医用TH胶栓塞建立月骨缺血性坏死兔模型

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2014.05.002

中国组织工程研究 ›› 2014, Vol. 18 ›› Issue (5): 663-668.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.2014.05.002

• 器官移植动物模型 organ transplantation and animal model • 上一篇下一篇

医用TH胶栓塞建立月骨缺血性坏死兔模型

路云翔，陈郁鲜，庄泽，任建华，彭优，史德海，王昆，李智勇

中山大学附属第三医院关节外科、创伤骨科，广东省广州市 510630

修回日期:2014-01-02 出版日期:2014-01-29 发布日期:2014-01-29
通讯作者: 李智勇，博士，副主任医师，副教授，硕士生导师，中山大学附属第三医院关节外科、创伤骨科，广东省广州市 510630
作者简介:路云翔，男，1986年生，河南省商丘市人，汉族，中山大学在读硕士，主要从事显微外科、创伤骨科的诊治工作。
基金资助:
广东省医学科学基金项目(A2012173)，课题名称：骨髓间充质干细胞复合生物材料治疗月骨无菌性坏死

Medical TH adhesive embolism for establishing a rabbit model of ischemic necrosis of lunate bone

Lu Yun-xiang, Chen Yu-xian, Zhuang Ze, Ren Jian-hua, Peng You, Shi De-hai, Wang Kun, Li Zhi-yong

Department of Joint Surgery and Orthopedic Trauma, the Third Affiliated Hospital of Sun Yat-sen University, Guangzhou 510630, Guangdong Province, China

Revised:2014-01-02 Online:2014-01-29 Published:2014-01-29
Contact: Li Zhi-yong, M.D., Associate chief physician, Associate professor, Master’s supervisor, Department of Joint Surgery and Orthopedic Trauma, the Third Affiliated Hospital of Sun Yat-sen University, Guangzhou 510630, Guangdong Province, China
About author:Lu Yun-xiang, Studying for master’s degree, Department of Joint Surgery and Orthopedic Trauma, the Third Affiliated Hospital of Sun Yat-sen University, Guangzhou 510630, Guangdong Province, China
Supported by:
the Guangdong Provincial Medical Science Foundation in China, No. A2012173

摘要/Abstract

摘要：

背景：目前缺乏与人类月骨缺血性坏死病理过程类似的Kienböck病动物模型。

目的：采用医用TH胶栓塞法建立一种新型月骨缺血坏死兔模型，并探讨造模方法的合理性。

方法：选择健康成年新西兰兔30只，雌雄不限。采用自身对照方法随机分为实验侧和对照侧，实验侧采用月骨中心钻孔，注射医用TH胶0.2 mL，反复注药3次；对照侧月骨中心钻孔注射同等量的生理盐水。于实验4，8，12周行X射线、大体观察、Micro-CT 骨计量学及组织病理学检测。

结果与结论：大体标本、X射线及组织学检测结果可见实验侧造模后8周月骨出现缺血坏死表现，12周月骨缺血坏死更为典型。Micro-CT 骨小梁微观参数中，实验侧骨小梁密度参数骨体积分数及骨小梁数量均明显低于对照侧(P < 0.05)；骨小梁空间参数明显增高，其中实验侧骨小梁离度及结构模型指数明显高于对照侧。提示注射医用TH胶栓塞后8周实验侧出现月骨缺血坏死表现，注药后12周可建立月骨缺血坏死兔模型，可以实现在周围组织无明显损伤情况下出现月骨内血运受损、骨小梁骨折、空骨陷窝等与人类月骨坏死类似的改变。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：肾移植；肝移植；移植；心脏移植；组织移植；皮肤移植；皮瓣移植；血管移植；器官移植；组织工程

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关键词: 实验动物, 组织构建, Kienböck病, 月骨, 动物模型, TH胶, 骨小梁, Micro-CT, X射线

Abstract:

BACKGROUND: Kienböck disease lacks of suitable animal models, which are similar to the pathological process of avascular necrosis of human lunate bone.

OBJECTIVE: To establish a new animal model of Kienböck disease using medical TH adhesive embolism and to explore the rationality of model establishment.

