低浓度硫化氢对类风湿性关节病变的软骨保护

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2014.11.004

中国组织工程研究 ›› 2014, Vol. 18 ›› Issue (11): 1659-1664.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.2014.11.004

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低浓度硫化氢对类风湿性关节病变的软骨保护

周智¹，刘开祥¹，谢跃¹，王黎明²

¹南京医科大学附属淮安第一医院骨科，江苏省淮安市 223300；²南京医科大学附属南京医院骨科，江苏省南京市 210000

修回日期:2014-01-10 出版日期:2014-03-12 发布日期:2014-03-12
通讯作者: 周智，硕士，主治医师，南京医科大学附属淮安第一医院骨科，江苏省淮安市 223300
作者简介:周智，男，1982年生，江苏省宿迁市人，汉族，南京医科大学在读博士，主治医师，主要从事骨关节外科疾病的研究。
基金资助:
国家自然科学基金项目支持(项目批准号81171745)，项目名称：可逆期退行性变软骨基质生化成分改变与磁共振功能成像(dGEMRIC/T2 mapping)的相关性实验研究

Protective effects of low-concentration hydrogen sulfide on rheumatoid joint disease

Zhou Zhi¹, Liu Kai-xiang¹, Xie Yue¹, Wang Li-ming²

¹Department of Orthopedics, Huai’an First People’s Hospital Affiliated to Nanjing Medical University, Huaian 223300, Jiangsu Province, China; ²Department of Orthopedics, Nanjing Hospital Affiliated to Nanjing Medical University, Nanjing 210000, Jiangsu Province, China

Revised:2014-01-10 Online:2014-03-12 Published:2014-03-12
Contact: Zhou Zhi, Department of Orthopedics, Huai’an First People’s Hospital Affiliated to Nanjing Medical University, Huaian 223300, Jiangsu Province, China
About author:Zhou Zhi, Studying for doctorate, Attending physician, Department of Orthopedics, Huai’an First People’s Hospital Affiliated to Nanjing Medical University, Huaian 223300, Jiangsu Province, China
Supported by:
he National Natural Science Foundation of China, No. 81171745

摘要/Abstract

摘要：

背景：类风湿性关节炎是一种常见的慢性系统性自身免疫疾病，以关节滑膜病变、骨质侵蚀为主要特征，临床上的治疗仍然比较棘手。

目的：探讨外源性硫化氢对类风湿性关节炎大鼠关节病变的影响。

方法：将SD大鼠分为4组：空白组、模型组、高浓度硫化氢干预组、低浓度硫化氢干预组。干预2，4周时，测量关节炎指数，血清炎症因子肿瘤坏死因子α和白细胞介素1β水平，滑膜组织病理学变化，膝关节标本Ⅱ型胶原染色的平均吸光度值。

结果与结论：从关节炎指数，血清炎症因子水平以及滑膜染色炎性浸润方面看，模型组以及硫化氢干预组均高于空白组，高浓度硫化氢干预组明显高于模型组(P < 0.05)，低浓度硫化氢干预组低于模型组(P < 0.05)。在膝关节软骨Ⅱ型胶原染色的平均吸光度值方面，模型组以及2个硫化氢干预组均低于空白组，高浓度硫化氢干预组明显低于模型组(P < 0.05)，低浓度硫化氢干预组高于模型组(P < 0.05)。结果可见硫化氢对类风湿关节炎症有调节作用，高浓度的硫化氢加重关节炎症及软骨降解，低浓度的硫化氢减轻关节炎症并对软骨有保护作用。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

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关键词: 组织构建, 软骨组织工程, 硫化氢, 类风湿性关节炎, 炎症因子, Ⅱ型胶原, 滑膜, 软骨, 国家自然科学基金

Abstract:

BACKGROUND: Rheumatoid arthritis is a common chronic systemic autoimmune disease which is characterized by synovial lesions and bone erosion. The clinical treatment is still a difficulty.

OBJECTIVE: To explore the effect of exogenous hydrogen sulfide on the articular lesions in rheumatoid arthritis rats.

METHODS: Sprague-Dawley rats were divided into four groups: control group, model group, high concentrations of hydrogen sulfide intervention group, low concentrations of hydrogen sulfide intervention group. At 2 and 4 weeks after intervention, the arthritis index, levels of serum inflammatory cytokines (tumor necrotic factor-α and interleukin-1β), pathological change of synovial tissue, average absorbance of knee joint specimens using collagen-II immunohistochemical staining were measured.

