构建人端粒酶反转录酶基因腺相关病毒2载体在人髓核细胞的表达

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2014.15.019

摘要/Abstract

摘要：

背景：动物研究显示，自体髓核细胞移植能有效修复椎间盘退变。然而髓核细胞体外增殖能力差，这就限制了其作为种子细胞在椎间盘退变性疾病治疗中的研究及应用。
目的：构建包含外源性人端粒酶反转录酶基因的腺相关病毒2载体，观察其转染人髓核细胞后人端粒酶反转录酶基因的表达。
方法：构建pSNAV2.0-pRSV-hTERT质粒并鉴定，采用AAVMaxTM包装系统进行重组腺相关病毒2-人端粒酶反转录酶载体的构建，以PCR及酶切方法验证构建的质粒，构建成功后扩增，并纯化。利用腺相关病毒2-增强型绿色荧光蛋白载体转染第1代人髓核细胞，测定最佳感染复数。参照此感染复数值，确定腺相关病毒2-人端粒酶反转录酶对人髓核细胞转染的相关感染复数；对照组采用不含外源性人端粒酶反转录酶基因的腺相关病毒2进行转染。转染后1，2，4周分别采用RT-PCR对人端粒酶反转录酶基因mRNA水平进行半定量检测。
结果与结论：实验成功构建了腺相关病毒2-人端粒酶反转录酶载体；并获得了滴度达2×10¹¹ v•g/mL的腺相关病毒2-人端粒酶反转录酶载体。测得腺相关病毒2-人端粒酶反转录酶载体对人髓核细胞的最佳感染复数为5×10⁴v•g/cell。在以1×10⁴，5×10⁴，1×10⁵v•g/cell转染人髓核后，均可检测到人端粒酶反转录酶基因mRNA的高量表达。采用RT-PCR半定量检测方法，发现以转染后2周时人端粒酶反转录酶 mRNA表达量相对最高(P < 0.05)，4周时仍可见人端粒酶反转录酶基因mRNA的稳定表达。而对照组无论在何时间点均未能检测到人端粒酶反转录酶mRNA的表达。提示利用腺相关病毒2可以成功构建包含外源性人端粒酶反转录酶基因的病毒载体，腺相关病毒2-人端粒酶反转录酶能有效转染人髓核细胞并稳定表达人端粒酶反转录酶基因mRNA，此结果可能为增强髓核细胞性能提供新的策略。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

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关键词: 组织构建, 骨组织工程, 人髓核细胞, 基因转染, 重组腺相关病毒2, 人端粒酶反转录酶

Abstract:

BACKGROUND: In animal experiments, transplantation of autologous nucleus pulposus cellscan effectively repair the intervertebral disk degeneration. However, nucleus pulposus cells have a poor ability of proliferation in vitro, which limits its application as seed cells in treatment of intervertebral disk disease.
OBJECTIVE: To construct recombinant adeno-associated virus type-2 vector carrying human telomerase reverse transcriptase and observe the human telomerase reverse transcriptase mRNA expression in human nucleus pulposus cells in vitro.
METHODS: After the plasmid pSNAV2.0-pRSV-hTERT was constructed and identified, recombinant adeno-associated virus type-2 vector carrying human telomerase reverse transcriptase were constructed, amplified and purified by AAVMaxTM package and purification system. The optimal multiplicity of infection for human nucleus pulposus cells was detected by recombinant adeno-associated virus type-2 vector carrying enhanced green fluorescent protein. According the optimal multiplicity of infection (5 × 10⁴ v•g/cell), three different multiplicity of infection (1×104, 5×104, 1×105 v•g/cell) of recombinant adeno-associated virus type-2 vector carrying human telomerase reverse transcriptase were determined to transfect the first passage human nucleus pulposus cells in vitro. In control group, the cells were transfected with adeno-associated virus type-2 vector without human telomerase reverse transcriptase. At 1, 2, 4 weeks after transfection, mRNA expression of human telomerase reverse transcriptase in human nucleus pulposus cells were semi-quantitatively detected by RT-PCR.
RESULTS AND CONCLUSION: The recombinant adeno-associated virus type-2 vector carrying human telomerase reverse transcriptase was successfully constructed, and the titer of the obtained vector was more than 2×10¹¹ v•g/mL. The optimal multiplicity of infection was 5×10⁴ v•g/cell. The mRNA expression of human telomerase reverse transcriptase in human nucleus pulposus cells could be detected in different multiplicity of infection (1×10⁴, 5×10⁴, 1×10⁵ v•g/cell). At 2 weeks post-transfection, mRNA expression of human nucleus pulposus cells was the highest (P < 0.05), as detected by semi-quantitative RT-PCR. Moreover, the stable and high mRNA expression of human telomerase reverse transcriptase could be detected at 4 weeks post-transfection. In control group, no human telomerase reverse transcriptase mRNA expression was found. The recombinant adeno-associated virus type-2 vector carrying human telomerase reverse transcriptase can be successfully constructed, and can mediate a stable mRNA expression of human telomerase reverse transcriptase in human nucleus pulposus cells. Our findings provide a novel strategy of enhancing the properties of nucleus pulposus cells.

