磷酸钙骨水泥复合骨形态发生蛋白6和血管内皮生长因子修复骨缺损

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2014.08.002

摘要/Abstract

摘要：

背景：单独将骨形态发生蛋白或血管内皮生长因子植入体内易被血液冲刷掉而不能最大限度发挥诱导成骨和血管生成作用，同时缺少载体的支撑作用。
目的：观察骨形态发生蛋白6、血管内皮生长因子及磷酸钙骨水泥联合应用在骨缺损修复过程中的作用。
方法：制作新西兰兔双侧股骨内侧髁骨缺损模型，左侧分别植入磷酸钙骨水泥/骨形态发生蛋白6/血管内皮生长因子、磷酸钙骨水泥/骨形态发生蛋白6及磷酸钙骨水泥，右侧不植入任何物质作为空白对照。植入8，16周通过硬组织切片组织学观察、电镜扫描等手段观察新骨形成情况。
结果与结论：各组材料的组织相容性良好，未见明显炎症组织反应。植入8周时，磷酸钙骨水泥/骨形态发生蛋白6/血管内皮生长因子组骨水泥-骨组织交界处基本上被新生骨小梁包绕，材料进一步降解，新生骨小梁表面可见大量活跃的成骨细胞；16周时，新生骨小梁继续长入，进一步增长、增粗、增多，有大量新生编织骨成网格状长入材料中，骨水泥材料降解明显，与周围组织结合紧密，降解与骨长入同步，此组不同时间点成骨速度及成骨效果均明显优于其他两组材料(P < 0.05)。表明3种材料联合应用可协同促进骨缺损修复。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

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关键词: 生物材料, 骨生物材料, 磷酸钙骨水泥, 骨形态发生蛋白6, 血管内皮生长因子, 骨缺损

Abstract:

BACKGROUND: Implantation of bone morphogenetic protein (BMP) or vascular endothelial growth factor (VEGF) alone, without support vectors, is easy to be flushed away by the blood flow, and thus limits the osteogenesis and angiogenesis.
OBJECTIVE: To observe the effects of combination of calcium phosphate cement (CPC), BMP-6/VEGF in bone defect repair.
METHODS: Defect models of the bilateral medial femoral condyle were prepared in New Zealand white rabbits. Then, the medial femoral condyle was filled with CPC/BMP-6/VEGF, CPC/BMP-6, and CPC, respectively, in the left side, but nothing in the right side as control. After 8 and 16 weeks of implantation, the hard tissue slices were prepared for histological observation and scanning electron microscope observation.
RESULTS AND CONCLUSION: All three kinds of materials showed good biocompatibility, and no obvious inflammation was found. After 8 weeks of implantation, the junction of the CPC/BMP-6/VEGF and bone tissue was almost completely covered by newly formed trabecular bone. With the development of cement degradation, abundant osteoblasts could be found in the surface of newborn trabecular bone. After 16 weeks of implantation, an ongoing cement degradation and bone formation was seen. Moreover, newly formed bone tissue increased and became thicker. The cement in the interface was separated into small pieces and closely interconnected with the surrounding tissues, and newly formed bone showed a mesh-like ingrowth into the cement. This newly formed bone was mature and could not be distinguished from the original trabecular bone. Both the degradation and osteogenesis of CPC and CPC/BMP-6 were much slower than that of CPC/BMP-6/VEGF (P < 0.05). This study demonstrates angiogenesis and osteogenesis in vivo through the additive effects of VEGF and BMP-6. CPC/BMP-6/VEGF can be an ideal bone substitute in bone repair.

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

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Key words: biocompatible materials, calcium phosphates, bone morphogenetic protein 6, vascular endothelial growth factors

中图分类号:

R318

廖红兴，刘展亮，邹学农. 磷酸钙骨水泥复合骨形态发生蛋白6和血管内皮生长因子修复骨缺损[J]. 中国组织工程研究, 2014, 18(8): 1155-1160.

Liao Hong-xing, Liu Zhan-liang, Zou Xue-nong. Effect of calcium phosphate cement/bone morphogenetic protein 6/vascular endothelial growth factor in bone defect repair[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2014, 18(8): 1155-1160.