RESULTS AND CONCLUSION: The arthritis index, levels of serum inflammatory cytokines and inflammatory infiltration of synovial staining in the model group and two intervention groups were higher than that in control group, the high concentrations of hydrogen sulfide intervention group was significantly higher than the model

group (P < 0.05) while the low concentrations of hydrogen sulfide intervention group was lower than the model group (P < 0.05). The average absorbance of knee cartilage specimens using collagen-II immunohistochemical staining was lower in the model group and two hydrogen sulfide intervention groups compared with the control group, the high concentrations of hydrogen sulfide intervention group was significantly lower than the model group (P < 0.05) while low concentrations of hydrogen sulfide intervention group was higher than the model group (P < 0.05). Hydrogen sulfide has a regulatory effect on rheumatoid arthritis, high concentrations of hydrogen sulfide aggravate arthritis and cartilage degradation, low concentrations of hydrogen sulfide reduce arthritis and protect cartilage.

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

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Key words: arthritis, rheumatoid, hydrogen sulfide, tumor necrosis factor-alpha, interleukin-1 beta, collagen type II, synovial membrane, cartilage

中图分类号:

R318

周智，刘开祥，谢跃，王黎明. 低浓度硫化氢对类风湿性关节病变的软骨保护[J]. 中国组织工程研究, 2014, 18(11): 1659-1664.

Zhou Zhi, Liu Kai-xiang, Xie Yue, Wang Li-ming. Protective effects of low-concentration hydrogen sulfide on rheumatoid joint disease[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2014, 18(11): 1659-1664.

图/表（结果） 2

2.1 实验动物数量分析 48只SD雌性大鼠中44只参加实验，中途有4只脱落，出现2只严重免疫反应死亡以及2只造模后足跖无任何反应。模型组和高浓度硫化氢干预组各有1只在第3周死亡，模型组和低浓度硫化氢干预组各有1只造模后足跖无任何反应，于2周时去除，未随机补充。

2.2 各组大鼠关节炎指数 结果可见在大鼠关节炎症的急性期(第2周)以及慢性期间(第4周)，高浓度硫化氢干预组关节炎指数升高，低浓度硫化氢干预组关节炎指数降低(表1)。

2.3 各组大鼠血清炎症因子水平比较 结果可见在大鼠关节炎症的急性期(第2周)以及慢性期间(第4周)，高浓度硫化氢干预组血清炎症因子肿瘤坏死因子α和白细胞介素1β水平升高，低浓度硫化氢干预组血清炎症因子肿瘤坏死因子α和白细胞介素1β水平降低(表1)。

2.4 各组大鼠踝关节滑膜组织苏木精-伊红染色病理检测 治疗第4周时(关节慢性炎症期间)，踝关节病理均提示滑膜增生和炎症细胞浸润，但高浓度硫化氢干预加重滑膜炎症，低浓度硫化氢干预减轻滑膜炎症(图1)。

2.5 各组大鼠膝关节Ⅱ型胶原免疫组化检测结果 治疗第4周时，空白组软骨Ⅱ型胶原纤维染色呈深棕色，分布均匀，吸光度值为0.703±0.103；模型组Ⅱ型胶原纤维染色呈浅褐色，分布出现不均匀，吸光度值为0.459±0.104；高浓度硫化氢干预组Ⅱ型胶原纤维染色很淡，分布不均匀，吸光度值为0.181±0.059；低浓度硫化氢干预组Ⅱ型胶原纤维染色呈接近深棕色，分布少许不均匀，吸光度值为0.598±0.097。四组两两比较，差异有显著性意义。说明大鼠关节炎症时软骨破坏，胶原降解，高浓度硫化氢干预加重胶原降解，低浓度硫化氢干预减轻胶原降解(图2)。

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引言

材料方法

设计：随机对照动物实验。

时间及地点：实验于2012年11月至2013年5月在南京医科大学附属南京医院动物实验中心及南京医科大学病理生理学实验室完成。实验室的生物安全防护水平为BSL-3。

材料：

实验动物：8周龄SD雌性大鼠48只，体质量(200± 15) g，于南京医科大学附属南京医院动物实验中心饲养，自由进食饮水，室温(23±2) ℃，间隔12 h照明，定期消毒及通风，饲养4周。

实验方法：

佐剂型关节炎大鼠模型的建立：参照文献[5]，在大鼠左后足跖皮内单次注射完全弗氏佐剂0.1 mL诱导为佐剂型关节炎大鼠模型。空白组在相同部位注射等量生理盐水。

动物分组：随机抽出8只大鼠作为空白组，其余40只大鼠采用上述方法制造佐剂型关节炎模型，将造模成功的36只大鼠随机分为3组，模型组、高浓度硫化氢干预组、低浓度硫化氢干预组，每组12只。

