若方差齐，采用两独立样本t 检验；若方差不齐，采用t' 检验。两组间不同时间段监测主肺动脉压、左肺动脉压、右肺动脉压属于重复测量资料，两组间进行比较，采用单因素方差分析(ANOVA)。设定检验水准α=0.05，即P < 0.05时认为差异有显著性意义。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：肾移植；肝移植；移植；心脏移植；组织移植；皮肤移植；皮瓣移植；血管移植；器官移植；组织工程

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讨论

20世纪80年代，McCord^[24]首次提出缺血再灌注损伤的概念，自此对缺血再灌注损伤的研究迅速成为热点。近年来大量的实验和临床研究发现，由于肺外科手术的发展进步，肺缺血再灌注损伤导致肺及机体产生严重的损伤，已经日趋受到人们的重视^[25]。肺缺血再灌注损伤是一个复杂的病理生理过程，机制尚不清楚。研究表明肺缺血再灌注损伤的发生是一个多因素相互作用的结果，可能与氧自由基大量产生及氧化应激^[26]、钠钾泵失活、三磷酸腺苷生成减少、细胞内钙浓度失衡^[27]、白细胞活化引起炎症反应、微血管通透性增高及肺表面活性物质减少等因素有关^[28-29]。

一些研究表明，细胞因子参与肺缺血再灌注损伤的炎症反应，是肺缺血再灌注损伤的间接反应指标，对于评价移植肺功能具有重要意义。白细胞介素17是一种细胞因子，已明确其与中性粒细胞活化^[30]、微生物脂肽诱导^[31]、缺血再灌注损伤及急慢性排斥反应有关^[32-35]，在肺的宿主防御和气道重塑中发挥重要作用^[36]。白细胞介素17主要由CD4⁺淋巴细胞产生^[37]，CD8⁺淋巴细胞和嗜酸性粒细胞也可少量释放^[36]。通过动物和人类的组织细胞研究发现，白细胞介素17可以对许多细胞因子如白细胞介素8^[38]、白细胞介素6、单核细胞趋化因子1^[39-40]、粒细胞集落刺激因子、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子、生长调节癌基因1和血管内皮生长因子产生影响以及对成纤维细胞、上皮细胞、内皮细胞、气道平滑肌细胞产生促炎作用^[41-44]。肿瘤坏死因子α是启动肺缺血再灌注损伤炎症反应的重要细胞因子，主要由巨噬细胞和肺泡内皮细胞释放。研究显示，肺缺血再灌注后肿瘤坏死因子α表达明显增加^[45]，它不仅可以直接损伤肺毛细血管内皮细胞, 还可以诱导其他细胞因子的产生和释放，并与其他细胞因子相互作用，从而间接引起肺组织损伤^[46]。

本实验两组白细胞介素17、肿瘤坏死因子α水平进行比较，差异均无显著性意义(P > 0.05)。但从所测得数据发现再灌注2 h时，实验组的白细胞介素17、肿瘤坏死因子α含量较对照组有所降低。因此，作者推测去氢骆驼蓬碱在再灌注早期(2 h)可能有较弱的抑制炎症作用。血管内皮素是内皮细胞分泌的由21个氨基酸组成的肽类物质，在人体中存在内皮素1、内皮素2、内皮素3。其中，内皮素1活性最强^[47]。内皮素1作用于内皮素A受体产生缩血管效应；作用于内皮素B受体，促使内皮细胞释放血管舒张因子，产生舒张血管效应。内皮素1、一氧化氮是影响血管舒缩功能的因子，两者相互刺激和抑制性调节，它们的平衡对维持正常肺血管的张力和血管渗透性具有重要意义^[48]。对于内皮素1在肺缺血再灌注损伤的作用存在争议，大多数学者认为内皮素1增多可以加重肺缺血再灌注损伤。本实验两组内皮素1含量比较差异无显著性意义(P > 0.05)。但从实验测得的数据均值来看，再灌注2 h时，血液中的内皮素1含量较对照组有所降低。从图2，3可以看出，实验组再灌注2 h时，左肺动脉压均值较对照组有所降低，主肺动脉压均值与右肺动脉压均值也有类似现象。因此，作者解释这可能是去氢骆驼蓬碱促使血管内皮细胞释放一氧化氮，反馈性抑制内皮素1生成，使血液的内皮素1含量减少及抵消了一定的内皮素1缩血管作用，从而导致血压值有所降低。有研究表明，内皮素1与肺水肿指标肺湿/干质量比存在正相关性。从实验测得的数据均值来看，无论再灌注2 h还是4 h，实验组中左肺组织的内皮素1含量较对照组有所增高，虽然两组左肺湿/干质量比差异无显著性意义(P > 0.05)，但从图1得知，实验组的左肺湿/干质量比均值较对照组有所增高。因此，作者认为实验结果可能与左肺组织中内皮素1含量有关。