图/表（结果） 2

2.1 实验动物及大体标本分析骨水泥植入后，新西兰兔术后一般健康状况良好，未出现动物死亡情况，无术后植骨段骨折情况出现，术后伤口愈合良好，局部无红肿、窦道形成，无异常分泌物形成，除1只动物出现肢体活动障碍外，其余新西兰兔术后经过48-72 h恢复后可正常行走。

2.2 组织学观察结果见图1。

术后硬组织切片光镜下观察，骨水泥填充于骨缺损部位，骨水泥无明显破裂、移位情况，与周围骨组织结合良好。各组动物在愈合过程中对骨水泥的反应无明显差异，在骨缺损部位未发现明显的炎症反应细胞。骨水泥降解程度及新骨长入情况在各时间点不断改变，并且在各组骨水泥之间存在明显差异性。

植入8周：联合组骨水泥-骨组织交界处基本上被新生的骨小梁包绕，材料进一步降解，边缘部分骨水泥疏松，降解形成空隙结构并有新生骨小梁长入，将边缘部分材料分隔成小块。新生骨小梁表面可见大量活跃的成骨细胞 (图1A)；骨形态发生蛋白组于材料边缘可见少量的骨基质形成及新生骨小梁，范围较局限，骨水泥降解及新骨形成均不如联合组明显，骨小梁周边未见成骨细胞(图1C)；磷酸钙骨水泥组在材料边缘未见明显新生骨小梁形成，可见少量骨基质形成，周边磷酸钙材料密度较中央部分疏松 (图1E)；空白对照组只在骨缺损周边可见少量成骨细胞，无明显新骨形成(图1G)。

植入16周：联合组可见新生骨小梁继续长入，进一步增长、增粗、增多，有大量新生编织骨成网格状长入材料中，磷酸钙材料被分隔包绕成小块。材料的降解并不局限于边缘部分，材料中央骨小梁也可见材料降解后产生的空隙。材料降解明显，但跟组织仍然紧密结合，降解与骨长入同步。此时，经过塑形后的新生骨小梁与材料相互交织在一起，形成具有承重作用的新生骨小梁 (图1B)；骨形态发生蛋白组可见新生骨小梁增多，但其数量较联合组少，骨小梁周边细胞生长活跃，新生骨与材料之间结合较为疏松，材料中央部分骨小梁长入少，材料降解较少(图1D)；磷酸钙骨水泥组仍残留大部分骨水泥，材料降解缓慢，骨小梁生长较少，范围较为局限 (图1F)。空白对照组骨缺损依然清晰存在，骨缺损壁骨化增强形成一个骨隧道，未见明显的新生骨小梁形成，髓腔内容物散落在骨缺损空腔内(图1H)，说明骨缺损并无自己愈合的能力。

2.3 扫描电镜观察结果植入8周时，联合组植入材料变疏松，骨水泥-骨组织交界处可见新生骨小梁长入，边缘部分材料疏松，降解形成空隙结构并有新生骨小梁长入 (图2A)。在联合组植入16周后，随着骨水泥进一步降解，骨水泥密度明显降低，新生骨小梁长入材料中，将骨水泥分割成小块，加速骨水泥的降解，同时新生骨小梁相互连接形成网格状与残余骨水泥牢固结合在一起，形成生物学铆定。随着骨小梁周边骨水泥的进一步降解，骨组织的进一步形成，骨小梁增长、增粗，从而取代骨水泥填充于骨缺损部位，达到骨缺损的愈合(图2B)。

2.4 骨形态学计量分析结果植入8周时，联合组、骨形态发生蛋白组及磷酸钙骨水泥组骨组织含量分别为 (31.7±2.7)%，(22.8±5.2)%，(11.3±3.7)%。3组两两比较发现，联合组明显高于骨形态发生蛋白组(F=6.619， P < 0.01)、磷酸钙骨水泥组(F=14.135，P=0)，骨形态发生蛋白组明显高于磷酸钙骨水泥组(F=4.405，P < 0.05)。

植入16周时，联合组、骨形态发生蛋白组及磷酸钙骨水泥组骨组织含量分别为(50.5±7.9)%，(32.3±3.5)%，(19.2±5.1)%。3组两两比较发现，联合组明显高于骨形态发生蛋白组(F=7.422，P < 0.01)、磷酸钙骨水泥组(F=20.153，P=0)，骨形态发生蛋白组要明显高于磷酸钙骨水泥组(F=9.436，P < 0.05)。

