瞬时感受电位M8在人类膝关节软骨组织中的表达

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2014.20.001

中国组织工程研究 ›› 2014, Vol. 18 ›› Issue (20): 3117-3121.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.2014.20.001

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瞬时感受电位M8在人类膝关节软骨组织中的表达

喻斌，聂博渊，杨朝晖

山西医科大学第二医院骨科，骨与软组织损伤修复山西省重点实验室，山西省太原市 030001

收稿日期:2014-04-02 出版日期:2014-05-14 发布日期:2014-05-14
通讯作者: 杨朝晖，博士，副主任医师，山西医科大学第二医院骨科，骨与软组织损伤修复山西省重点实验室，山西省太原市 030001
作者简介:喻斌，男，1987年生，河南省信阳市人，汉族，山西医科大学在读硕士，主要从事软骨损伤与修复方面研究。
基金资助:
山西省留学人员科研资助项目(2013-114)

Expression of transient receptor potential M8 in human knee joint cartilage

Yu Bin, Nie Bo-yuan, Yang Zhao-hui

Department of Orthopedics, Shanxi Provincial Key Laboratory of Bone and Soft Tissue Injury and Repair, Second Hospital of Shanxi Medical University, Taiyuan 030001, Shanxi Province, China

Received:2014-04-02 Online:2014-05-14 Published:2014-05-14
Contact: Yang Zhao-hui, M.D., Associate chief physician, Department of Orthopedics, Shanxi Provincial Key Laboratory of Bone and Soft Tissue Injury and Repair, Second Hospital of Shanxi Medical University, Taiyuan 030001, Shanxi Province, China
About author:Yu Bin, Studying for master’s degree, Department of Orthopedics, Shanxi Provincial Key Laboratory of Bone and Soft Tissue Injury and Repair, Second Hospital of Shanxi Medical University, Taiyuan 030001, Shanxi Province, China
Supported by:
Scientific Research Foundation for the Returned Overseas Chinese Scholars of Shanxi Province, No. 2013-114

摘要/Abstract

摘要：

背景：瞬时感受电位通道在人体遍布多种组织和细胞，并参与人体几乎所有的生理功能和许多的病理变化。但是到目前为止，瞬时感受电位M8在人类软骨组织中的表达未见报道。
目的：观察瞬时感受电位基因亚家族成员瞬时感受电位M8在人类软骨组织中的表达。
方法：15例膝关节软骨样本来源于严重创伤截肢的患者。每个样本取300 mg软骨组织用于组织总蛋白的提取，再取相同部位的软骨组织做切片。Western blot方法检测瞬时感受电位M8在人类软骨组织中的表达，免疫荧光法检测瞬时感受电位M8在人类软骨组织中的分布。
结果与结论：Western blot结果显示在相对分子质量为130 000时出现特异性的瞬时感受电位M8条带，并应用Westen印迹技术分析了温度敏感性瞬时感受电位M8通道的年龄相关性，发现随着年龄的增加，其表达量呈下降趋势。免疫荧光染色结果显示瞬时感受电位M8蛋白均匀的分布在细胞膜上。提示瞬时感受电位M8在人类软骨组织中有表达，具体表达在软骨细胞膜上。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

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关键词: 组织构建, 软骨组织工程, 瞬时感受电位, 软骨组织, 膝关节, Western blot, 免疫荧光染色

Abstract:

BACKGROUND: Transient receptor potential protein channel is distributed in many kinds of tissue and cells in human body, and takes part in many physiologic functions and pathological changes of human body. However, up to now, transient receptor potential melastatin 8 (TRPM8) has not been reported in human cartilage.
OBJECTIVE: To study the expression of TRPM8, a subfamily member of transient receptor potential gene, in human knee joint cartilage.
METHODS: Fifteen samples were selected from patients after amputatioin due to severe trauma. Total protein was extracted from 300 mg cartilage tissue of every patient. To detect the distribution of TRPM8 in human cartilage, cartilage sections were collected in the same region. The expression and distribution of TRPM8 in human cartilage was detected by western blot analysis and immunofluorescence respectively.
RESULTS AND CONCLUSION: Western blot analysis showed that specific TRPM8 band was visible at molecular weight of 130 000, and as the age increased, TRPM8 expression in human cartilage was gradually decreased. Immunofluorescence staining results showed that TRPM8 was evenly located in the cell membrane of chondrocytes. TRPM8 is expressed in the human knee cartilage, specifically in member of chondrocytes.