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Key words: gene, transfection, tolemere, polymerase chain reaction

中图分类号:

R318

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Sun Jie, Pan Zhi-qiang, Zhu Yue-liang, Zhou Tian-hua. Construction and expression of adeno-associated virus type-2 vector carrying human telomerase reverse transcriptase in human nucleus pulposus cells[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2014, 18(15): 2409-2414.

图/表（结果） 5

2.1 pSNAV2.0-pRSV-hTERT质粒构建及鉴定 ①对构建好的质粒pSNAV2.0-PRSV-hTERT先进行PCR鉴定，PCR产物条带为1 013 bp，与结果预期相符(图1)；鉴定正确的质粒经KpnⅠ+SalⅠ双切获得了6.6 kb+3.4 kb的片段，从电泳结果看，实验结果与预期相符，证明质粒pSNAV2.0-PRSV-hTERT构建成功(图2)。②将经PCR和酶切鉴定正确的质粒进一步测序鉴定。测序结果与Genebank结果一致，人端粒酶反转录酶基因插入方向正确。

2.2 腺相关病毒2-人端粒酶反转录酶的构建、扩增及纯化 利用AAVMax^TM包装系统，成功包装了腺相关病毒2-人端粒酶反转录酶载体，并纯化至滴度为2×10¹¹ v·g/mL。

2.3 转染复数MOI的测定 当以MOI为1×10⁴，5×10⁴，1×10⁵和2×10⁵ v·g/cell转染后，第3天荧光显微镜下均可见到大部分细胞发出明亮的绿色荧光(图3)，对比明场发现部分细胞未表达荧光，第7天时观察到绿色荧光亮度增强，转染率结果见表1。

由结果可知MOI为1×10⁴，5×10⁴ v·g/cell时，转染率在第7天时略有增高(P > 0.05)；而以1×10⁵，2×10⁵ v·g/cell时初始转染率较高，但在第7天时反而降低(P < 0.05)。由此确定对人髓核细胞最佳MOI为5×10⁴ v·g/cell。

2.4 腺相关病毒2-人端粒酶反转录酶体外转染人髓核细胞及基因表达 RT-PCR方法检测可见以腺相关病毒2-人端粒酶反转录酶转染的人髓核细胞，在1，2和4周均能够正确扩增出523 bp的目的条带和243 bp的内参条带，而未转染组1周时未见523 bp的阳性条带，只显示大小为243 bp的GAPDH的内参，PCR结果见图4；对不同时间点的转染组细胞进行目的条带与内参条带灰度值的比较显示，2周时人端粒酶反转录酶基因mRNA相对表达量最高(P < 0.05)。

