经皮纤维环穿刺与经肌间隙纤维环刀刺建立兔椎间盘退变模型

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2014.13.016

中国组织工程研究 ›› 2014, Vol. 18 ›› Issue (13): 2059-2064.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.2014.13.016

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经皮纤维环穿刺与经肌间隙纤维环刀刺建立兔椎间盘退变模型

贺庆，李兵，卓祥龙，赖草生，铁超恩

He Qing, Li Bing, Zhuo Xiang-long, Lai Cao-sheng, Tie Chao-en

收稿日期:2014-01-28 出版日期:2014-03-26 发布日期:2014-03-26
通讯作者: 李兵，博士，主任医师，主要从事脊柱骨科学的研究，广西柳州市工人医院，广西壮族自治区柳州市 545005
作者简介:贺庆，男，1980年生，湖南省人，汉族，广西医科大学在读硕士，主治医师，主要从事脊柱骨科学的研究。
基金资助:
广西自然科学基金项目(2010GXNSFA013257)

Percutaneous annulus fibrosus needle puncture versus muscular annulus fibrosus knife penetration for establishing a rabbit model of intervertebral disc degeneration

广西柳州市工人医院，广西壮族自治区柳州市 545005

Liuzhou Workers Hospital, Liuzhou 545005, Guangxi Zhuang Autonomous Region, China

Received:2014-01-28 Online:2014-03-26 Published:2014-03-26
Contact: Li Bing, Ph.D., Chief physician, Liuzhou Workers Hospital, Liuzhou 545005, Guangxi Zhuang Autonomous Region, China
About author:He Qing, Studying for master’s degree, Attending physician, Liuzhou Workers Hospital, Liuzhou 545005, Guangxi Zhuang Autonomous Region, China
Supported by:
Natural Science Foundation of Guangxi Zhuang Autonomous Region of China, No. 2010GXNSFA013257

摘要/Abstract

摘要：

背景：有研究表明椎间盘退变模型的建立可为椎间盘退变治疗提供实验载体，但目前尚缺乏公认的最佳实验动物模型。
目的：比较经皮纤维环穿刺法和经肌间隙纤维环刀刺法建立兔椎间盘退变模型的差异。
方法：将新西兰大白兔分别采用经皮纤维环穿刺法和经肌间隙纤维环刀刺法建立兔椎间盘退变模型，穿刺后4，8，16周通过磁共振和组织病理学检查观察腰椎间盘髓核变性及组织病理情况。
结果与结论：穿刺后4周，两组兔椎间盘髓核内T2加权像信号降低、变暗，椎间隙高度下降，但经皮纤维环穿刺组T2信号强度评分较经肌间隙纤维环刀刺组低(P < 0.05)；穿刺后8周，两组T2信号强度评分均增高，经皮纤维环穿刺组T2信号强度评分较经肌间隙纤维环刀刺组低(P < 0.05)；穿刺后16周，两组兔椎间盘髓核内T2信号强度评分达最高且差异无显著性意义，两组椎间隙均明显变窄，椎间盘均亮度变黑，两组差异不明显；经皮纤维环穿刺组手术时间少于经肌间隙纤维环刀刺组(P < 0.05)，经肌间隙纤维环刀刺组感染率为5.6%，而经皮纤维环穿刺组无感染。结果证实，经皮纤维环穿刺法建立兔椎间盘退变模型建模时间短，感染率低，效果优于经肌间隙纤维环刀刺法造模。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：人工关节；骨植入物；脊柱；骨折；内固定；数字化骨科；组织工程

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关键词: 植入物, 脊柱植入物, 组织工程实验造模, 经皮纤维环穿刺法, 经肌间隙纤维环刀刺法, 椎间盘退变, 动物模型, 兔, 广西壮族自治区自然科学基金

Abstract:

BACKGROUND: Studies have shown that the establishment of disc degeneration model provides experimental support for the treatment of intervertebral disc degeneration, but the current study still lacks of recognized optimal animal models.
OBJECTIVE: To compare the differences of percutaneous annulus fibrosus needle puncture with muscular annulus fibrosus knife penetration in establishing a rabbit model of intervertebral disc degeneration.
METHODS: The New Zealand rabbit models of intervertebral disc degeneration were established by percutaneous annulus fibrosus needle puncture and muscular annulus fibrosus knife penetration. At 4, 8 and
16 weeks after puncture, lumbar disc degeneration and histopathological conditions were observed using magnetic resonance imaging and histopathology examination.
RESULTS AND CONCLUSION: At 4 weeks after the puncture, T2-weighted image signal reduced, darken, and disc height decreased in rabbit nucleus pulposus of the two groups. T2 signal intensity scores were lower in the percutaneous annulus fibrosus needle puncture group compared with the muscular annulus fibrosus knife penetration group (P < 0.05). At 8 weeks after puncture, T2 signal intensity scores were increased in both groups. T2 signal intensity scores were lower in the percutaneous annulus fibrosus needle puncture group compared with the muscular annulus fibrosus knife penetration group (P < 0.05). At 16 weeks after puncture, T2 signal intensity reached a peak, and no significant difference was detected between the two groups. Intervertebral space became significantly narrowed. The brightness of the disc became black. There were no significant differences between
the two groups. The time of operation was shorter in the percutaneous annulus fibrosus needle puncture group than that in the muscular annulus fibrosus knife penetration group (P < 0.05). Infection rate was 5.6% in the muscular annulus fibrosus knife penetration group. No infection was observed in the percutaneous annulus fibrosus needle puncture group. Results verified that the time of establishing a rabbit model of intervertebral disc degeneration using percutaneous annulus fibrosus needle puncture was short, and the infection rate was low. Thus, its effects were better than muscular annulus fibrosus knife penetration.

中国组织工程研究杂志出版内容重点：人工关节；骨植入物；脊柱；骨折；内固定；数字化骨科；组织工程

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Key words: intervertebral disk, skeleton, cartilage, fibrocartilage

中图分类号:

R318

贺庆，李兵，卓祥龙，赖草生，铁超恩. 经皮纤维环穿刺与经肌间隙纤维环刀刺建立兔椎间盘退变模型[J]. 中国组织工程研究, 2014, 18(13): 2059-2064.

He Qing, Li Bing, Zhuo Xiang-long, Lai Cao-sheng, Tie Chao-en. Percutaneous annulus fibrosus needle puncture versus muscular annulus fibrosus knife penetration for establishing a rabbit model of intervertebral disc degeneration[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2014, 18(13): 2059-2064.

图/表（结果） 2

2.1 实验动物数量分析纳入的新西兰大白兔36只，均进入结果分析，无死亡，无需补充，最终计入结果分析的数量36只。

2.2 实验动物穿刺并发症、成功率及手术时间分析经肌间隙纤维环刀刺组1兔穿刺后伤口出现红肿积液，予以青霉素注射后，伤口换药后，伤口愈合良好，感染率为5.6%，而经皮纤维环穿刺组无感染，两组均未出现肢体瘫痪等其它并发症，两组所有动物16周后均出现影像学变化，提示两组动物造模成功率为100%。

纤维环穿刺组的穿刺时间(19.64±1.03) min，经肌间隙纤维环刀刺组穿刺时间(30.85±1.11) min，两组相比较差异有显著性意义(P < 0.05)。

2.3 MRI检测数据变化所有MRI影像学资料由放射科医生进行盲法评估，根据Thompson分级^[7]，T2信号强度变化分为1-4级。1级：正常；2级：轻度减弱且高信号区域明显缩小；3级：中度减弱；4级：严重减弱。经秩和检验两造模组间比较差异有显著性意义(P < 0.05)，穿刺后8周时与穿刺后4周时相同，但16周时两组间MRI Thompsom分级比较差异无显著性意义(P > 0.05)，见表1。

2.4 MRI扫描结果 MRI Thompsom分级4，8，16周逐渐增加，退变程度加重，穿刺后4周时针剌组MRI中实验椎处椎间盘的改变不明显(图2A)，而经肌间隙刀刺组见实验椎处椎间盘T2信号明显变弱(图2B)，经秩和检验两造模组间MRI Thompsom分级比较差异有显著性意义(P < 0.05)，穿刺后8周时与穿刺后4周时相同，但16周时两组间MRI Thompsom分级比较差异无显著性意义(P > 0.05，表1)。