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

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Key words: transient receptor potential channels, cartilage, knee joint, blotting, western, immunofluorescence

中图分类号:

R318

喻斌，聂博渊，杨朝晖. 瞬时感受电位M8在人类膝关节软骨组织中的表达[J]. 中国组织工程研究, 2014, 18(20): 3117-3121.

Yu Bin, Nie Bo-yuan, Yang Zhao-hui. Expression of transient receptor potential M8 in human knee joint cartilage[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2014, 18(20): 3117-3121.

图/表（结果） 2

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引言

瞬时受体电位通道是位于细胞膜上的一类具有Ca²⁺通透性，非电压依赖性、非选择性阳离子通道。瞬时感受电位通道在人体多种组织和细胞中均有分布，并且直接或者间接参与该组织细胞的生理和病理功能^[1]。

瞬时感受电位M8通道是瞬时感受电位超家族的成员之一，最新研究发现，瞬时感受电位M8不仅能感知冷知觉，而且被冷物质等刺激后还可参与炎症和神经性疼痛的痛觉调控。目前在三叉神经节和背根神经节的小型神经元以及前列腺、胃底、血管平滑肌、肝脏、膀胱上皮和男性生殖系统中都有不同程度的瞬时感受电位M8表达^[2]。瞬时感受电位M8存在的广泛性决定了其病理生理学功能的多样性。研究发现，不同温度、细胞因子、以及机械应力等环境下瞬时感受电位M8通道能够被激活，虽然其主要存在于神经组织中，但学者们仍认为瞬时感受电位M8通道在非神经组织上广泛的表达和活化可能进一步直接或促进细胞对细胞外环境的物理化学变化的反应^[3]。研究发现瞬时感受电位M8在肺上皮细胞及膀胱上皮细胞中表达，并且具有诱导炎性因子分泌的功能^[4-6]；同时学者们在前列腺癌细胞中发现了瞬时感受电位M8，检测到瞬时感受电位M8基因高度表达于早期高分化的前列腺癌细胞中，具有调节细胞生长增殖的作用^[7]。

瞬时受体电位通道家族作为一种细胞感受器^[8]，近来受到了广泛的关注，这类非选择性阳离子通道蛋白响应细胞及机体周围环境中温度、机械应力、渗透压、外激素等的变化，在体内参与多种组织器官对伤害性刺激的调节，故又将之称为“环境感觉离子通道”。到目前为止，哺乳动物体内超过50种瞬时感受电位通道已经被克隆^[9]。根据同源性的不同，瞬时感受电位离子通道超家族可分为7个亚族，即瞬时感受电位A家族、瞬时感受电位C家族、瞬时感受电位V家族、瞬时感受电位M家族、瞬时感受电位P家族、瞬时感受电位N家族和瞬时感受电位ML家族^[10]。虽然人们关注的重点一直是神经元中瞬时感受电位通道的表达和功能。但是相关文献表明，瞬时感受电位通道在非神经细胞中的表达亦是非常重要，它们是细胞与外界环境交流的桥梁，在温度、机械应力、酸物质、炎性因子、渗透压等异常环境下，参与疾病的发生^[11]。

众所周知，软骨组织中无血管及神经组织，软骨细胞作为软骨组织中最重要的细胞结构，通过感知周围微环境(年龄、机械应力、细胞因子等)的变化来维持软骨组织的结构和功能。但是被称为“细胞感受器”的瞬时感受电位M8离子在软骨组织中是否具有相应的功能，目前研究尚未开展起来，基于此，作者通过人体标本对瞬时感受电位通道与软骨组织的关系进行分析。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

