高迁移率族蛋白B1对磷酸钙诱导巨噬细胞释放炎症因子的协同作用

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2014.33.012

中国组织工程研究 ›› 2014, Vol. 18 ›› Issue (33): 5317-5322.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.2014.33.012

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高迁移率族蛋白B1对磷酸钙诱导巨噬细胞释放炎症因子的协同作用

奉有才，邓耀良，陶芝伟，王翔，黎承扬，黄鹏，吴博

广西医科大学第一附属医院泌尿外科，广西壮族自治区南宁市 530021

出版日期:2014-08-13 发布日期:2014-08-13
通讯作者: 邓耀良，教授，博士，博士生导师，硕士生导师，主任医师，广西医科大学第一附属医院泌尿外科，广西壮族自治区南宁市 530021
作者简介:奉有才，男，1986年生，广西壮族自治区贺州市人，瑶族，广西医科大学第一附属医院泌尿外科在读硕士，主要从事泌尿系结石的基础与临床研究。
基金资助:
国家自然科学基金(03101209018)

Synergistic effect of high mobility group protein B1 on calcium phosphate-induced release of inflammatory cytokines from macrophages

Feng You-cai, Deng Yao-liang, Tao Zhi-wei, Wang Xiang, Li Cheng-yang, Huang Peng, Wu Bo

Department of Urology, First Affiliated Hospital of Guangxi Medical University, Nanning 530021, Guangxi Zhuang Autonomous Region, China

Online:2014-08-13 Published:2014-08-13
Contact: Deng Yao-liang, M.D., Professor, Doctoral and Master’s supervisor, Chief physician, Department of Urology, First Affiliated Hospital of Guangxi Medical University, Nanning 530021, Guangxi Zhuang Autonomous Region, China
About author:Feng You-cai, Studying for master’s degree, Department of Urology, First Affiliated Hospital of Guangxi Medical University, Nanning 530021, Guangxi Zhuang Autonomous Region, China
Supported by:
the National Natural Science Foundation of China, No. 03101209018

摘要/Abstract

摘要：

背景：研究表明，巨噬细胞及其炎症反应参与了肾结石的发生发展。前期实验发现结石晶体可刺激巨噬细胞释放高迁移率族蛋白B1。
目的：观察高迁移率族蛋白B1对磷酸钙诱导巨噬细胞释放白细胞介素1β、白细胞介素6、肿瘤坏死因子α、单核细胞趋化因子1的协同作用。
方法：实验分两部分：①将成功诱导为巨噬细胞的U937细胞分为空白组、100 mg/L磷酸钙组、100 μg/L高迁移率族蛋白B1组、100 mg/L磷酸钙+100 μg/L高迁移率族蛋白B1组，干预1，2，4 h后收集细胞上清液。②将已成功诱导为巨噬细胞的U937细胞分为100 mg/L磷酸钙组、磷酸钙+10 μg/L高迁移率族蛋白B1组、磷酸钙+50 μg/L高迁移率族蛋白B1组、磷酸钙+100 μg/L高迁移率族蛋白B1组，干预4 h后收集细胞上清液。Elisa法检测白细胞介素1β、白细胞介素6、肿瘤坏死因子α、单核细胞趋化因子1水平。
结果与结论：ELISA结果显示，磷酸钙组，100 μg/L高迁移率族蛋白B1组上清液白细胞介素1β、白细胞介素6、肿瘤坏死因子α、单核细胞趋化因子1质量浓度均高于空白组，磷酸钙+100 μg/L高迁移率族蛋白B1组上清液上述因子质量浓度均显著高于其他3组(P < 0.05)，且呈时间依赖性。不同质量浓度高迁移率族蛋白B1+磷酸钙组细胞上清液白细胞介素1β、白细胞介素6、肿瘤坏死因子α、单核细胞趋化因子1水平均显著高于磷酸钙组(P < 0.05)，且呈浓度依赖性。结果表明，磷酸钙及高迁移率族蛋白B1均可诱导巨噬细胞释放白细胞介素1β、白细胞介素6、肿瘤坏死因子α、单核细胞趋化因子1；高迁移率族蛋白B1可协同磷酸钙诱导巨噬细胞释放白细胞介素1β、白细胞介素6、肿瘤坏死因子α、单核细胞趋化因子1。