给药方法：空白组左后足跖皮内注射生理盐水后的第8天开始腹腔单次注射生理盐水，按照2 mL/kg剂量，每天注射直至处死；模型组于造模后的第8天开始腹腔单次注射生理盐水(2 mL/kg)，1次/d；高浓度硫化氢干预组于造模后的第8天开始腹腔单次注射高浓度硫氢化钠(56 μmol/kg)，按照2 mL/kg给药，1次/d；低浓度硫化氢干预组于造模后的第8天开始腹腔单次注射低浓度硫氢化钠(14 μmol/kg)，按照2 mL/kg给药，1次/d。

关节肿胀程度评估：于治疗后的第2，4周采用关节炎评分法对关节肿胀程度进行评估^[6]。0分：无关节炎；1分：关节有红色斑点或轻度肿胀；2分：关节中度红肿；3分：关节重度红肿；4分：关节严重红肿且不能负重。

炎症因子水平测定：实验进行至2周时，每组随机取一半数量的大鼠，氯胺酮麻醉后，腹主动脉取血，3 500 r/min离心15 min，吸取上清用ET管分装，-80 ℃深低温冰箱内保存。用ELIASA法，严格按照试剂盒上的说明书操作检测血清中炎症因子肿瘤坏死因子α和白细胞介素1β水平。

苏木精-伊红染色和Ⅱ型胶原免疫组化染色：实验进行至4周，将每组剩余大鼠给予氯胺酮麻醉，同样进行腹主动脉取血，取血完毕后沿大鼠后肢切开皮毛暴露出踝关节，于踝关节下方约0.5 cm处切开关节囊，可见滑膜组织，完全剥离滑膜组织，冰生理盐水冲洗2遍，浸泡于40 g/L多聚甲醛中固定，制成4 μm切片，苏木精-伊红染色，光镜观察。

同时去除膝关节周围软组织，取出膝关节，放置于在体积分数为10%甲醛溶液固定48 h后，使用硝酸-甲醛脱钙液脱钙，直至骨组织软化为止。脱钙后用乙醇梯度脱水，使用二甲苯透明，石蜡包埋，切片后进行Ⅱ型胶原免疫组化染色。采用Image Pro plus 6.0图像分析软件，测定单位面积软骨组织切片Ⅱ型胶原免疫组化染色的平均吸光度值。

主要观察指标：①关节炎指数。②肿瘤坏死因子α和白细胞介素1β水平。③踝关节滑膜组织病理学变化。④免疫组化检测膝关节Ⅱ型胶原表达。

统计学分析：所有计量资料经WPS表格软件整理，数据以x(_)±s形式表示，由第一作者采用SPSS 17.0统计软件包进行统计学分析，两均数比较采用成组t 检验，检验水准α=0.05。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

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讨论

类风湿性关节炎是一种以关节滑膜病变、骨质侵蚀为主要特征，以多关节炎病变为主的慢性系统性自身免疫性疾病。佐剂性关节炎又称弗氏佐剂关节炎，其模型是由细菌学家Freund于20世纪50年代创立^[7]，是研究类风湿关节炎病理机制和评价治疗类风湿关节炎药物的较理想动物模型^[8-9]。研究用MRI检测佐剂性关节炎大鼠关节局部病理改变^[10]，发现继发性对侧足爪在致炎后10-18 d出现以滑膜炎、滑膜纤维素沉着、关节囊肿胀为特征的关节周围炎症；第18-30天表现为持续性软组织炎症，伴有骨质溶解性骨膜炎、骨膜新骨形成、单核细胞浸润、血管翳形成，关节完全粘连^[11]。这些临床表现与人类风湿关节炎相似，在临床上更多发生于女性患者，故实验中采用雌性大鼠作为研究对象，并按照病理特点，实验节点为2周和4周，关节炎症处于相对急性期和相对慢性期。

通过类风湿性关节炎动物模型研究关节炎发病机制以及治疗，国内学者从中西医角度研究很多，比如杨军平等^[12]研究中药自拟通痹汤对Ⅱ型胶原诱导关节炎大鼠的免疫状态和炎症反应有一定的调节和抑制作用。刘曦等^[13]研究沙利度胺可以通过影响肿瘤坏死因子a的表达，抑制滑膜炎症及周围组织破坏，有效减轻胶原诱导型性关节炎大鼠关节的炎症程度。陈疆等^[14]研究认为差异蛋白质参与了细胞内多种生理活动和重要功能，可能参与了类风湿性关节炎关节滑膜病变的发生发展。

内源性硫化氢的发现与研究逐渐成为研究热点，认为与氧化应激有关^[15-16]，硫化氢的第一个生理作用首先是在大鼠脑组织中发现的^[17]，研究发现，超出生理范围之外的内源性硫化氢体系过度上调或下调都有可能导致机体疾病的发生，相应地反向调节内源性硫化氢体系可能是疾病临床防治的靶点^[18]。目前细胞实验和动物实验大多采用NaHS作为硫化氢的供体，部分采用Na₂S、硫化氢气体饱和溶液、GYY4137，本实验采用NaHS作为硫化氢的供体。