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材料方法

1 对象和方法 Subjects and methods

设计：单一样本观察实验。

时间及地点：于2013年3至9月在山西医科大学第二医院骨与软组织损伤修复山西省重点实验室完成。

对象：15例膝关节软骨标本均来源于山西医科大学第二医院骨科临床截肢患者，男12例，女3例；年龄23-60岁，平均42岁。所有患者均签署知情同意书，实验方案已获得山西医科大学伦理委员会批准。

纳入标准：所有患者术前均详细询问病史，确定为发病前无关节活动障碍，膝关节活动无疼痛，无活动受限、活动时有弹响声；无关节酸胀乏力。

排除标准：拍双膝关节X射线片及常规化验，排除膝关节肿瘤、结核、化脓性炎症、风湿和类风湿关节炎及骨关节炎、系统性胶原病；排除前3个月接受非类固醇类抗炎治疗者。

瞬时感受电位M8在人类膝关节软骨组织中表达实验的主要试剂及仪器：
试剂及仪器	来源
瞬时感受电位M8-抗(兔抗人)、二抗(山羊抗兔)	美国Abcam公司
全蛋白提取试剂盒、BCA蛋白定量试剂盒	上海碧云天生物技术有限公司
冰冻切片机	德国Leica公司
绿色荧光标记的山羊抗兔二抗	武汉博士德公司
超低温离心机	美国Eppendorf公司
倒置荧光显微镜	日本奥林巴斯株式会社
垂直电泳槽、凝胶成像系统、硝酸纤维素膜、Western上样Marker	美国Bio-Rad公司
蛋白浓度测定仪	美国Thermo公司

方法：

标本收集及分组：截肢结束后，立即将残肢带回实验室，在冰浴的条件下取下膝关节，用手术刀片在同一部位取下等量全厚的软骨组织，投入液氮并转入-80 ℃超低温冰箱中保存。所有的人体软骨组织样本均进行Western blot分析，所得条带均进行灰度值分析，将灰度值没有统计学差异的归为一组，通过该方法将所收集的样本分为3个组，即20-39岁组(男4例，女1例，平均年龄30岁)，40-49岁组(男4例，女1例，平均年龄42岁)和50-60岁组(男5例，女0例，平均年龄54岁)。

总蛋白的提取：取300 mg软骨组织，全蛋白裂解液提取组织总蛋白，14 000 r/min，4 ℃离心15 min，留取上清为全蛋白提取物。BCA法测定蛋白浓度，配置工作液(A∶B=50∶1)，取待测样品2 µL，加入工作液38 µL，37 ℃水浴30 min，利用Nano Drop检测仪检测样品浓度。

Western blot：每泳道加入30 µL蛋白并在十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳槽中进行电泳，电泳完毕后转移至醋酸纤维薄膜；室温下脱脂奶粉封闭2 h后加入Anti-TRPM8(1∶2 000稀释)，4 ℃过夜，TBST洗膜3次；室温下二抗(1∶2 000)孵育1 h，TBST洗膜3次；去等体积的超敏发光液中溶液A和B混合(各0.5 mL混合)，装于1 mL灭菌的EP管中，将膜完全浸入发光工作液约2 min。用镊子夹起膜置于曝光仪中，设置曝光参数，曝光后拍摄条带。

免疫荧光染色：连续6 μm冰冻切片，冰丙酮4 ℃固定10 min；5%脱脂奶粉(BSA)封闭30 min，甩干后直接加入一抗Anti-TRPM8(1∶500稀释)，阴性对照组用PBS代替，37 ℃湿盒内孵育60 min；然后用PBS洗3次，5 min/次，依二抗说明书稀释绿色荧光二抗(1∶2 000)，避光，室温下2 h，PBS洗2遍后转移到载玻片上避光晾干；滴加防淬灭剂在荧光显微镜下观察并拍照。

主要观察指标：①Western blot结果。②免疫荧光染色结果。

统计学分析：由第一作者采用SPSS 13.0软件进行统计处理，计量资料以x(_)±s表示，多组间比较采用单因素方差分析，P < 0.05为差异有显著性意义。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