METHODS:A total of 30 healthy adult New Zealand rabbits, male or female, were selected. Using self-control method, the rabbits were randomly assigned to experimental sides and control sides. By drilling in the center of the lunate bone, 0.2 mL of medical TH glue was injected three times. An equal volume of physiological saline was injected into the center of the lunate bone on the control side. X-ray examination, general observation, Micro-CT measurement of bone, and tissue pathology detection were conducted at 4, 8 and 12 weeks.

RESULTS AND CONCLUSION:Gross specimen, X-ray and histological results showed that ischemic necrosis of the lunate bone on the experimental side was visible at 8 weeks after model induction. The ischemic necrosis of the lunate bone became more typical at 12 weeks. Among the Micro-CT microscopic parameters of trabecular bone, trabecular bone density parameters bone volume fraction and the number of trabecular bone were significantly lower on the experimental side than those on the control side (P < 0.05). Spatial parameters of trabecular bone significantly increased. Trabecular separation and structure model index on the experimental side were significantly greater than those on the control side. Results suggested that ischemic necrosis of the lunate bone appeared on the experimental side at 8 weeks after injection of medical TH glue. Rabbit models of ischemic necrosis of the lunate bone can be established at 12 weeks. Thus, alterations, which were similar to ischemic necrosis of human lunate bone, appeared, such as blood transportation damage in the lunate bone, trabecular bone fracture, and empty lacuna, when surrounding tissues were not obviously injured.

中国组织工程研究杂志出版内容重点：肾移植；肝移植；移植；心脏移植；组织移植；皮肤移植；皮瓣移植；血管移植；器官移植；组织工程

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Key words: models, animal, lunate bone, osteonecrosis, histology

中图分类号:

R318

路云翔，陈郁鲜，庄泽，任建华，彭优，史德海，王昆，李智勇. 医用TH胶栓塞建立月骨缺血性坏死兔模型[J]. 中国组织工程研究, 2014, 18(5): 663-668.

Lu Yun-xiang, Chen Yu-xian, Zhuang Ze, Ren Jian-hua, Peng You, Shi De-hai, Wang Kun, Li Zhi-yong. Medical TH adhesive embolism for establishing a rabbit model of ischemic necrosis of lunate bone[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2014, 18(5): 663-668.

图/表（结果） 4

2.1 实验动物数量分析 实验共纳入30只新西兰兔，全部进入结果分析，无脱失。

2.2 X射线检查 注药后双腕关节平片显示，造模后4周实验侧与对照侧比较，未见明显差异；造模后8，12周实验侧相对于对照侧月骨密度增高；其中造模后12周实验侧月骨密度明显增高，透光度不均，在关节面下方骨小梁结构紊乱(图1)。

2.3 Micro-CT检查 Micro-CT三维重建图可见，12周实验侧月骨与对照侧相比骨小梁密度明显减低，月骨内骨小梁厚度不均，排列紊乱，并可见多处骨小梁骨折，月骨高度变低，月骨密度分布不均(图2)。造模后12周形成月骨三维兴趣区域并进行计算分析骨小梁参数，实验侧和对照侧骨体积分数、骨表面积体积比、骨小梁数量、骨小梁离度、骨小梁厚度、骨小梁模型因子、结构模型指数差异均有显著性意义，而骨小梁厚度和各向异性程度差异无显著性意义(P均 < 0.05，表1)。

2.4 标本大体观察 造模后4周无明显差异；造模后8周月骨表面失去光泽，软骨部分失去半透明性状，颜色淡黄色；12周时实验侧软骨组织部分区域可见软骨表面黑色坏死组织，出现月骨明显的变形，并合并明显软骨退变，部分月骨较健侧明显变小。对照组各时间点月骨均呈正常形态，软骨面完整，未见破坏及缺损。
2.5 组织学检查 苏木精-伊红染色结果示，各时间点对照侧月骨显示关节软骨表面平滑，骨陷窝内骨细胞填充，骨髓内大量细胞存在；实验侧造模后12周病理改变主要集中于软骨下区，骨小梁较对照侧稀疏，骨小梁中骨细胞减少，骨小梁有中断现象，空缺骨陷窝增多，镜下计数空虚的骨陷窝率>50%，细胞排列不规则(图3)。