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引言

椎间盘退变性疾病是临床多发疾病，自青壮年至老年均可发病，发病率较高，是引起劳动力致残的原因之一。椎间盘退变性疾病的治疗有保守治疗及手术治疗，但目前治疗均不能从根本上去除病患。多种因素均可导致椎间盘退变性疾病的发生，如创伤、遗传等。椎间盘内的髓核组织在维持椎间盘生理功能中发挥重要作用，髓核组织中主要由髓核细胞及髓核细胞分泌的细胞间质蛋白组成。因此，髓核细胞在椎间盘退变性疾病的发生发展中扮演着重要角色。椎间盘生物学功能及椎间盘高度与髓核细胞之间存在着相关性。椎间盘内细胞随着年龄的增长，生物学功能逐渐减低。
老年人群中椎间盘退变性疾病发病率非常高，这可能和老年患者椎间盘中髓核细胞功能下降有关。目前已有研究者探索椎间盘退变性疾病的细胞治疗。动物研究显示，自体髓核细胞移植能有效修复椎间盘退变^[1-2] 。体外研究显示，髓核细胞在蛋白多糖及Ⅱ型胶原表达方面能力最强，然而体外培养发现髓核细胞增殖能力差，这就限制了髓核细胞作为种子细胞在椎间盘退变性疾病治疗中的研究及应用。
端粒是真核细胞染色体末端的一种特殊结构，由端粒DNA和端粒蛋白质组成，其功能是完成染色体末端的复制，防止染色体融合、重组和降解^[3-4] 。在大多数正常体细胞，由于所谓的“末端复制问题”，端粒随每次细胞分裂而缩短。当端粒缩短到临界长度时，即会造成细胞静止或凋亡，称之为细胞衰老。但在生殖细胞和肿瘤细胞等永生化细胞中，一般通过一种细胞内反转录酶——端粒酶的作用，端粒的长度维持稳定^[5] ，因此保证了这些细胞的无限分裂。
端粒酶有3个组成部分：端粒酶RNA、端粒酶相关蛋白和端粒酶催化亚基。端粒酶RNA是合成端粒的模板，也是相关蛋白的结合支架，人端粒酶反转录酶是含有7个基元的转录酶，表现聚合酶活性，在无细胞的情况下将端粒酶RNA和人端粒酶反转录酶混合在一起即可表现端粒酶活性，而端粒酶相关蛋白与端粒长度调节和端粒酶活性无关^[6] 。由于端粒酶RNA在细胞中大量存在，因此，端粒酶活性主要由人端粒酶反转录酶决定。许多研究者利用外源性人端粒酶反转录酶基因，使得多种细胞“永生化”[^7-12] 。Chung等作者曾利用转染脂质体介导外源性人端粒酶反转录酶基因，“永生化”了绵羊的髓核细胞。而Sakai等^[13]利用反转录病毒介导外源性SV40基因，使得髓核细胞“永生化”。由于脂质体转染是一种化学介导，仅仅能在研究领域使用，而不能用于临床治疗，而反转录病毒存在一定得致突变、致病风险，且感染率低。因此本课题组选用腺相关病毒介导外源性人端粒酶反转录酶基因，“永生化”髓核细胞，以便在不久的将来应用于临床。
文章期望通过腺相关病毒2载体将外源性人端粒酶反转录酶基因介导入髓核细胞中，从而增强髓核细胞的生物学特性，延长其在体外的传代时间及增殖能力，并保持细胞的细胞表型，即所谓的“永生化”。

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材料方法

设计：对比观察实验。

材料：髓核来源于22岁男性腰椎间盘突出患者，患者自愿捐献髓核，对实验方案知情同意，且得到医院伦理委员会批准。

方法：

髓核细胞分离培养：实验得到本院伦理委员会批准。于无菌环境下将获取的髓核组织，反复用PBS冲洗5遍，去除血细胞及脂肪组织，仔细分离髓核组织，并剪成约1 mm³的碎块，植入15 mL离心管中，加入Ⅱ型胶原酶(0.1%)，放入37 ℃孵育箱中4 h，3 000×g速度离心5 min，将离心后的细胞团块用DMEM/F12培养液重悬浮，再次离心，弃上清，加入含体积分数10%胎牛血清的DMEM/F12培养液，重悬浮细胞，计数，以1×10⁸ L^-1细胞浓度接种至培养瓶中，待细胞80%融合后，传代培养。

pSNAV2.0-pRSV-hTERT质粒构建及鉴定：①以质粒pLP2为模板扩增启动子pRSV，引物为：pRSV-XhoI-286-F：5-GCC CTC GAG AAT GTA GTC TTA TGC AAT AC-3；