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关键词: 组织构建, 组织工程, 高迁移率族蛋白B1, 炎症因子, 巨噬细胞, 协同作用, 细胞培养技术, 磷酸钙晶体, 炎症, 肾结石, 国家自然科学基金

Abstract:

BACKGROUND: More and more evidence suggests that macrophages and inflammation reactions are involved in the formation and development of nephrolithiasis. Previous studies have found that calculi crystals can stimulate macrophages to release high mobility group protein B1.
OBJECTIVE: To investigate the synergistic effect of high mobility group protein B1 in calcium phosphate induced release of interleukin-1β, interleukin-6, tumor necrosis factor α and monocyte chemotactic factor 1 from human macrophages.
METHODS: (1) The induced U937 cells were respectively stimulated with RPMI (blank), 100 mg/L calcium phosphate, 100 μg/L high mobility group protein B1 and 100 mg/L calcium phosphate+100 μg/L high mobility group protein B1 for 1, 2 and 4 hours to collect cell supernatant. (2) The induced U937 cells were respectively stimulated with 100 mg/L calcium phosphate, 100 mg/L calcium phosphate+10 μg/L high mobility group protein
B1, 100 mg/L calcium phosphate+50 μg/L high mobility group protein B1, 100 mg/L calcium phosphate+100 μg/L high mobility group protein B1 for 4 hours to collect cell supernatant. Levels of interleukin-1β, interleukin-6, tumor necrosis factor α and monocyte chemotactic factor 1 were determined by ELISA.
RESULTS AND CONCLUSION: The levels of interleukin-1β, interleukin-6, tumor necrosis factor α and monocyte chemotactic factor 1 in the cell culture supernatant of 100 mg/L calcium phosphate group and 100 μg/L high mobility group protein B1 group were both higher than those in the blank group in a time-dependent manner (P < 0.05). The levels of interleukin-1β, interleukin-6, tumor necrosis factor α and monocyte chemotactic factor 1 in the cell culture supernatant of different concentrations of high mobility group protein B1 groups were all higher than those in the
100 mg/L calcium phosphate group in a concentration-dependent manner (P < 0.05). The results suggest that both calcium phosphate and high mobility group protein B1 can induce the release of interleukin-1β, interleukin-6, tumor necrosis factor α and monocyte chemotactic factor 1 from human macrophages and the high mobility group protein B1 has the synergistic effect with calcium phosphate to induce interleukin-1β, interleukin-6, tumor necrosis factor α and monocyte chemotactic factor 1 from human macrophages.

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Key words: kidney calculi, high mobility group proteins, interleukin-1beta, interleukin-6, tumor necrosis factor-alpha, macrophages

中图分类号:

R318

奉有才，邓耀良，陶芝伟，王翔，黎承扬，黄鹏，吴博. 高迁移率族蛋白B1对磷酸钙诱导巨噬细胞释放炎症因子的协同作用[J]. 中国组织工程研究, 2014, 18(33): 5317-5322.

Feng You-cai, Deng Yao-liang, Tao Zhi-wei, Wang Xiang, Li Cheng-yang, Huang Peng, Wu Bo. Synergistic effect of high mobility group protein B1 on calcium phosphate-induced release of inflammatory cytokines from macrophages [J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2014, 18(33): 5317-5322.