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引言

月骨缺血性坏死又称Kienböck病，以进展性，破坏性的病理过程，导致患者腕部慢性疼痛及功能障碍的一种疾病^[1-2]。目前早期临床治疗方式主要有月骨髓心减压，桡骨短缩，晚期治疗包括带血管蒂的豌豆骨移植或远端桡骨移植，但疗效均不太满意，往往进一步发展至塌陷或已存在的塌陷进一步加重，最终不得不行近排腕骨切除或全关节融合^[3-8]。各种手术治疗方式均是以一种创伤治疗另一种创伤的替代治疗，并不是针对其病因及病理变化的特异性治疗方式。虽然认识该病已有百年，但其发病机制仍不明确^[3-9]，许多学者在该病研究进展中相继提出了各种致病学说，而血管学说是月骨缺血性坏死病因研究中争论的热点^[10-11]，其中有学者提出静脉淤血学说，认为月骨是一个极易损伤静脉的腕骨，腕关节内月骨微骨折、滑膜炎、腕关节活动时不可避免的持续而复杂的腕内压变化，均会使处于腕关节中特殊位置的月骨挤压在桡骨和头状骨之间，使月骨内的循环受阻，或滑膜营养受损，中断月骨静脉回流，继而引起骨内压力增高，进一步加重月骨内部坍陷，形成月骨缺血、坏死的恶性循环，最终引起局限性的骨坏死^[12]。Pichler等^[13]研究就发现月骨存在纤细的掌背侧的骨膜静脉丛，但覆盖面积相对于半月形的月骨偏小，脆弱的静脉回流在全身性因素或局部压力下很容易形成“骨内筋膜室综合征”。Schiltenwolf等^[14]研究Kienböck病患者的骨内压特点时发现腕背伸时月骨骨内压明显增高，患者组可增加12.2 kPa，正常组仅为5.4 kPa，进一步支持了静脉回流的破坏在月骨坏死中起着重要的作用。但是不管何种因素是本病的首要致病病因，缺血性坏死是本病的病理基础。为了探讨月骨缺血性坏死的机制，首先需要建立与人类月骨缺血性坏死病理过程及解剖结构类似的动物模型，而目前查阅国内外相关文献发现此动物模型的制作方法很少，主要有犬舟月骨的液氮冷冻法、兔月骨摘除法等^[15-18]，文献中报道的这些方式多会破坏月骨周围正常组织，坏死范围大，且不同动物的一致性较差，或者解剖结构与人的腕关节相去甚远，无法满足进一步的治疗研究。

医用TH胶(α-氰基丙烯酸酯)在临床中常被运用于静脉血管栓塞^[19-20]，其在血管中聚合时产热和产生的化学性刺激，使血管壁遭受破坏，随着时间的延长，纤维组织增生并突入管腔，逐渐将医用TH胶分隔代替，管腔机化达到永久栓塞的目的。

所以实验拟针对其致病因素采用医用TH胶栓塞法建立兔月骨缺血性坏死的动物模型，并进行探讨此方法的可行性。

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材料方法

设计：随机对照动物实验。

时间及地点：于2012年11月至2013年3月在中山大学动物实验中心和中山大学附属第一医院骨科研究所完成。

材料：

实验动物：3月龄新西兰大白兔30只，体质量 1.8-2.2 kg，雌雄不限，由广东省医学实验动物中心提供，实验动物质量合格许可证号：SCXK(粤)2008-0002，使用许可证号：SYXK(粤)2008-0002，质量合格证明编号：4407209690。实验动物喂养委托给中山大学实验动物中心。

方法：

分组及造模：健康成年新西兰大白兔 30 只，每只新西兰兔双腕随机分为实验侧和对照侧，用戊巴比妥钠在兔耳缘静脉注射麻醉后，实验侧常规消毒铺巾，沿桡腕关节背侧入路S形切口，显露腕关节背侧，T形切开关节囊并辨认显露月骨背侧，用5 mL注射器针头在月骨背侧中心钻孔，钻孔深度2-5 mm，注射医用TH胶0.2 mL后，等候 5 min，再次注药，以上过程重复3次，总注药量0.5 mL左右。缝合关节囊韧带和皮肤。术后每只兔肌注青霉素G 钠80×10⁴ U/d，连续用3 d，常规饲料喂养，对照侧注射同等剂量的生理盐水。分别于4，8，12周3个时间点随机处死兔各10只。各组动物在实验过程中均无死亡及伤口感染表现，患肢造模后1周左右均可负重。