pRSV-KpnⅠ-286-R5-GCC GGT ACC CTT GGA GGT GCA CAC CAA T-3回收产物，以XhoⅠ+KpnⅠ双酶切，回收大片段，将其与pSANV2.0以XhoⅠ+KpnⅠ双酶切回收的大片断连接转化，构建成质粒pSANV2.0-pRSV，利用pRSV-XhoⅠ-286-F/pRSV-KpnⅠ-286-R引物PCR鉴定，阳性克隆用XhoⅠ+KpnⅠ双切鉴定，正确者应切出6.3 kb和270 bp的条带，将构建正确的质粒pSANV2.0-PRSV再用KpnⅠ+SalⅠ双切，回收大片段。②将pSNAV2.0-hTERT用KpnⅠ+SalⅠ双切，回收3.4 kb的大片段。③将①和②回收的片段连接转化，构建pSANV2.0-pRSV-hTERT。④构建后质粒先用PCR鉴定，鉴定引物序列为TERT-1013-F：5-GTG TAC GCC GAG ACC AAG C-3；TERT-1013-R：5-AGT GCC TTC ACC CTC GAG G-3；PCR鉴定的阳性克隆用KpnⅠ+SalⅠ双切，正确者应切出6.6 kb和3.4 kb的条带，正确的质粒进一步测序鉴定。

腺相关病毒2-人端粒酶反转录酶的构建、扩增及纯化：利用AAVMax^TM包装系统获得新霉素筛选的阳性大肠杆菌克隆，转染293细胞，扩增并纯化获得腺相关病毒2-人端粒酶反转录酶病毒载体。

感染复数(MOI)的测定：在24孔细胞培养板中，加入1 mL的1×10⁸ L^-1的髓核细胞悬液，细胞孵育箱中培养至80%细胞融合，移除细胞悬液，DMEM/F12培养液洗涤3遍，计数细胞，参考腺相关病毒2对细胞的转染最佳转染复数1×10⁵ v·g/cell^[14]，分别以1×10⁴，5×10⁴，1×10⁵和2×10⁵ v·g/cell的腺相关病毒2-增强型绿色荧光蛋白转染髓核细胞，孵育箱中以不含血清的培养基培养2 h。移除病毒悬液，完全培养基洗涤3次。加入DMEM/F12完全培养基培养24 h后换液，倒置荧光显微镜下观察细胞，于不同时间点计数相同视野下绿色荧光蛋白阳性细胞在总细胞中的百分率。以计算腺相关病毒2转染人髓核细胞的最佳MOI。

RT-PCR检测人端粒酶反转录酶基因表达：用单纯腺相关病毒2及腺相关病毒2-人端粒酶反转录酶分别转染髓核细胞。在转染后1，2及4周收集两组细胞，按Trizol法常规提取总RNA，以TERT-F：5’CAG AGG TCA GGC AGC ATC G 3’；TERT-R：3’CAT GTA CGC TGT CAA GCA CCG 5’为上下游引物，以RT-PCR法检测转染后髓核细胞mRNA中。选用犬的GAPDH为内参，上下游引物分别为：GAPDH-F：5’AAG GCT GTG GGC AAG G3’，GAPDH-R：3’TGG GTG AGG AGG TGG AAA 5’。以15 g/L的琼脂糖凝胶电泳检测反应物中目的条带。EB染色后紫外灯下观测，采集结果，并进行目的条带与内参条带之间的灰度值比较。

主要观察指标：pSNAV2.0-pRSV-hTERT质粒构建及鉴定；腺相关病毒2-人端粒酶反转录酶的构建、扩增及纯化；转染复数MOI的测定；腺相关病毒2-人端粒酶反转录酶体外转染髓核细胞及基因表达。