图/表（结果） 6

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引言

泌尿系结石以肾结石居多，严重威胁着人类健康，而肾结石的主要成分为草酸钙(CaOx)，约占80%^[1]。目前，关于肾结石成石机制有多种学说，其中Randall斑学说揭示了草酸钙肾结石的起源问题，因而日益受到重视。化学元素分析表明，Randall斑结晶主要成分为磷酸钙盐(CaP)^[2-3]，提示其形成与CaP盐密切相关。越来越多的证据表明，巨噬细胞及其炎症反应参与了肾结石的形成。Khan等^[4]研究发现，不论是动物实验模型或者结石患者肾脏内，结石晶体周围均存在单核/巨噬细胞浸润，产生炎症反应的现象。de Water等^[5]的研究亦证实在肾间质中吞噬结石晶体的主要细胞是巨噬细胞及多核巨细胞。最近，Okada等^[6-7]应用DNA全基因序列分析发现结石周围肾间质中的巨噬细胞相关基因表达明显增强，另外，还发现炎症相关基因(CXCL1，CD44，主要组织相容性复合体Ⅱ类)也有上调，而体外细胞培养表明巨噬细胞能黏附、吞噬及消化结石晶体并释放肿瘤坏死因子α、白细胞介素6等炎症因子^[8]。

白细胞介素1β，白细胞介素6，肿瘤坏死因子α被称为经典的早期炎症因子，受致病因素刺激早期合成及释放；单核细胞趋化因子1则被称为二级炎症因子，主要作用为募集单核巨噬细胞至炎症部位。它们均可由活化的单核巨噬细胞产生，释放至胞外后发挥多种生理功能，如参与机体免疫反应，机体防御，活化炎症细胞等，其中，介导炎症反应是其共同特性。炎症因子不仅具有自分泌激活剂的作用，促进自身的分泌，而且具有相互诱生，彼此协同作用，从而使炎症因子在数及量上不断增加，炎症细胞不断活化并聚集，最终导致炎症反应^[9-15]。

高迁移率族蛋白B1是高迁移率族蛋白家族中的一员，高迁移率族蛋白是一族含量丰富、进化上高度保守的非组DNA结合蛋白，因其在聚丙烯酰胺凝胶电泳中快速迁移率而得名^[16]，其分布广泛，机体大部分器官组织均有表达，位于细胞的胞浆胞核。对高迁移率族蛋白B1最初的认识局限于核内功能，其主要参与基因转录调控、DNA修复、DNA重组、类固醇激素调节及细胞的复制、分化、成熟等重大生命活动^[17-21]。直到Wang等^[22]研究发现，该蛋白可以释放至细胞外，发挥炎症递质及促炎细胞因子的作用，其胞外功能才引起广泛重视。随后的大量研究表明高迁移率族蛋白B1是致炎因子网络的中心环节，由激活的单核巨噬细胞、受损坏死的细胞主动或者被动释放，释放后激活炎症通路，诱导肿瘤坏死因子α、白细胞介素6、白细胞介素1β等早期致炎因子分泌，同时可作为趋化因子促进巨噬细胞迁移，而早期致炎因子及高迁移率族蛋白B1本身又能反过来促进高迁移率族蛋白B1的释放，从而形成一个复杂的正反馈环路，启动、维持及放大炎症反应，损伤器官和组织，参与多种疾病的发生发展^[23-27]。

本课题组前期实验发现结石晶体可刺激巨噬细胞释放高迁移率族蛋白B1。近年有研究报道，高迁移率族蛋白B1能协同脂多糖诱导巨噬细胞释放致炎因子^[28]。本实验拟将重组高迁移率族蛋白B1与CaP晶体共同刺激巨噬细胞，观察及探讨高迁移率族蛋白B1与CaP是否具有诱导巨噬细胞释放早期炎症因子的协同作用，旨在为肾结石的形成机制提供新思路。

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材料方法

设计：体外细胞实验。

时间及地点：于2013年7月至2014年2月在广西医科大学第一附属医院临床实验中心实验室完成。

实验方法：

细胞培养及诱导：体积分数10%胎牛血清RPMI1640培养液、37 ℃、体积分数5%CO₂的条件下培养U937细胞，

当细胞生长至密度约80%进行细胞诱导。用吸管直接吸取培养瓶中培养液及U937细胞，移入15 mL灭菌离心管中， 800 r/min离心5 min，弃上清，加入RPMI1640培养基及适量诱导剂PMA(使PMA终浓度100 μg/L)，混匀后分装至新的细胞培养瓶中(约4 mL)，放入37 ℃、体积分数5%CO₂的培养箱中诱导12 h, 吸去培养瓶中的液体及未贴壁细胞，PBS洗涤2遍，留存于培养瓶中的贴壁细胞即为诱导成功的巨噬细胞，加入新鲜细胞培养液使其恢复48 h，用于后续实验。