放射学检查：造模后未见感染迹象及异常死亡。术后每天观察日常饮食及步态，术后4，8，12周进行双侧肘关节离断，并将标本于体积分数4%甲醛溶液中固定24 h后，行X射线检查，并将腕关节进行Micro-CT扫描(ZKKS-MCT-Sharp)，扫描分辨率为20 μm，单次扫描时间20 min。

Micro-CT扫描：将前臂远端固定于标本模具上进行腕关节Micro-CT扫描(扫描电压：60 kV，电流：600 μA)。利用Micro-CT系统配套软件(3D Med 4.1)对扫描数据行三维骨结构重建及月骨冠状面、矢状面二维图像进行分析。首先对月骨骨性结构行三维重建^[21]。利用软件的三维旋转功能显示月骨Micro-CT冠状面并手动选取所有包含月骨坏死灶的区域，计算月骨骨体积分数、骨表面积体积比、骨小梁数量、骨小梁离度、骨小梁厚度、骨小梁模型因子、结构模型指数、各向异性程度。

月骨大体标本：分别于上述不同时间点处死的实验动物；逐层分离前臂皮肤肌肉，尤其是腕关节周围附着的肌肉，切开腕关节囊，显露舟月骨，沿舟月之间的软骨组织分离出月骨。拍摄月骨大体形态后将标本浸泡于10% EDTA-Na中脱钙。

组织学检查：所有实验动物标本在进行Micro-CT检测后，浸泡于40 g/L多聚甲醛中24 h，转入10%EDTA-Na中脱钙3周，然后进行程序脱水机石蜡包埋，制成5 μm厚石蜡切片，经过二甲苯及梯度乙醇脱蜡后经行苏木精-伊红染色^[22]、常规脱水透明封固后于光学显微镜下观察。

主要观察指标：处理后的月骨组织坏死情况及骨小梁定量指标的改变。

统计学分析：由第二作者采用SPSS 19.0(IBM SPSS Statistic 19.0)统计软件对所有实验数据进行统计学分析，实验侧与对照侧骨小梁参数比较采用t 检验，P < 0.05为差异有显著性意义。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：肾移植；肝移植；移植；心脏移植；组织移植；皮肤移植；皮瓣移植；血管移植；器官移植；组织工程

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讨论

建立理想的Kienböck病模型，是研究该病病因及发病机制十分重要的手段，也是进行临床治疗的基础和理论依据。在Kienböck病动物模型制作方面，Ogawa等^[15]将日本兔第四跗骨取出后浸泡于液氮中诱导骨坏死，解冻后回植于兔背部的皮下，以此作为Kienböck病的动物模型； Shigematsu等^[16]采用月骨摘除法；Ikeguchi等^[17]则将犬的舟月骨中的松质骨尽可能的取出，然后往洞穴中加入液氮，反复冷冻后制作模型。这些实验模型的制作手段多会破坏月骨周围组织，且坏死范围大，不同的动物的一致性较差，不能很好模拟Kienböck病的自然病理过程。

本实验在不破坏月骨周围正常解剖结构的基础上采用月骨内直接注射医用TH胶，达到月骨缺血坏死的目的。该方法最初应用于股骨头骨骺的缺血性坏死(Perthes病)动物模型的制作，可达到兔股骨头缺血性坏死的目的^[23]。其原理是：通过其局部聚合胶接，压闭毛细血管，部分经小静脉回流的TH胶在血管内快速固化，形成微小栓子，从而使静脉回流受阻。由于骨的密闭特征，当静脉回流受阻时，骨内压升高，进一步加重静脉淤滞，类似于骨内筋膜室综合征，形成恶性循环，最终导致骨坏死发生。动物模型动物选择方面，为了更好的模拟Kienböck病月骨坏死的病理过程，要考虑到实验动物腕关节的解剖结构与人类的相似度。新西兰兔的腕关节是负重关节，有八块腕骨组成的由近排到远排的复杂的整体。具有自身的稳定性和活动度，活动度与关节囊周围韧带结构以及每一块腕骨软骨层的相互接触有关，这与人类的腕关节解剖结构相似^[24]。