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引言

生理或病理状态下，各种原因引起的骨缺损是骨科临床上需面临的一个棘手问题。如何解决骨缺损区域的血运重建困难和骨组织的修复障碍，是提高磷酸钙骨水泥临床应用价值的一个关键问题。血管内皮生长因子和骨形态发生蛋白分别以其高效的血管形成和成骨活性受到众多学者的青睐。单独将骨形态发生蛋白或血管内皮生长因子植入体内易被血液冲刷掉而不能最大限度地发挥诱导成骨和血管生成作用，同时由于缺少载体的支撑作用，骨形态发生蛋白、血管内皮生长因子也不易放置^[1]。近年来，磷酸钙骨水泥作为一种重要的骨组织替代和修复材料，已被广泛应用于口腔及骨科手术，且磷酸钙骨水泥可作为活性蛋白因子的载体，其价值逐渐受到重视^[2-5]。

孙明林等^[2]研究制备磷酸钙骨水泥/骨形态发生蛋白复合人工骨，通过动物实验研究其对骨缺损的修复作用及相关问题，探讨临床应用的可能性。参考有关文献方法合成磷酸钙骨水泥，并将其作为骨形态发生蛋白的载体制成磷酸钙骨水泥/骨形态发生蛋白复合物，植入兔桡骨15 mm骨缺损处，术后不同时间处死动物。通过生物力学测定、组织学染色分析、电镜扫描及X射线电子能谱分析、X射线摄片、无机质含量测定及骨密度测量等手段观察新骨形成和材料降解情况；同时以单纯的磷酸钙骨水泥及空白组作为对照，综合评价磷酸钙骨水泥/骨形态发生蛋白对骨缺损的修复能力及对机体的影响。术后磷酸钙骨水泥/骨形态发生蛋白和磷酸钙骨水泥两组动物均无毒性反应。随着时间的延长，血清中碱性磷酸酶浓度逐渐升高，尤以磷酸钙骨水泥/骨形态发生蛋白组显著，提示磷酸钙骨水泥/骨形态发生蛋白复合物和单纯的磷酸钙骨水泥均可以促进新骨形成，前者新骨形成量大，骨修复能力明显好于后者。磷酸钙骨水泥/骨形态发生蛋白植入2周时可见大量间充质细胞分化，在材料与骨端之间出现一层软骨细胞，4周时软骨细胞向编织骨分化，16周时板层骨长入材料并与之相互分割包裹，24周时骨缺损初步修复，新骨密度明显高于磷酸钙骨水泥组，说明骨形态发生蛋白的加入不仅有效促进了新骨的形成，同时也加速了新骨的钙化；24周时标本生物力学测定结果表明，磷酸钙骨水泥/骨形态发生蛋白组力学指标接近正常，与磷酸钙骨水泥组相比差异有显著性意义；无机质含量测定结果表明，新骨形成的同时伴随材料的降解，磷酸钙骨水泥组材料降解速度缓慢，磷酸钙骨水泥/骨形态发生蛋白组降解速度优于磷酸钙骨水泥组，但24周时仍有部分材料残存。在新骨形成和材料降解过程中可出现血清钙浓度的一过性升高，证实磷酸钙骨水泥是骨形态发生蛋白的理想载体，磷酸钙骨水泥/骨形态发生蛋白生物活性人工骨对骨缺损有较强的修复能力。

实验采用复合骨形态发生蛋白6及血管内皮生长因子的磷酸钙骨水泥，通过动物实验观察骨缺损修复情况，评价血管内皮生长因子和骨形态发生蛋白6在治疗骨缺损中的疗效及其作用机制，为进一步临床实验提供实验依据

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材料方法

设计：随机对照动物实验。

时间及地点：于2012年8月至2013年12月在中山大学附属第一医院骨科研究所完成。

材料：

实验动物：选取健康成年新西兰兔24只，雌雄各半，平均体质量3.0 kg，无体表病损，骨骺已闭合，由中山大学北校区动物实验中心提供。

将新西兰兔随机分为联合组、骨形态发生蛋白组及磷酸钙骨水泥组，分别在骨缺损处植入磷酸钙骨水泥/骨形态发生蛋白6/血管内皮生长因子、磷酸钙骨水泥/骨形态发生蛋白6及磷酸钙骨水泥，每组各8只，每只新西兰兔右侧骨缺损用于填充各组材料，左侧不做干预作为空白对照，综合评价。