去氢骆驼蓬碱的药理作用十分广泛，目前研究报道有抗肿瘤^[49]、可逆性抑制单胺氧化酶^[50]、镇痛止痒^[51]、舒张血管^[52]、抗炎杀菌^[53]、抑制乙酰胆碱酯酶活性^[54]、抗寄生虫等作用。但现在比较明确的是去氢骆驼蓬碱可以作为单胺氧化酶抑制剂治疗中枢神经系统疾病，如抑郁、帕金森病等，以及具有降低肿瘤细胞恶性程度的作用。对于去氢骆驼蓬碱是否具有促进一氧化氮的产生和释放来舒张血管及抑制炎症反应的作用，目前存在着争议。

本实验研究有一定的局限性。首先，采用随机对照实验，以犬作为研究对象，大多数国内文献报道实验动物多采用鼠和兔。犬在建立缺血再灌注模型时，不仅操作视野较小动物(鼠、兔)模型更为广阔，而且其器官解剖及生理功能都与人类接近，对临床研究肺缺血再灌注损伤有一定的指导意义。不足之处是采用杂种犬作为实验对象，其生理状况、耐受时间、基因等方面的差异性，都会给实验结果带来一定的影响。另外，实验犬的数量也应增加，加大一定的样本量，进而提高实验的可信度和减小一定的误差；其次，灌注液的温度是一个重要因素，多数研究报道采用低温(主要为4 ℃)灌注液进行肺灌注，但对于低温灌注(冷灌注)还是热灌注一直存在争议。有学者认为，低温可以减少氧自由基的形成，减轻细胞损伤，同时也抑制了钠-钾ATP酶活性，导致细胞膜内Na⁺浓度升高，引起细胞水肿。作者采用37 ℃灌注液进行肺灌注，能否减轻肺缺血再灌注损伤机制尚不明确，另外在国内文献报道中该方式也比较少见；再次，选择左肺充气状态下进行实验。实验肺是萎陷、膨胀还是持续通气有益？Toledo-Pereyra等^[55]认为常温下将肺萎陷一定时间，其功能不受影响。有学者认为，灌注保护液时肺保持充气状态，可以降低肺血管阻力，有利于保护液的均匀分布以及肺表面活性物质得到较好保护^[56]。最后，灌注方法的不同，也可以影响实验结果。目前常用的是顺行灌注和逆行灌注两种。Kofidis等^[57]通过实验证实，逆行灌注效果优于顺行灌注。Roe等^[58]研究发现, 采用顺行灌注保护液可以降低早期移植物功能障碍的风险，原因可能与此灌注方法提高了灌注液在肺实质的有效分布有关。本实验采用了顺行灌注肺保护液的方法。

本实验在低钾右旋糖酐液中加入去氢骆驼蓬碱，发现肺保护作用与低钾右旋糖酐液相比差异无显著性意义，对此作者认为有两种可能性，第一，去氢骆驼蓬碱本身具有较弱的减轻肺缺血再灌注损伤作用，但被低钾右旋糖酐液的保护作用掩盖；第二，去氢骆驼蓬碱可以加重肺缺血再灌注损伤，但被低钾右旋糖酐液的保护作用抵消。通过观察两组细胞因子的变化，去氢骆驼蓬碱是否可以在缺血再灌注损伤早期 (2 h)减轻炎症反应及促进一氧化氮生成和释放的作用，有待于进一步研究探讨。

小结：实验研究表明，通过对白细胞介素17、肿瘤坏死因子α、内皮素1、肺动脉压力、肺泡损伤指数及肺湿/干质量比等实验指标的统计分析，作者认为：去氢骆驼蓬碱在犬肺原位常温缺血再灌注损伤动物模型中没有明显的肺保护作用。