硫化氢目前在炎症反应中的作用仍然是矛盾的，体内试验的结果还表明，硫化氢可能既有促炎症效应也同时具有抗炎症效应，如硫化氢离解产物—Na₂S抑制N-甲酰-甲硫氨酰-亮氨酰苯丙氨酸诱导的趋化作用和分叶核白细胞向内皮细胞的黏附作用^[19]。NaHS还可以抑制人类嗜中性粒细胞凋亡^[20-21]。核因子κB是一种具有启动基因转录功能的蛋白质，作为多种基因表达调控的关键性转录因子，是启动多形核白细胞释放大量细胞因子触发炎症反应的关键^[22-23]。研究认为硫化氢可以通过SFKs-NF-κB-ICAM-1通路使MPO活性升高、中性粒细胞移动增加,从而发挥着促炎作用^[24]。生理浓度的硫化氢是体内重要的抗炎介质^[25-26]，硫化氢通过PI3K/AKT-NF-κB通路引起肿瘤坏死因子α、白细胞介素1β表达下降，从而起着抗炎作用^[27]。

在骨关节领域中，Whiteman等^[28]研究发现风湿性关节炎患者关节积液中硫化氢含量显著高于骨性关节炎患者及健康志愿者，且与临床疾病严重度和炎症指标相关，提示内源性硫化氢有可能作为风湿性关节炎病情监测的临床标志物。Chen等^[29]研究表明二稀丙基硫化物产生硫化氢可能在骨性关节炎的发展中保护软骨。Kloesch等^[30]研究表明高浓度的硫化氢会上调类风湿和骨性关节炎患者促炎基因表达。Kloesch等^[31]研究发现硫化氢在免疫病理生理学表现抑制关节蛋白激酶，从而减轻炎症。Williams等^[32]研究表明二稀丙基硫化物可以减轻基质金属蛋白酶的表达，从而保护关节。Lee等^[33]实验研究表明二稀丙基硫化物减轻滑膜和软骨中尿酸钠结晶和白细胞介素1β，从而减轻关节的炎症。Ekundi-Valentim等^[34]研究认为外源性硫化氢能抑制大鼠膝疼痛，肿胀，抑制白细胞介素1β合成，认为硫化氢可潜在的替代消炎化合物，用于治疗关节炎。从既往国外研究看，硫化氢与关节炎的研究都是在体外的实验上，本文首次在动物模型体内研究硫化氢对类风湿性关节炎的影响。

炎症反应中炎症因子扮演重要角色。肿瘤坏死因子a刺激血管内皮细胞，使其通透性增高，促使组织炎性水肿加重，炎性细胞游出增多^[35-37]。肿瘤坏死因子a刺激滑膜细胞与软骨细胞合成前列腺素E2和胶原酶，刺激血管扩张渗出, 加强炎症反应^[38-41]。同时，肿瘤坏死因子a通过促进破骨细胞的溶骨作用，直接造成关节破坏。它还与白细胞介素1β一起，参与各种酶的释放，导致关节软骨的崩解^[42]。白细胞介素1β是具有高活性、多功能的炎性因子，被认为是介导关节软骨破坏最直接的细胞因子^[43]。本实验研究表明类风湿性关节炎症时血清炎症因子明显增高，高浓度硫化氢起促进作用，低浓度硫化氢有减轻作用。

软骨由软骨细胞、基质及胶原纤维构成，胶原主要是Ⅱ型胶原，约占胶原总量的90%^[44]，胶原和聚集蛋白聚糖对维持关节软骨的弹性及硬度具有重要作用^[45]。类风湿关节炎一个最基本的方面是关节软骨和骨被血管翳的侵蚀。所有的这些病理进程都与细胞外基质降解有关，已有的研究显示细胞外基质变性降解与基质金属蛋白酶、组织蛋白酶系统有关^[46-51]。在类风湿关节炎晚期，因为Ⅱ型胶原降解的量多于合成的量，软骨基质中Ⅱ型胶原的总量减少，缺乏Ⅱ型胶原的软骨细胞间基质不能供养软骨细胞而促进其凋亡，使软骨原有的生物力学特性受到明显损害,从而产生关节畸形。本研究发现低浓度的硫化氢减轻关节炎症，并可以减轻软骨的降解，从而保护软骨。

硫化氢对类风湿关节炎症有调节作用，高浓度的硫化氢加重关节炎症并加重软骨降解，低浓度的硫化氢减轻关节炎症并对软骨有保护作用，为临床治疗研究类风湿性关节炎提出了一个新的思路。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

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低浓度硫化氢对类风湿性关节病变的软骨保护

Protective effects of low-concentration hydrogen sulfide on rheumatoid joint disease

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