2.5 穿刺后兔椎间盘病理组织学观察结果正常的髓核组织(L_5/6)呈透明胶质样，镜下见细胞均匀分布，形态正常，随着时间的推移，髓核组织逐渐混浊，髓核细胞数量不断减少，少数可见有血管翳的生长。

经皮纤维环穿刺组和经肌间隙纤维化刀刺组造模后4周髓核组织髓核细胞逐渐减少，形态不规则，分布不均匀，纤维软骨组织增生，经肌间隙纤维环刀刺组较经皮纤维环穿刺组更为显著。

经皮纤维环穿刺组和经肌间隙纤维化刀刺组造模后第16周髓核中主要为纤维软骨组织，伴有极少量髓核细胞，髓核几乎被纤维软骨组织替代，纤维环排列不整齐，与髓核界限不清，可知16周时两组实验动物椎间盘均发生了明显的退变(图3)。

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引言

材料方法

设计：随机对照动物实验。

时间及地点：于2013年4至8月在广西医科大学动物实验中心完成。

材料：健康成年的新西兰大白兔36只，体质量2.0- 2.5 kg，雌雄不计，由广西医科大学动物实验中心提供，动物许可证号：SCXK(桂)2009-0002，经MRI和CT检查排除脊柱的先天性畸形和椎间盘退变及病兔及孕兔，单笼喂养，标准条件下适应性饲养1周。实验对动物的处理方法符合中华人民共和国科学技术部颁发的《关于善待实验动物的指导性意见》。

椎间盘退变动物模型建立实验用主要仪器：
仪器	来源
实验外科手术器械	柳州市工人医院设备科提供
C臂机	Philips公司
3.0 T磁共振机	德国西门子公司
光学显微镜	Olympus公司

实验方法：

分组及建模：随机数字表法将36只新西兰大白兔随机分为经皮纤维环穿刺组和经肌间隙纤维环刀刺组，每组18只。

经皮纤维环穿刺组：术前禁食8 h，腹腔注射体积分数3%戊巴比妥钠(30 mg/kg)，麻醉起效后，右侧卧位固定四肢。用16号针头与兔的脊椎骨平行、垂直放置，C臂下定位于L_5/6椎间隙，穿刺区剪除兔毛后碘伏消毒，龙胆紫体外标记，取穿刺针，仔细触及L₆横突与椎体夹角(该点后缘两三毫米对应L_5/6椎间盘平面)，呈向背侧约30°角度缓慢进针，当遇到阻力时，针头上下移动探查，上下针尖刺到骨性物质，中间组织稍软，说明针类已穿刺到椎间盘纤维环，进一步穿刺，穿刺有落空感后即停止，发现穿刺针不易移动时留置，在C臂机X射线机透视下可确定穿刺成功(图1)。

经肌间隙纤维环刀刺组：穿刺前禁食8 h。经腹腔注射体积分数3%戊巴比妥钠(30 mg/kg)，麻醉起效后，右侧卧位四肢固定。穿刺区剪毛后消毒，左侧旁正中入路显露L₅_-₇椎体。切口从背最长肌与腹外斜肌间隙进入，长约2 cm，依次切开，并沿着横突两侧行骨膜下分离肌肉附着点，一直分离至暴露腰椎和椎间盘左侧部分，显露2个连续的椎体前缘。髂嵴水平线为L_5/6椎间盘的定位标记。L_5/6椎间盘作为实验间盘。用橡皮套固定11号尖刀，露出刀尖1.5 mm，在椎间盘侧前方做斜行切口(刀片方向与上下终板成60°角，深度1.4-1.6 mm) ^[6]。

穿刺后处理：分别于穿刺后肌注青霉素共3 d。穿刺后单笼自由喂养，观察实验动物进食、活动情况、穿刺切口愈合情况、尿便情况、下肢活动情况以及死亡情况(有死亡者立即按要求进行重新构建模型)，分别于穿刺后4，8，16周每组随机选取4只动物麻醉后腰椎MRl检查，每组随机选取2只行髓核组织病理切片。空气栓塞法处死兔后，迅速用尖刀切取髓核组织，无菌生理盐水冲洗血迹后，以体积分数10%的甲醛溶液后固定24 h，石蜡包埋，行常规切片苏木精-伊红染色，观察髓核组织形态学变化及细胞数量的变化，

