碱性成纤维细胞生长因子缓释体系诱导脂肪移植体早期血运重建

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2013.44.015

摘要/Abstract

摘要：

背景：脂肪移植吸收及其不可预测性直接影响该技术的临床应用，利用各种细胞因子来促进脂肪移植体早期血运重建，从而减少移植体吸收的技术在目前也有待提高。效果不稳定在于这些细胞因子在术后随血液和渗出液的流失而不能在较长时间内有效作用于血管内皮细胞。
目的：探讨碱性成纤维细胞生长因子与葡聚糖颗粒形成缓释体对脂肪移植体早期血运重建的影响。
方法：制备2 mg/L的碱性成纤维细胞生长因子溶液及其同浓度的碱性成纤维细胞生长因子-葡聚糖缓释颗粒。SD大鼠12只取腹股沟脂肪行自体脂肪移植，左侧背部皮下植入脂肪珠加入重组型碱性成纤维细胞生长因子溶液(对照组)，右侧背部皮下植入脂肪珠加碱性成纤维细胞生长因子-葡聚糖缓释颗粒(缓释组)，在7，14 d随机方法处死动物各1只，用墨汁灌注微血管显像法观察移植体内部和包膜血管早期生成密度。移植后90 d，将剩余大鼠处死，取移植体测量体积。
结果与结论：在植入后7，14 d，包膜和移植体内血管计数缓释组均高于对照组(P < 0.01)。90 d后缓释组移植体的体积大于对照组(P < 0.05)。碱性成纤维细胞生长因子缓释体可以更好地促进脂肪移植体早期血运重建。实验结果说明，碱性成纤维细胞生长因子缓释体有利于减少术后脂肪移植体的吸收。

关键词: 器官移植, 组织移植, 脂肪移植, 碱性成纤维细胞生长因子, 缓释, 脂肪珠移植, 葡聚糖颗粒, 缓释体系, 微血管显像

Abstract:

BACKGROUND: The resorption and unprediction of fat transplantation directly influence the clinical application. The technology of reducing graft resorption by using various cytokines to promote early revascularization of fat transplantation needs to be improved. But the effect is not stable, as the cytokines losing with the bleeding and exudation thus cannot long-term affect the vascular endothelial cells.
OBJECTIVE: To investigate the effect of alkaline recombinant basic fibroblast growth factor-dextran formed sustained-release system on the early revascularization of fat grafts.
METHODS: The recombinant basic fibroblast growth factor solution 2 mg/L and basic fibroblast growth factor-dextran sustained-release granules were prepared. The fat tissues were selected from the inguinal region of 12 Sprague-Dawley rats for fat transplantation. The left backs of the rats were treated with subcutaneously injection of fat pearl plus recombinant basic fibroblast growth factor solution (control group), and the right backs of rats were treated with subcutaneously injection of fat pearl plus basic fibroblast growth factor-dextran sustained-release granules (sustained-release system group). At 7 and 14 days after treatment, one rat in each group was sacrificed randomly, then ink perfusion microvascular imaging was used to observe the inside of the graft and the density of early formed coated vessels. At 90 days after transplantation, the rest rats were sacrificed, and the grafts were obtained to measure the volume.
RESULTS AND CONCLUSION: At 7 and 14 days after transplantation, the number of vessels in the capsule and grafts of the sustained-release system group was higher than that in the control group (P < 0.01). At 90 days after transplantation, the volume of grafts in the sustained-release system groups was bigger than that in the control group (P < 0.05). The recombinant basic fibroblast growth factor-dextran delivery system could better promote the early revascularization of fat grafts. The experimental results suggest that recombinant basic fibroblast growth factor-dextran sustained-release system can help to reduce the absorption of fat grafts after surgery.

Key words: organ transplantation, tissue transplantation, subcutaneous fat, adipose tissue, fibroblast growth factors

中图分类号:

R318

靳元嵘，杨瑟飞. 碱性成纤维细胞生长因子缓释体系诱导脂肪移植体早期血运重建[J]. 中国组织工程研究, 2013, 17(44): 7745-7750.

Jin Yuan-rong, Yang Se-fei. Early revascularization of fat grafts conducted by basic fibroblast growth factor sustained-release system[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2013, 17(44): 7745-7750.