复合磷酸钙骨水泥修复骨缺损实验的主要材料与仪器：
材料与仪器	来源
骨形态发生蛋白6、血管内皮生长因子、磷酸钙骨水泥	上海瑞邦生物材料有限公司
DK-600型电热恒温水槽	上海精宏实验设备有限公司
STRONG-90电动磨抛光电动工具	韩国世新
Leica DM 2500硬组织切片机、Leica DM 2500B正立显微镜	德国徕卡仪器有限公司
QUANTA 200	荷兰FEI公司
扫描电镜(QUANTA 200)	中山大学中山医学院科技楼

实验方法：

复合人工骨的制备：将骨形态发生蛋白6和血管内皮生长因子冻干粉溶解于磷酸钙骨水泥液相中，采用液固复合的方法分别制成磷酸钙骨水泥/骨形态发生蛋白6、磷酸钙骨水泥/骨形态发生蛋白6/血管内皮生长因子复合物，磷酸钙骨水泥、骨形态发生蛋白6及血管内皮生长因子质量比约为1 g∶25 mg∶25 mg。于动物手术过程中将上述复合物调和成糊状，用于植入骨缺损部位。

兔股骨内侧髁骨缺损模型的建立及材料植入^[6-7]：以3%戊巴比妥钠静脉麻醉后，将新西兰兔取仰卧位固定，术区常规备皮、消毒，充分显露股骨内侧髁部位，首先沿右侧髌骨内缘切开皮肤及皮下，剥离骨膜后显露股骨内髁。于股骨远侧干骺端距髌股关节面和膝关节面0.5 cm处为钻孔点，以直径4.5 mm钻头自内向外、垂直于股骨长轴钻通骨质，深约1.5 cm。生理盐水冲尽骨屑后拭干。将各组材料与生理盐水按2∶1的粉液比调配，放入5 mL注射器中，待骨水泥呈黏浆状时，将骨水泥以回退方式注入到骨缺损内直至注满整个骨缺损区域，指压10 min使其在骨缺损部位完全填充及凝固至一定程度，避免髓腔出血使骨水泥溃散。骨道内人工骨凝固后清除其溢出物，逐层缝合关闭切口。对侧(左侧)钻孔方式相同，但不加干预直接缝合后作为空白对照。术后动物自由活动不用外固定，肌肉注射青霉素40×10⁴ U+庆大霉素8×10⁴ U/d预防感染，连续3 d。术后新西兰兔统一于中山大学北校区动物实验中心饲养。

光镜标本的制备^[8]：各组于植入后第8，16周分别取3只新西兰兔取材。截取双侧股骨远端骨组织(右侧实验侧，左侧对照侧)，剔净软组织后以体积分数10%缓冲甲醛溶液中固定48 h，流水冲洗，体积分数70%，80%，90%，95%，100%乙醇上行逐级脱水，二甲苯透明，MMA包埋。用硬组织切片机沿股骨纵轴方向将标本切成10 μm薄片，60 ℃电热恒温干燥箱烘干2 d，苏木精和伊红分别染色后，Leica DM 2500B正立显微镜下观察骨水泥的组织学改变。

扫描电镜标本的制备：联合组于植入后第8，16周各取1只新西兰兔取材，对经固定后的股骨内侧髁纵形剖开，修整成合适大小(3 mm×8 mm×8 mm)后磷酸缓冲液逐级浸泡，乙醇逐级脱水，临界点干燥，真空喷金，扫描电镜下观察骨-复合材料界面的组织学改变。

骨形态学计量分析：分别拍摄3组骨组织切片数码图片，拍摄区域为植入材料边缘的新长入骨组织，尽量不包括正常的骨皮质。按每组动物随机抽取5幅图片以图文处理软件ImageProPluS5.1进行处理，对目标区域新长入骨组织行RGB-HSI色彩模式转换后(尽量不包括正常骨组织)，进行图像的分割、二值化，以及二值图之间的加减运算，目标二值图的参数测量等处理，求得术后骨组织切片中骨组织含量百分比。

主要观察指标：新型骨水泥在动物体内的降解及新骨长入方式。

统计学分析：术后骨组织切片中骨组织含量百分比数据采用x(_)±s表示，由第一作者采用统计软件SPSS 11.0对测得的参数做统计学分析，采用单因素方差分析，P < 0.05为差异有显著性意义。

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讨论

缺损区的血运重建和新骨组织长入是骨缺损修复的重要环节^[9-10]。因此，现阶段如何应用各类生长因子提高各种材料的成骨潜能及血管生成能力，促进骨缺损区域内血运恢复与促进新骨形成是研究的重点。血管内皮生长因子和骨形态发生蛋白分别以其高效的血管形成和成骨活性受到众多学者的青睐。