根据改良的Lichtman分期法^[25-26]，将Kienböck病分为4期：Ⅰ期，腕关节可有疼痛乏力、运动受限等，X射线片检查多无异常发现，MR可有不均匀的信号降低；Ⅱ期，腕骨密度增大，但体积、形状以及与相邻骨骼的解剖关系无明显改变；Ⅲ期，月骨出现塌陷，Ⅲa期月骨硬化，但位置和对应关系正常，舟桡角<60°，Ⅲb期舟腕骨间关节间隙变宽，舟骨掌屈，舟桡角>60°，三角骨尺侧偏移；Ⅳ期，月骨塌陷碎裂，头状骨近侧移位，腕骨间关节出现退行性骨性关节炎，关节面粗糙不平，关节间隙变窄，骨赘形成，骨骼硬化和囊变。平片是临床中该疾病分期、治疗和疗效评估的基础，本实验中术后X射线显示4周两侧无明显差异，8周实验侧月骨密度稍增高，说明X射线对于诊断早期月骨坏死性病变敏感性低，Micro-CT在8周时已有一定程度的骨小梁断裂，骨量的减少，术后第12周实验侧X射线上月骨表现出高密度改变，月骨高度降低，骺线模糊，但未见骨骺碎裂现象，仅在大体标本见到月骨表面不光滑，软骨组织成片灶状隆起及缺损，部分大体标本可见月骨体积变小。但术后12周实验侧Micro-CT骨小梁断裂及骨量的丢失更加明显^[27]。所以本实验不足之处在于对早期月骨坏死病变的判断依据MR可能更加敏感。

病理学表现实验组术后4，8周与对照侧无明显差别，但术后12周修复进程较前减慢，不能修复坏死月骨。因此，从大体标本、X射线及组织学检测三方面结果可见术后8周月骨出现缺血表现，12周的月骨缺血坏死更为典型。

为了观察月骨坏死显微结构的改变，作者采用Micro-CT检测的方法进行骨结构定量分析^[28-30]。骨小梁结构是骨量在三维空间的分布形式，因此Micro-CT的定量分析能够对骨强度做出更精确的预测^[31]，与以二维切片为基础的组织学技术相比，Micro-CT技术的优势在于不损坏样本结构。早在1989年Feldkamp等^[32]就应用Micro-CT对离体骨小梁的三维结构进行了检查。Han等^[33]利用Micro-CT研究月骨骨小梁的微结构时认为Kienböck病患者中月骨的骨小梁的机械应力下降、退变、塌陷，出现骨小梁微骨折，同时存在新骨形成。Calder等^[34]发现骨质量由局部骨细胞的坏死决定。目前在Micro-CT技术中用来评价骨微观结构的主要参数有：骨体积分数、骨表面积体积比、骨小梁数量、骨小梁离度、骨小梁厚度、骨小梁模型因子、结构模型指数、各向异性程度^[35-37]。本实验以离体新西兰兔月骨样本为研究对象，采用Micro-CT检查获取骨样本的系列二维图像，随后随机选取骨坏死区域对骨坏死样本的骨小梁结构进行分析，结果表明，实验侧术后12周月骨骨小梁密度的参数减小(骨体积分数、骨小梁数量)，骨小梁空间参数增加(骨小梁离度、结构模型指数)，而骨小梁厚度、及各向异性程度差异无显著性意义。本实验结果中骨小梁密度参数及空间参数的改变与其他学者在股骨头坏死模型的检测结构类似^[38]。从月骨骨小梁的微结构层面显示术后实验侧12周时表现出月骨缺血坏死的表现。本组实验侧的骨小梁厚度，各向异性程度较正常区域差异不存在显著性意义，可能与本文的样本量不够有关。骨体积分数、骨小梁数量反映骨的强度，其数值的降低表明月骨坏死区骨质的力学强度显著降低。结构模型指数代表着骨的机械特点，在实验组月骨中明显增加，也就预示着骨小梁更趋向于杆状，而杆状结构为较低的机械压力^[39-40]。基于以上研究结果，医用TH胶栓塞能够诱导骨小梁结构的改变，骨小梁的内部空间的结构改变导致Kienböck病月骨的血运破坏。

综上，文章采用注射医用TH胶的方法建立兔月骨缺血坏死模型，可以实现在周围组织无明显损伤情况下，出现月骨内血运受损、骨小梁骨折、空骨陷窝等与人类月骨坏死类似的改变，可为月骨缺血坏死治疗以及预防方法的比较和验证建立良好的平台。

医用TH胶栓塞建立月骨缺血性坏死兔模型

Medical TH adhesive embolism for establishing a rabbit model of ischemic necrosis of lunate bone

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