图/表（结果） 3

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引言

材料方法

设计：动物实验，自身对照观察。

时间及地点：2012年3至6月在河北农业大学实验室完成。

材料：

动物来源：雌性SD大鼠16只，平均鼠龄2个月，体质量严格选取，介于248-252 g，由河北农业大学实验动物中心提供，许可证号：SCXK(冀)2008-1-003。实验过程中对动物的处置符合动物伦理学标准。

主要试剂：葡聚糖颗粒(Dextran particles)：直径40-120 µm，由Sigma公司提供，商品名(Cephadex)，无菌瓶分装，消毒后备用。碱性成纤维细胞生长因子：冻干粉剂，6 µg/支，河北农业大学生命科学院提供。

实验方法：

制备碱性成纤维细胞生长因子-葡聚糖缓释颗粒：根据国内外学者的研究提示，将碱性成纤维细胞生长因子稀释成浓度为2 mg/L的生理盐水溶液，将该溶液滴注葡聚糖颗粒，使之膨胀至停止，成为湿沙状，即制成碱性成纤维细胞生长因子-葡聚糖缓释颗粒。同法制取生理盐水葡聚糖颗粒备实验用。

脂肪移植模型的建立：实验用16只SD大鼠，1%戊巴比妥纳按45 mg/kg行腹腔注射，麻醉生效后，腹部取脂区，背部受植区备皮。切取双侧腹股沟皮下脂肪5 mL左右，制成脂肪颗粒清洗后分为2 mL等量的2份，多余的脂肪弃之，其中1份以2 mg/L的碱性成纤维细胞生长因子溶液处理后植入左侧背部皮下，植入完成后在植入体内再加0.3 mL生理盐水葡聚糖颗粒，设为对照组。另一份加入0.3 mL 碱性成纤维细胞生长因子-葡聚糖缓释颗粒，植入背部右侧皮下，设为缓释组。缝合皮肤，术毕。

移植体内组织学观察：分别于移植后7，14 d随机选取动物各一，在麻醉下进行颈外动脉插管至左心室，固定之。从插管内注入肝素生理盐水0.5 mL后，剪开胸骨，暴露心脏，剪断上下腔静脉，并以肝素生理盐水从插管内灌注，直到血液完全由肝素生理盐水置换，改灌注中国墨汁至全身皮肤呈黑色，上下腔静脉流出墨汁。后将鼠置于体积分数10%甲醛中浸泡，每日更换甲醛至澄明，取出标本，从背部正中切开皮肤并翻转，观察两侧移植体染色的差异，拍照记录。再将标本完整分离，并将标本切成两半，其一半去除脂肪保留包膜，经梯度乙醇脱水，二甲苯浸泡使透明，在显微镜下观察包膜血管构筑情况。另一部分不染色做组织切片，观察脂肪组织内血循重建情况，每个标本选取非连续的10张切片，在高倍视野(×400)下，同一张切片选取5个视野行血管计数，求得该切片的均值作为血管密度值，10张切片的均数即为该移植体的血管密度。

在90 d处死余下动物，取出背部移植体，以排液法测量体积，并做统计学处理。

主要观察指标：移植后早期包膜微血管显像观察，移植体内部实验和对照组血管密度，移植终体积对照观察。

统计学分析：采用SPSS 10.0统计学软件进行，分析缓释组与对照组的样本均数差异，用t 检验，检测水准为P=0.05，P > 0.05认为两样本均数差异没有显著性意义，P < 0.05认为均数差异有显著性意义。