统计学分析：每次实验选用3个复孔，所有数值为5次独立实验的均数。实验所得数据采用方差分析，P < 0.05为差异有显著性意义。

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讨论

目前治疗椎间盘退变主要还是采用外科干预，切除退变的椎间盘，自认识本疾病百年来，治疗未取得突破性的进展。随着组织工程技术、基因技术、生物学治疗技术的发展及对椎间盘退变病变本质的认识，许多研究者试图建立一种全新的治疗策略。髓核细胞在椎间盘高度及功能维持方面发挥着重要作用，也是构建组织工程椎间盘的种子细胞之一。然而，观察到髓核细胞在体外培养超过5代以后，就会出现细胞表型丢失，导致细胞生物学功能降低及细胞增殖能力下降。因此，提高髓核细胞体外培养的增殖能力，延长髓核细胞体外培养的生存时间，并使髓核细胞保持固有的生物学特性，将会为组织工程椎间盘在椎间盘退变性疾病的治疗中，提供良好的基础^[15-20] 。
腺相关病毒是一种的微小单链DNA病毒，具有许多优点：①人类感染率高，可达90%以上。②免疫原性弱。③无人类致病性。④不会导致染色体断裂、突变。⑤感染范围广，对分裂和非分裂期的细胞都能感染。⑥能长期稳定的表达携带的外源性基因^[21-35] 。因此，腺相关病毒被广泛用于细胞转染研究。本文所用的腺相关病毒2-人端粒酶反转录酶载体是采用AAVMaxTM包装系统，具有易于大规模制备及纯化的优点。
腺相关病毒2对不同组织的最佳MOI是不同的，人髓核细胞是一种体外增殖能力比较差的细胞，腺相关病毒2对其的最佳MOI，还不得而知，文献中也未找到相关研究，参照文献中腺相关病毒2对其他人纤维类细胞的最佳MOI，本实验设计选取1×10⁴、5×10⁴、1×10⁵、2×10⁵ v•g/cell，利用腺相关病毒2/增强型绿色荧光蛋白病毒载体测试腺相关病毒2对人髓核细胞的最佳MOI，此载体转染后可在荧光显微镜下直观观察，并计算转染率，以确定最佳MOI。实验结果显示MOI为5×10⁴v•g/cell时，转染后第3，7天，转染率均保持在80%左右，而随着MOI的继续增加，转染率未见明显提高，当达到2×10⁵ v•g/cell时，转染率不但在第4天没有明显增加，反而在第7天时有明显的减低。分析原因认为：包装好的腺相关病毒载体中含有一定比例空泡病毒，也就是不含目的基因的病毒。而腺相关病毒进入细胞，是通过与细胞表面的受体结合发挥作用的，而空泡病毒在MOI较高时相应的绝对值也多，故而与细胞表面的受体结合，导致含有目的基因的腺相关病毒与细胞结合下降，从而导致更高浓度的MOI并不能使得转染率比5×10⁴ v•g/cell明显提高，反而有所下降。而对于高浓度的MOI第7天，相比较与第2天转染率下降的原因，作者认为是由于高浓度的MOI中有机溶剂的残留浓度相应的较高，导致部分细胞增殖力受损所致，使得转染了含有目的基因的髓核细胞分裂能力下降，而未受到腺病毒转染的髓核细胞增殖能力正常，从而导致在第7天时转染率现对下降的结果。
本实验成功将外源性基因利用腺相关病毒2介导入人髓核细胞。通过PCR技术，转染组髓核细胞扩增出了阳性目的条带，而对照组细胞未见目的条带，这说明人髓核细胞染色体中不含人端粒酶反转录酶基因片段，转染组中的阳性条带是外源性导入的，在实验中还观察到不同的MOI转染的髓核细胞，人端粒酶反转录酶基因的mRNA含量不同，在转染后第2周，髓核细胞中的人端粒酶反转录酶基因含量相对于第1周时有轻度增高，而在转染后第3，4周仍能检测到人端粒酶反转录酶基因mRNA的稳定表达，这证明腺相关病毒载体载体能将外源性目的基因有效地整合到髓核细胞的染色体中，使得外源性基因能够持续稳定的表达。
在接下来的实验中作者将对外源性人端粒酶反转录酶基因的蛋白表达进行检测，并对由此蛋白组成的端粒酶活性进行检测，期望通过引入外源性人端粒酶反转录酶基因，改变髓核细胞的增殖能力及寿命，并对其安全性进行进一步分析。
综上所述，本实验利用腺相关病毒2可以成功构建包含人端粒酶反转录酶基因的病毒载体，腺相关病毒2-人端粒酶反转录酶能有效地转染人髓核细胞并稳定表达人端粒酶反转录酶基因的mRNA。这为腺相关病毒2介导髓核细胞永生化实验奠定了基础，为椎间盘退变性疾病治疗带来了新的希望。

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