细胞分组及处理：将U937成功诱导为巨噬细胞后分组进行干预，分两部分实验。

倒置显微镜观察细胞情况：单核巨噬细胞U937诱导前后细胞形态学观察及加入CaP后细胞黏附吞噬晶体情况观察。

ELISA法检测细胞上清液白细胞介素1β、白细胞介素6、肿瘤坏死因子α、单核细胞趋化因子1水平：按照试剂盒说明书，采用双抗体夹心法检测上述各组细胞培养液白细胞介素1β、白细胞介素6、肿瘤坏死因子α、单核细胞趋化因子1质量浓度。

主要观察指标： ①U937细胞诱导前后细胞形态学及加入CaP后巨噬细胞黏附吞噬晶体的观察。②CaP、高迁移率族蛋白B1以及CaP+高迁移率族蛋白B1刺激前后各组巨噬细胞释放炎症因子的变化水平。

统计学分析：实验数据用x(_)±s表示，数据分析采用SPSS 16.0软件处理，组间比较采用单因素方差分析，以 P < 0.05为差异有显著性意义。

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讨论

迄今为止，肾结石形成机制仍未完全清楚。近年来，关于草酸钙肾结石的起源学说(Randall斑学说)成为人们研究的热点。研究发现，几乎所有草酸钙结石患者肾内均存在Randall斑，结晶的起始部位是髓袢细支的上皮基底膜，由羟磷灰石微粒构成，结晶体向直小管和终未集合小管周围的间质组织中逐渐延伸至肾乳头皮下，不断积聚生长，肾乳头上皮逐渐破溃，斑块暴露于终尿，诱导异质成核最终形成草酸钙结石^{[2, 3, 29-30]}。这充分说明，草酸钙肾结石起源于Randall斑，也提示Randall斑的形成与其主要构成成分磷酸钙晶体(羟磷灰石)密切相关。由于肾脏特殊的解剖结构及尿液理化因素的影响，磷酸钙晶体容易析出并沉积于肾小管腔内^[30-33]，作为异物，将会引起一系列晶体-细胞反应。从动物实验模型到体外细胞培养以及结石患者肾脏等大量研究表明，巨噬细胞及其炎症反应参与了肾结石的形成^[4-8]。巨噬细胞是机体炎症反应的一个重要参与者，具有多种生理功能包括吞噬、趋化、抗原提呈、抗病原微生物、免疫调节等^[34-36]，被激活的巨噬细胞能释放致炎因子白细胞介素1β、白细胞介素6、肿瘤坏死因子α、单核细胞趋化因子1等，从而产生炎症损伤。白细胞介素1β、白细胞介素6、肿瘤坏死因子α被称之为早期致炎因子，巨噬细胞受刺激后数小时即被释放至胞外发挥致炎效应，但较快恢复正常水平，单核细胞趋化因子1被称之为趋化因子，可招募及活化单核巨噬细胞至炎症部位参与炎症。高迁移率族蛋白B1较肿瘤坏死因子α、白细胞介素1β等早期炎症因子分泌延迟、持续时间久被称之为晚期炎症因子，是致炎因子网络的中心环节。由激活的单核巨噬细胞、受损坏死的细胞主动或者被动释放，释放后激活炎症通路，诱导肿瘤坏死因子α、白细胞介素6、白细胞介素1β等早期致炎因子分泌，同时可作为炎症细胞趋化因子促进巨噬细胞迁移，而早期致炎因子及高迁移率族蛋白B1本身又能反过来促进高迁移率族蛋白B1的释放，从而形成一个复杂的正反馈炎症环路，启动、维持及放大炎症反应，损伤器官和组织，参与多种疾病的发生发展^[23-27]。 Andersson等^[37]研究发现，高迁移率族蛋白B1可显著刺激单核/巨噬细胞释放肿瘤坏死因子α，白细胞介素1，白细胞介素6，白细胞介素8及巨噬细胞炎性蛋白1，且呈剂量依赖性，重组高迁移率族蛋白B1与人单核巨噬细胞或者小鼠巨噬细胞共同培养，可促进肿瘤坏死因子α释放及其基因表达增强，4-6 h及8-10 h各有一高峰，呈双峰征。Park等^[38]将重组高迁移率族蛋白B1刺激中性粒细胞发现，高迁移率族蛋白B1通过提高核因子KB的转录，促使炎性细胞因子表达及释放。由高迁移率族蛋白B1刺激分泌的早期炎症递质白细胞介素1β、肿瘤坏死因子α等可单独或者协同刺激单核/巨噬细胞进一步分泌高迁移率族蛋白B1。Wang 等^[22]研究发现，肿瘤坏死因子能诱导巨噬细胞释放高迁移率族蛋白B1。Beatriz亦证实由巨噬细胞、NK细胞等免疫细胞释放的TNF能反作用于巨噬细胞，产生高迁移率族蛋白B1，且呈肿瘤坏死因子依赖性^[39]。本课题组前期实验发现结石晶体CaP可刺激巨噬细胞释放高迁移率族蛋白B1。最近，秦阳华等^[28]研究报道，高迁移率族蛋白B1可协同脂多糖激活巨噬细胞释放大量白细胞介素1β、白细胞介素6、肿瘤坏死因子α等致炎因子，提示高迁移率族蛋白B1亦有协同CaP诱导巨噬细胞释放致炎因子的可能性。