讨论

目前保留脂肪移植后体积研究主要核心还是在血运重建，表现在利用细胞/干细胞，细胞因子，和/或组织工程手段达到血运最佳重建。从细胞方面来看，国内外学者比较关注的是高活性的血管基质细胞对脂肪移植体体积保存的作用^[15-20] 。血管基质细胞在脂肪移植中，通过其本身及在缺氧的环境中诱导的巨噬细胞的活化而释放系列血管再生因子促进血运重建。血管基质细胞辅助治疗术已应用于临床治疗^[17-20] ，国内南方医科大学整形科做了有代表性的工作^[18-19] 。作者这次实验与之相比，还是处于试验初步阶段，有大量的基础工作需要开展，在未来希望实验提出的因子缓释技术在该领域有一席之地。从干细胞来看，学者主要关注脂肪来源干细胞。
脂肪来源干细胞可以释放碱性成纤维细胞生长因子和血管内皮生长因子，最终也是强化新生血管的再生，从而得到更好的体积保留^[21-26] 。这些研究与本研究所用的碱性成纤维细胞生长因子效应吻合。此外，经血管内皮生长因子165转染的骨髓间充质干细胞也可以促进移植脂肪的早期血运重建^[27-28] 。细胞组织工程技术也可以重建血运，使组织(包括但不限于脂肪组织)再生，这一课题已涉及到再生医学，远远超出本研究的探讨范围^[29] 。应该提到的是，美国有学者提出了血管内皮生长因子微球释放技术来促进实验鼠移植脂肪组织血运的重建^[30] ，该研究就与作者提出的方法很接近，不同的是微球材料不同，微球释放的因子不同，提法不同(微球技术microsphere technigue，葡聚糖缓释颗粒dextran delivery system)。说明这一领域发展到这个时期，可能很多学者会不约而同地想到类似的技术。值得大家共同关注。
在各种形式的脂肪移植中，小的脂肪珠注射移植在口腔颌面部具有极强的优势，特别是局部小的软组织凹陷，这种凹陷不可能，也不适以血管吻合脂肪移植形式来充填，但无血管的吻合又极易造成脂肪移植的吸收，如何解决脂肪移植体的吸收一直是国内外学者探讨的课题^[31-32] 。邓颖等^[33]探索胰岛素对大鼠移植脂肪内微血管形成的作用，实验将48只SD大鼠随机分成胰岛素组和对照组，从大鼠输卵管旁取出1 mL脂肪组织，制成脂肪颗粒移植到大鼠背部，建立颗粒脂肪移植模型。胰岛素组在移植前将脂肪颗粒放入胰岛素中预处理；对照组对移植脂肪组织不施加处理因素，观测移植脂肪细胞变化和微血管生长情况，实验结果显示胰岛素组移植体内有成熟脂肪细胞，细胞体积变小，部分脂肪细胞有破裂萎缩现象，细胞间有纤维组织增生，胰岛素组脂肪细胞周围纤维组织少于对照组。说明胰岛素能促进移植脂肪块内微血管生长，提高移植脂肪的存活率。
事实上，脂肪珠移植就是为了减少移植体吸收而提出来的一种方法，主要考虑脂肪珠体积小，可以早期有利于血循的重建^[34]，但也有学者认为，这种方法因对脂肪的损伤大，反而吸收更严重，无论观点如何，这种移植术在口腔颌面外科的应用是不可或缺的^[35] 。因此，需要利用颌面血循丰富的特点，找到一个方法，使之有利于移植体的早期血运重建，在临床实践中，作者也试图以碱性成纤维细胞生长因子，血管内皮细胞生长因子及血管生成素等不同的生物因子处理脂肪移植体^[36-37] ，以期达到满意的效果，但往往不尽如人意。蒋爱梅等^[38]采集人颗粒脂肪及人脂肪间充质干细胞脂肪间充质干细胞分离、培养、标记，对照组以脂肪间充质干细胞直接与同一患者颗粒脂肪混合。实验组以脂肪间充质干细胞加碱性成纤维细胞生长因子后与同一患者颗粒脂肪混合，各组细胞颗粒脂肪混合物注射移植至裸鼠皮下，6周后检测脂肪形成，形态学及分子生物学方法检测比较两组脂肪标本，结果成功获得脂肪间充质干细胞用于移植实验，在实验组及对照组均形成脂肪组织，新生组织湿质量实验组明显高于对照组(P < 0.01)。Western blot检测结果显示实验组血管内皮生长因子，碱性成纤维细胞生长因子表达均高于对照组。说明脂肪
间充质干细胞结合碱性成纤维细胞生长因子辅助颗粒脂肪移植，通过改善脂肪间充质干细胞存活、增殖及移植组织血运，提高了移植脂肪存活率。在临床工作中，作者也体会到，这些因子，在实验模型研究领域具有有很好的生物效应，但由于术区出血，术后渗出，和因子本身就是液体的，极易流失，在临床实践中不可能持续发挥作用，因此，设想用一种载体，使细胞因子不会在短时间内大量流失，并以缓释的方式持续作用于移植体，使早期血管吻合，形成大量的血管网，减少吸收，这是本实验的核心，从实验结果看，在移植后7 d，缓释组的血管密度远高于对照组，提示碱性成纤维细胞生长因子缓释体处理的脂肪移植体比常规的碱性成纤维细胞生长因子处理移植体具有更高密度的血管网，移植后14 d，两组的血管密度均比第7天高，但缓释组的血管密度比对照组要高，可见缓释的效应得到了发挥。而90 d后，缓释组保留的移植体体积远高于对照组，说明早期血循的重建有助于移植后减少移植体体积的吸收。但对于缓释体系的缓释方式，缓释颗粒作用的范围，及缓释浓度与终体积的疗效关系，在此次实验中还没来得及研究，这写方面尚需下一步的工作^[39-40] 。
目前有文献显示，碱性成纤维细胞生长因子可以激活脂肪组织中的前脂细胞，使之转化为成熟的脂肪细胞^[41-42] 。后续的研究也想在这方面做些工作，形成研究系列，以探讨保留脂肪移植体体积的最优方法，为脂肪移植在口腔颌面外科和整形外科的应用起到抛砖引玉的作用。