MRI检测：所有动物均在体积分数30%戊巴比妥钠耳缘静脉麻醉下仰卧位进行MRl腰椎矢状位扫描，穿刺后4，8，16周，采用3.0 T西门子磁共振扫描机进行MRI检查。保持麻醉状态，仰卧放置肢体线圈磁场中，腰椎部位置于线圈中心。T2相冠状位扫描定位L₁_-₆椎间盘，正中矢状位扫描观察穿刺后退变的T2信号。

T2序列检查参数：TR 1 500 ms，TE 135 ms，层厚 1 mm，视野15×15，矩阵192×100。

主要观察指标：通过磁共振和组织病理学检查观察腰椎间盘髓核变性及组织病理情况，比较两组的手术时间、手术并发症、成功率和椎间盘退变分级程度。

统计学分析：实验数据应用SPSS 17.0统计学软件处理，因资料属于等级资料，采用秩的非参数检测方法中的配对设计符号秩检验进行检测，检验水准a=0.05。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：人工关节；骨植入物；脊柱；骨折；内固定；数字化骨科；组织工程

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讨论

动物模型是研究椎间盘退变的发生机制和检测各种治疗有效性的一种可靠手段。通过外科手术的方法损伤纤维环引发椎间盘退变是目前广泛应用的一种腰椎间盘退变建

模方法。椎间盘退变的生物学机制尚不明确，构建椎间盘退变模型是研究基础和关键。近年来国内外报道的新型椎间盘退变模型分为体外和体内培养模型两大类^[8]。体外模型包括椎间盘细胞模型和椎间盘组织块模型，多用于细胞生物学行为方面的研究，适用面较广，但培养要求较高，模拟体内环境有局限。体内模型有机械力学模型、外伤模型、酶化学模型、缺血模型、吸烟模型和基因敲除模型等^[9-13]，多用于采取特定干预措施的椎间盘退变模型的研究，适用面较窄，但干预技术较易实现。

刘海飞等^[14]运用显微注射纤维结合素片段建立新型兔椎间盘退变模型成功，为椎间盘退变分子水平的研究提供了一种新型的、实用的动物模型。Moss等^[15]详细的描述了腹膜后入路纤维环穿刺法建立兔退变性椎间盘的实验方法，以提高未来的实验结果的重现性，为腹膜后入路树立了一个新的标准。动物椎间盘退变模型也可分为自发性和诱导性两种。纤维环损伤法^[16-20]、软骨终板损伤法^[21-22]、髓核损伤法^[23]、间接椎间盘损伤法都属于诱导性方法建立椎间盘退变模型目前建立腰椎间盘退变动物模型的方法很多^[24-25]，但都存在各种各样的不足和缺陷^[26-27]。模型的制作在于建立一种基本能再现椎间盘退行性变的客观规律，模型重复性好，同时对动物的创伤小、操作简便、成活率高的优质动物模型方法。要求所选动物解剖和生理特点尽可能与人类相似，所选动物的经济性和便利性高，虽然实验观察发现恒河猴等的椎间盘与人类最为相似，也有孔杰等^[28]应用微创技术建立恒河猴腰椎间盘早期退变模型，但由于恒河猴中国产量极少，又价格昂贵，所以缺乏经济性，采用兔建立椎间盘退变动物模型相对于其他动物模型有许多优势，在椎间盘器官培养的稳定性等明显优于大鼠^[29]。兔体型相对较大，兔椎间盘组织体积量大，方便进行操作和取材，不涉及伦理问题，具有经济性和便利性，同时椎间盘结构与人类基本相同，但兔为四肢行走的动物，脊柱骨负重的特点与人不尽相同。吴靖平等^[30]通过截除双前肢成功建立了双后肢大鼠椎间盘退变动物模型，但大鼠的椎间盘过小，且成年大鼠髓核中有脊索细胞，涉及一定的伦理问题，不利于后期进一步的动物实验。在过去的研究中，人们建立了大量不同种类的种动物模型，每一种模型对于研究发病机制、病理生理及探索新的治疗方法，都既有其优势，又有其劣势。例如：小鼠在模仿人椎间盘衰老和退变方面有几种优势：在所有实验动物中，小鼠的腰椎在比例和几何学上与人是最相近的^[31]。小鼠腰椎运动节段也显示生物力学特征例如压缩和扭转强度与人的相似^[32]。可以用小鼠的间盘作为人间盘的生物力学模型而提供进一步的数据。其他使用小鼠作为动物模型的益处还在于费用低，可利用的抗体和基因资料多，也有很多外科处理方法可以利用。因此，鼠类衰老模型用于椎间盘退变的研究，对于探索与年龄相关的椎间盘退变细胞和分子机制、快速评价以预防和治疗与盘退变衰老相关的变化具有极大的意义^[33]。