本实验采用CaP，高迁移率族蛋白B1及CaP+高迁移率族蛋白B1协同干预巨噬细胞1，2，4 h，结果显示CaP组、高迁移率族蛋白B1组上清液白细胞介素1β、白细胞介素6、肿瘤坏死因子α、单核细胞趋化因子1水平均高于空白组，CaP+高迁移率族蛋白B1干预组上清液白细胞介素1β、白细胞介素6、肿瘤坏死因子α、单核细胞趋化因子1水平均高于空白组、CaP组及高迁移率族蛋白B1组，且呈时间依赖性，差异有显著性意义(P < 0.05)。同时，采用CaP及CaP+不同浓度高迁移率族蛋白B1协同干预巨噬细胞4 h，结果提示CaP+不同浓度高迁移率族蛋白B1干预组上清液白细胞介素1β、白细胞介素6、肿瘤坏死因子α、单核细胞趋化因子1水平均高于CaP组，且呈浓度依赖性，差异有显著性意义(P < 0.05)。以上结果说明，CaP、高迁移率族蛋白B1均可诱导巨噬细胞释放炎症因子；高迁移率族蛋白B1对CaP诱导巨噬细胞释放白细胞介素1β、白细胞介素6、肿瘤坏死因子α、单核细胞趋化因子1等致炎因子具有协同作用，呈时间-浓度依赖性。

综上所述，作者推测，髓袢环管腔中磷酸钙晶体析出后，能趋化巨噬细胞，黏附、吞噬、转运磷酸钙晶体至肾乳头部，发生细胞-晶体反应，释放晚期炎症因子高迁移率族蛋白B1及早期炎症因子白细胞介素1β、白细胞介素6、肿瘤坏死因子α、单核细胞趋化因子1等，释放的高迁移率族蛋白B1协同磷酸钙晶体进一步促进早期炎症因子的释放，启动、维持及放大炎症反应，引起肾组织的炎症损伤，逐渐延伸至肾乳头上皮下引起其破溃，形成所谓的Randall斑，介导异质成核，最终导致草酸钙肾结石的形成。因此，抑制高迁移率族蛋白B1的释放，阻断促炎细胞因子反应网络，抑制炎症发生发展，有可能成为肾结石防治的新靶点。

结论：CaP、高迁移率族蛋白B1均可诱导人巨噬细胞释放白细胞介素1β、白细胞介素6、肿瘤坏死因子α、单核细胞趋化因子1；高迁移率族蛋白B1可协同CaP诱导人巨噬细胞释放白细胞介素1β、白细胞介素6、肿瘤坏死因子α、单核细胞趋化因子1，呈时间及浓度依赖性。

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