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讨论

目前软骨组织的瞬时感受电位通道研究较少，Gavenis等^[12]将全髋关节置换后患者肉眼可见未受损区域软骨分离培养后，用2代软骨细胞行半定量PCR检测，在软骨细胞上发现了瞬时感受电位家族中的12个成员瞬时感受电位C1、瞬时感受电位C3、瞬时感受电位C4、瞬时感受电位C5、瞬时感受电位C6、瞬时感受电位M1、瞬时感受电位M2、瞬时感受电位M5、瞬时感受电位M7、瞬时感受电位V1、瞬时感受电位V2和瞬时感受电位V6并认为这些瞬时感受电位通道与关节炎中软骨细胞的去分化密切相关。Phan等^[13]研究了瞬时感受电位V4在猪软骨细胞的分布和功能。他们通过免疫印迹等试验证实瞬时感受电位V4大量存在于猪软骨组织中，认为瞬时感受电位V4的缺乏及功能低下导致的Ca²⁺信号减少会引起骨关节炎的发生。Clark等^[14]发现瞬时感受电位V4的缺失引起软骨纤维化、骨质致密及蛋白聚糖减少，软骨下骨和钙化的半月板的体积明显增大，具有明显的性别及年龄相关性，并且认为瞬时感受电位V4介导的Ca²⁺信号对关节功能和结构起关键作用。Muramatsu等^[15]利用功能基因筛选系统来证实瞬时感受电位V4是软骨形成、分化的调节基因。Kochukov等^[16]发现在人关节的滑膜细胞上存在温度敏感性瞬时感受电位通道瞬时感受电位V1、瞬时感受电位V4、瞬时感受电位A1以及瞬时感受电位M8，分别给予相应的温度刺激后，滑膜细胞内可见大量钙离子内流，推测瞬时感受电位通道蛋白在骨关节炎的滑膜细胞功能性表达可能在骨关节炎时滑膜对炎性反应的适应性改变和病理改变中有着重要的作用。综上所述，瞬时感受电位通道可能与骨关节炎的发生密切相关。但是，瞬时感受电位家族的其他成员是否在软骨细胞中有表达，以及在软骨细胞中表达量的变化尚未见报道。