从小鼠到人的间盘研究推理受到很多限制：四足与双足生物力学的差异；椎间盘大小不一而造成的营养扩散差异；小鼠间盘终生存在脊索细胞，而人4岁以后脊索细胞逐渐消失，这也是一个重要的差异，这些差异是小鼠模型的劣势。再如：牛尾模型的构成和基质合成情况可以模拟一个良好的年轻人椎间盘模型，但对于研究年龄相关性退变则不合适；尾部有更容易操作的优势，但就生物力学和结构而言，该部位的盘明显与腰椎间盘不同^[34]。沙鼠和软骨营养不良犬都是与年龄相关的椎间盘退变模型^[35-36]，但是它们的发病率不是100%，并且基因的鉴定尚不清楚。兔衰老模型的建立需要的时间长，并且受到商品化研究试剂如抗体的限制^[37]。由于人是直立的双足动物，而模型系统中使用的都是四足动物，没有完全特殊的技术来保证动物能与人的机体一样进行椎间盘代谢的各种运行。因此，目前尚没有单一的动物模型能完全复制影响成年人腰椎间盘的环境。虽然目前这一疾病的“动物模型系统”存在着很多局限性，但对于研究维持正常间盘和退变过程的分子和细胞通路是必不可少的。椎间盘退变的程度及速度与损伤的程度及方式有关，实验经皮纤维环穿刺法和经肌间隙纤维环刀刺法穿刺后4周的MRI检查，兔椎间盘髓核面积缩小，纤维环面积增大，髓核内T2加权像信号降低、变暗，椎间隙高度下降，但经皮纤维环穿刺组T2信号强度评分较经肌间隙手术入路刀刺组低；穿刺后16周椎间盘T2信号强度评分达最高，两组比较差异无显著性意义，椎间隙明显变窄，椎间盘亮度变黑，裂隙处髓核突出，瘢痕组织形成，表面分布一些小血管和疏松缔组织，髓核内细胞含量减少，纤维软骨形成，两组变化差异不明显。

经皮纤维环穿刺法需一定特殊的设备完成，减少了操作难度，实验采用在C臂机引导下穿刺，术中做好了射线防护措施。崔运能等^[38]经肌间隙手术入路模型制作成功，但均是在有伤口下完成，操作中也容易损伤周围软组织，给造模动物带来很大的伤害，有伤口必然增加了感染的机会。与以往的经腹膜外切口造模相比，切口明显缩小，腹膜破裂的机会显著减少，动物的死亡率很低，在促进椎间盘退变的程度较经皮纤维环穿刺法剧烈，故早期退变快，为短时间迅速建立椎间盘的退变模型，提供了一种合适的方法。经皮纤维环穿刺法操作简单，损伤小，感染机会小，动物瘫痪率低，动物存活率高，操作时间短等优点，为腰椎间盘退变模型提供一种简便、可行、高效的模型制作方法，为进一步研究腰椎间盘退变机制与治疗提供帮助。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：人工关节；骨植入物；脊柱；骨折；内固定；数字化骨科；组织工程
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经皮纤维环穿刺与经肌间隙纤维环刀刺建立兔椎间盘退变模型

Percutaneous annulus fibrosus needle puncture versus muscular annulus fibrosus knife penetration for establishing a rabbit model of intervertebral disc degeneration

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