文章快阅

延伸阅读

已发表文章：Chung CW, Marra KG, Li H, Leung AS, Ward DH, Tan H, Kelmendi-Doko A, Rubin JP VEGF microsphere technology to enhance vascularization in fat grafting.Ann Plast Surg. 2012 Aug;69(2):213-219.
主要观察指标：移植组织血管化，组织存活。
结论：该研究采用微球技术释放VEGF以促进脂肪移植体的血管再生，最大保证了移植体体积。在我的研究立题时查新未发现类似的技术，我以为只有我想到了这个方法，不曾想美国的同行也想到了，而且在2012年8月公开了这一技术，但两篇文章的材料不同。如果不能尽早发表，可能有很多类似的文章即将面世。就显得中国的同行在这方面更落后了。

已发表文章：Dong Z, Fu R, Liu L, Lu F. Stromal vascular fraction (SVF) cells enhance long-term survival of autologous fat grafting through the facilitation of M2 macrophages. Cell Biol Int. 2013 Mar 22. doi: 10.1002/cbin.10099. [Epub ahead of print]
主要观察指标：新生血管移植体体积积，巨噬细胞数量等指标
结论：尽管使用技术不同，促使血运早期重建是最重要的因素。

已发表文章：Chang L, Wang J, Zheng D, Zhang B, Fan Q, Zhu C, Yu L. Improvement of the Survival of Autologous Free-Fat Transplants in Rats Using Vascular Endothelial Growth Factor 165-Transfected Bone Mesenchymal Stem Cells. Ann Plast Surg. 2013 Mar 28. [Epub ahead of print]
主要观察指标：新生毛细血管计数移植体体积积，脂肪细胞坏死率，移植体纤维化率。
结论：使用VEGF165转染骨髓间充质干细胞，促进血管再生，减少脂肪坏死和移植体纤维化，与本作者的研究有异曲同工之妙。

已发表文章：Yuan Y, Gao J, Liu L, Lu F. Role of adipose-derived stem cells in enhancing angiogenesis early after aspirated fat transplantation: induction or differentiation? Cell Biol Int. 2013 Feb 13. doi: 10.1002/cbin.10068. [Epub ahead of print]
主要观察指标：血管内皮细胞生长因子，碱性成纤维细胞生长因子，新生血管等指标
结论：本研究应用脂肪细胞来源的干细胞（ASCs）作为脂肪移植的手段，认为ASCs可以促发血管内皮细胞生长因子，碱性成纤维细胞生长因子等不同的细胞因子分泌，而这些因子是促进新生血管发生的细胞因子，通过这种方式保留了较大移植体体积。这篇文章和我的一样，非常关注碱性成纤维细胞生长因子在血管再生中的作用。

已发表文章：Li J, Gao J, Cha P, Chang Q, Liao Y, Liu C, Li K, Lu F. Supplementing fat grafts with adipose stromal cells for cosmetic facial contouring. Dermatol Surg. 2013 Mar;39(3 Pt 1):449-56. doi: 10.1111/dsu.12058. Epub 2012 Dec 28.
主要观察指标：CT测量，术前，后摄影，
结论：高活性血管基质细胞辅助细胞治疗术（Stromal vascular fraction (SVF)-assisted cell therapy）已应用于临床颌面部脂肪注射移植术，并取得良好效果，而本研究还在实验室初步阶段，有大量工作需要做。