本实验发现瞬时感受电位M8在人类软骨组织中有表达，主要表达在软骨细胞膜上。通过生物信息学分析，人的瞬时感受电位M8基因定位于第2号染色体(2q37.1)，含24个外显子，全长102.12 kb，成熟mRNA编码含1 104个氨基酸残基的蛋白质，相对分子质量约为130 000，并且被证明是Ca²⁺通道^[17-18]。通过免疫荧光，作者发现瞬时感受电位M8主要表达与软骨细胞膜上，推测可能与Ca²⁺释放相关。另外，表达在细胞膜上的瞬时感受电位M8通道可能对细胞起着保护的作用，因为用前列腺特异性抗体激动瞬时感受电位M8后，发现前列腺癌PC3细胞的增殖活性降低^[19]。Ca²⁺对细胞的生长、发育、代谢等有很大的影响。学者们试图阐明钙离子在软骨细胞生物学和骨关节炎的作用机制。研究显示，Ca²⁺对软骨细胞代谢具有重要的影响^[20]。Koyano等^[21]发现增加细胞外Ca²⁺浓度可以促进软骨细胞向肥大性细胞分化；而减少Ca²⁺浓度，可以提高胶原蛋白和蛋白聚糖的生物合成和延迟肥大。Guilak等^[22]分别给予软骨细胞不同的应力刺激后发现软骨细胞内Ca²⁺的增加。有研究发现钙离子参与软骨细胞代谢活动，例如介导诱导型一氧化氮合酶和基质金属蛋白酶的生成和降解,并且软骨细胞内胞内钙离子也可能会涉及其的分化调节的过程^[23]。可是作为Ca²⁺通道的瞬时感受电位M8蛋白是否也参与上述过程目前尚不清楚。另外，Tsumura等^[24]在小鼠的成牙本质细胞上发现了瞬时感受电位M8和瞬时感受电位A1，认为它们在牙本质细胞感受机械和温度的过程中有重要作用；Park等^[6]通过研究认为瞬时感受电位M8在前列腺素E2的活化、炎症因子的释放过程中具有重要的作用，他将正常人角质形成细胞进行预冷处理以激活瞬时感受电位M8通道之后进行紫外线照射发现，相对于抑制激活，前列腺素E2的表达下降，结果表明，瞬时感受电位M8的激活可减少皮肤的炎症反应；Sabnis等^[4]在肺支气管上皮细胞上发现了瞬时感受电位M8通道，给予激动后发现白细胞介素1α、白细胞介素1β、白细胞介素6等炎性因子分泌水平相应增高，推测其参与冷刺激引起的气管疾病的发生；另外在人的骨细胞中发现了瞬时感受电位M8通道，认为其参与骨细胞的增殖和分化^[25]。那么瞬时感受电位M8是否参与关节软骨的生理以及病理性活动，目前不清楚，这也将成为后续研究的主要任务。同时作者查阅相关文献，发现瞬时感受电位M8通道与雌激素同样密切相关，研究显示强效的瞬时感受电位M8激动剂Icilin可以诱导强烈的外向整流电流，认为细胞内钙离子浓度升高与瞬时感受电位M8通道的离子特性密切相关；给予乳腺癌细胞雌激素受体剥夺后发现激动瞬时感受电位M8通道亦不能增加细胞内钙离子浓度，学者们认为瞬时感受电位M8在人乳腺癌细胞中过表达与肿瘤细胞的雌激素受体具有相关性^[26]。Pfeilschifter等^[27]研究了雌激素相关受体在不同年龄、性别的大鼠软骨细胞的表达差异性，发现关节软骨细胞也是雌激素的靶器官之一。很多研究证实雌激素对软骨细胞具有保护作用，并且可以抑制炎症因子的释放，还有影响到细胞内钙离子水平^[28]，可是作为Ca²⁺通道的瞬时感受电位M8蛋白是否也参与到雌激素对软骨细胞的保护这一过程中目前尚不清楚，这将是后续研究的重点之一。

目前已经普遍认为骨关节炎是一种与年龄密切相关的多因素疾病，涉及软骨营养、代谢异常、生物力学方面的应力平衡失调等诸多因素，Evans等^[29]研究发现体外培养的关节软骨细胞增殖能力随年龄增长而下降，表现为软骨细胞异型性增多，细胞核形态不规则，细胞器减少，细胞周期延长(从17.5 h增加到27.0 h)。软骨细胞凋亡异常是骨关节炎的重要原因之一，是骨关节炎发病机制中的重要环节之一。直到现在，国际上对软骨细胞离子通道的年龄相关性研究尚属空白。瞬时感受电位M8最早发现与前列腺癌细胞中，并被认为是前列腺癌的诊断标志物之一，学者检测到瞬时感受电位M8基因高度表达于早期高分化的前列腺癌细胞中，具有调节细胞生长增殖的作用^[7]，鉴于以上情况，作者发现瞬时感受电位M8在调控细胞的增殖以及细胞凋亡方面具有重要的作用，于是应用Westen印迹技术研究了温度敏感性瞬时感受电位M8通道的年龄相关性，发现随着年龄的增加，其表达量呈下降趋势。软骨离子通道的年龄相关性研究，对揭示正常软骨生长和衰老的自然规律，阐释与年龄因素密切相关的常见疾病-骨关节炎的发病机制具有重要的意义。

综上所述，瞬时感受电位M8在人类软骨细胞膜上表达，这为探讨瞬时感受电位基因家族在软骨细胞上的表达做了补充，同时也为软骨细胞上瞬时感受电位M8功能的研究奠定了基础。本文结果发现，随着年龄的增长，瞬时感受电位M8的表达呈下降趋势，但仍不能说明瞬时感受电位M8在软骨组织生理和病理机制中所扮演的角色。下一步的研究将着眼于瞬时感受电位M8在软骨细胞生理和病理过程中所发挥的作用，以便为关节软骨损伤的预防保护与治疗提供新的治疗靶点。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

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