骨形态发生蛋白是能够单独诱导骨组织形成的局部生长因子，具有修复骨折损伤部位及牙齿内部骨组织的能力，是近年来防治股骨头坏死研究的热点，且部分成果已被广泛应用于临床。在迄今发现的20多种骨形态发生蛋白成员中，骨形态发生蛋白2，骨形态发生蛋白4，骨形态发生蛋白6，骨形态发生蛋白7，骨形态发生蛋白9在成骨方面的作用较为重要。

Kang等^[11]用重组腺病毒表达14种骨形态发生蛋白，对比14种骨形态发生蛋白基因诱导干细胞的成骨作用强弱，骨形态发生蛋白9的成骨作用最强，骨形态发生蛋白2、骨形态发生蛋白7次之。由于对骨形态发生蛋白2、骨形态发生蛋白4和骨形态发生蛋白7在骨创伤及其修复中的作用研究得较为深入，目前骨形态发生蛋白2和骨形态发生蛋白7已进入临床试验阶段^[12-13]。同时研究人员发现将骨形态发生蛋白转导的成骨前体细胞或重组腺病毒注射入无胸腺小鼠的股四头肌内时，骨形态发生蛋白6和骨形态发生蛋白9可更为有效诱导骨形成。由于骨形态发生蛋白9对血管内皮生长因子的血管生成作用具有抑制作用^[14]，从而限制了它的进一步研究。因此有必要对骨形态发生蛋白6做更深入的研究。在骨缺损修复过程中血管生成是最基本的生理过程。

新生血管形成可能与多种生长因子诱导有关，包括碱性成纤维细胞生长因子、转化生长因子β、骨形态发生蛋白和血管内皮生长因子等。血管内皮生长因子是最主要的血管生成因子之一，它主要作用于血管内皮细胞，促进内皮细胞分裂增殖及血管形成。血管内皮生长因子的优势在于既可刺激血管形成又可促进骨的形成和改建。另外，多数骨诱导因子促进骨修复可能是通过刺激血管内皮生长因子的产生来实现的，血管内皮生长因子不但通过促血管生成作用在骨的发生中扮演了重要的角色，它还通过促进骨转换，抑制软骨细胞和成骨细胞的凋亡而影响骨发生^[15]。研究表明，血管内皮生长因子具有成骨细胞及破骨细胞趋化作用，可直接作用于成骨细胞，促进成骨细胞分化、增殖，促进新骨形成及修复，在骨组织修复重建过程起到非常重要的作用^[16]。有研究将血管内皮生长因子真核表达质粒pCD hVEGF 165 200 μg与胶原混合植入坏死的兔股骨头内，术后2，4周用免疫组化SABC方法检测血管内皮生长因子表达情况，组织形态学分析术后2，4周修复区血管生成情况及术后6，8周股骨头新骨形成情况。术后2周免疫组织化学证实基因转染组股骨头内有血管内皮生长因子表达，组织形态学检测发现术后2，4周转染基因的股骨头内血管生长快于对照组，术后4，8周转染基因股骨头新骨形成多于对照组，差异均有显著性意义(P < 0.01)。提示利用血管内皮生长因子基因转染刺激坏死骨组织内血管再生，可促进坏死骨修复。

联合应用骨形态发生蛋白及血管内皮生长因子在骨组织修复过程中的作用，比单纯应用骨形态发生蛋白或血管内皮生长因子的作用更大，最新的治疗思路是联合血管内皮生长因子和成骨因子骨形态发生蛋白治疗大块骨缺损。研究表明，联合应用血管内皮生长因子和骨形态发生蛋白2或骨形态发生蛋白4对新骨形成具有协同作用^[17-20]。且目前的研究证据对于联合应用血管内皮生长因子和骨形态发生蛋白在骨组织修复方面的研究，主要集中在骨形态发生蛋白2和骨形态发生蛋白4上，针对骨形态发生蛋白6的研究却鲜有报道。

实验将磷酸钙作为载体制备含骨形态发生蛋白6及血管内皮生长因子的复合磷酸钙骨水泥材料。通过动物实验发现，在不同的时期骨水泥均与骨组织紧密结合，交界部位无明显的间隙存在，骨水泥降解的同时新骨形成活跃，从骨缺损边缘部分开始呈网格状长入材料中，降解与骨长入协调同步，通过新生骨组织的改建塑形，与周围骨组织达到生物结合，形成具有承重作用的正常骨组织，替代了填充在骨缺损部位的骨水泥。

单纯磷酸钙骨水泥材料经过16周后仍残留大部分骨水泥，材料降解缓慢，骨小梁生长较少，范围较为局限。骨形态发生蛋白组可见新生骨小梁增多，骨小梁周边细胞生长活跃，说明骨形态发生蛋白6可以很大程度上增加磷酸钙骨水泥材料的成骨潜能，促进骨组织的生长，但材料中央部分骨小梁长入仍然较少，材料降解较少。骨修复材料的降解和新骨长入是相辅相成的，必须同步材料才可起到骨组织修复最大的作用，并且降解的过程中还能起到部分承重作用。经过组织学观察发现磷酸钙骨水泥/骨形态发生蛋白6/血管内皮生长因子材料随着时间的推移，磷酸钙骨水泥的降解要明显快于其他两组，血管内皮生长因子的促血管生成作用在骨发生中扮演了重要角色，加速材料中体液循环，从而提高降解速率，同时新生骨小梁继续长入，进一步增长、增粗、增多，有大量新生编织骨呈网格状长入材料中，磷酸钙材料被分隔包绕成小块。材料的降解并不局限于边缘部分，材料中央骨小梁也可见材料降解后产生的空隙。材料降解明显，但跟组织仍然紧密结合，降解与骨长入同步。此时，经过塑形后的新生骨小梁与材料相互交织在一起，形成具有承重作用的新生骨小梁。血管内皮生长因子不但具有促血管生成作用，还具有成骨细胞及破骨细胞趋化作用，可直接作用于成骨细胞，促进成骨细胞分化、增殖而促进新骨形成及修复，在骨组织修复重建过程起到非常重要的作用。进一步的骨形态计量学分析表明，磷酸钙骨水泥/骨形态发生蛋白6/血管内皮生长因子材料植入兔股骨内侧髁后骨组织含量最高，为(50.5±7.9)%，要显著高于其他两组材料。因此，与其他两组材料相比较发现，联合应用骨形态发生蛋白6及血管内皮生长因子对新骨形成具有协同作用，可明显提高材料的降解效率和骨传导性，具有进一步深入研究的价值及临床应用的广阔前景。

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单纯磷酸钙骨水泥材料经过16周后仍残留大部分骨水泥，材料降解缓慢，骨小梁生长较少，范围较为局限。骨形态发生蛋白组可见新生骨小梁增多，骨小梁周边细胞生长活跃，说明骨形态发生蛋白6可以很大程度上增加磷酸钙骨水泥材料的成骨潜能，促进骨组织的生长，但材料中央部分骨小梁长入仍然较少，材料降解较少。骨修复材料的降解和新骨长入是相辅相成的，必须同步材料起到骨组织修复最大的作用，并且降解的过程中还能起到部分承重作用。经过组织学观察发现磷酸钙骨水泥/骨形态发生蛋白6/血管内皮生长因子材料随着时间的推移，磷酸钙骨水泥的降解要明显快于其他两组，血管内皮生长因子的促血管生成作用在骨发生中扮演了重要角色，加速材料中体液循环，从而提高降解速率，同时新生骨小梁继续长入，进一步增长、增粗、增多，有大量新生编织骨成网格状长入材料中，磷酸钙材料被分隔包绕成小块。材料的降解并不局限于边缘部分，材料中央骨小梁也可见材料降解后产生的空隙。材料降解明显，但跟组织仍然紧密结合，降解与骨长入同步。此时，经过塑形后的新生骨小梁与材料相互交织在一起，形成具有承重作用的新生骨小梁。血管内皮生长因子不但具有促血管生成作用，还具有成骨细胞及破骨细胞趋化作用，可直接作用于成骨细胞，促进成骨细胞分化、增殖而促进新骨形成及修复，在骨组织修复重建过程起到非常重要的作用。进一步的骨形态计量学分析表明，磷酸钙骨水泥/骨形态发生蛋白6/血管内皮生长因子材料植入兔股骨内侧髁后骨组织含量最高，为（50.5±7.9）％，要显著高于其他两组材料。因此，与其他两组材料相比较发现，联合应用骨形态发生蛋白6及血管内皮生长因子对新骨形成具有协同作用，可明显提高材料的降解效率和骨传导性，具有进一步深入研究的价值及临床应用的广阔前景。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

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