脂肪干细胞与可吸收明胶海绵的组织相容性

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2013.40.005

摘要/Abstract

摘要：

背景：在骨组织工程中寻找优良的种子细胞和支架材料非常重要。目前尚未见脂肪干细胞与可吸收明胶海绵在体外进行复合培养的相关报道。
目的：诱导脂肪干细胞成骨细胞后，观察其在可吸收明胶海绵上的黏附、增殖情况以及两者的生物相容性，以期为可吸收明胶海绵作为脂肪干细胞的有效载体进行体内移植提供实验基础。
方法：体外培养脂肪干细胞，通过免疫组织化学及流式细胞术对其进行鉴定。取第3代脂肪干细胞对其成骨诱导分化，将其接种于多聚赖氨酸处理后的可吸收明胶海绵，进行扫描电镜观察，观察其在明胶海绵上的黏附、生长情况。
结果与结论：兔脂肪干细胞48 h内呈圆形、椭圆形贴壁生长，以后逐渐呈长梭形贴壁生长，阳性表达CD29、CD44，阴性表达CD33、CD34。在加入成骨诱导液培养3 d后，脂肪干细胞可诱导为成骨细胞，将诱导后的成骨细胞与可吸收明胶海绵复合培养，24 h可见85%以上已黏附生长，48 h见成骨细胞伸出伪足，7 d见成骨细胞已呈片状黏附生长并分泌大量细胞基质，10 d可见可吸收明胶海绵已开始吸收、降解。提示脂肪干细胞与可吸收明胶海绵具有良好的组织相容性，可吸收明胶海绵可以作为脂肪干细胞的生物载体。

关键词: 干细胞, 脂肪干细胞, 成骨细胞, 支架材料, 可吸收明胶海绵, 生物相容性, 生物材料, 扫描电镜, 生物载体, 组织工程, 干细胞图片文章

Abstract:

BACKGROUND: It is particularly important to search favorable scaffolds and seed cells in bone tissue engineering. However, no existing studies have reported the co-culture of adipose-derived stem cells and absorbable gelatin sponge.
OBJECTIVE: To induce rabbit adipose-derived stem cells to osteoblasts, observe the adhesion, proliferation and biological characteristics of adipose-derived stem cells on absorbable gelatin sponge, and to provide experimental base for absorbable gelatin sponge as an effective carrier of fat stem cells transplantation in vivo.
METHODS: Adipose-derived stem cells were cultured in vitro and identified with immunohistochemistry and flow cytometry. The passage 3 adipose-derived stem cells were induced to differentiate into osteoblasts and then seeded onto absorbable gelatin sponge after treatment with polylysine. The adhesion and proliferation of adipose-derived stem cells on scaffolds were observed under scanning electron microscope.
RESULTS AND CONCLUSION: The rabbit adipose-derived stem cells were mainly round and oval shaped at 48 hours, and became long spindle shaped after 48 hours. Adipose-derived stem cells were positive for CD29 and CD44, and negative for CD33 and CD34. Adipose-derived stem cells can be induced to differentiate into osteoblasts after culture in the osteogenesis induced fluid for 72 hours. The induced osteoblasts that were co-cultured with absorbable gelatin sponge had an 85% adherence rate at 24 hours. The cells began to extend pseudopodium at 48 hours, and osteoblasts adhered in clumps and secreted a large amount of cell matrix at 7 days. Absorbable gelatin sponge began to absorb and degrade. Experimental findings indicate that, adipose-derived stem cells have good histocompatibility with absorbable gelatin sponge, and absorbable gelatin sponge can be used as a biological carrier of adipose-derived stem cells.

Key words: stem cells, osteoblasts, stents, gelatin sponge, absorbable, biocompatible materials

中图分类号:

R394.2

张巍，张元和. 脂肪干细胞与可吸收明胶海绵的组织相容性[J]. 中国组织工程研究, 2013, 17(40): 7047-7053.

Zhang Wei, Zhang Yuan-he. Histocompatibility of adipose-derived stem cells and absorbable gelatin sponge[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2013, 17(40): 7047-7053.

图/表（结果） 7

2.1 脂肪干细胞的形态学观察结果 原代脂肪干细胞可见细胞成圆形，培养24 h可见细胞开始贴壁生长，逐渐伸出伪足黏附于培养瓶底^[21]，见细胞成圆形、椭圆形，直径可达5 μm。培养48 h后见大量细胞贴壁生长，细胞呈短梭形，见图1，直径可达15-20 μm，细胞呈集落样生长。培养5 d原代细胞见大量红细胞、脂肪细胞，通过二三次换液，细胞逐渐纯化^[22]，见图2。原代细胞培养7-9 d可见细胞铺满瓶底90%，以10⁷ L^-¹浓度进行传代培养，细胞经三四天铺满瓶底90%，脂肪干细胞经10-15代培养，未见明显老化现象^[23]。

2.2 脂肪干细胞的鉴定结果见图3-7。

成骨、成脂细胞倒置相差显微镜下观察，脂肪干细胞在成骨诱导液中培养3 d后，细胞逐渐由长梭形变成椭圆形、多角形等不规则形状，体积明显增大，随着诱导时间延长，细胞周围基质可见钙盐沉积，培养3周可见细胞呈现多层生长现象，经茜素红染色可见红色钙结节，见图3，Von kossa染色证实细胞周围基质大量钙盐沉积。

在成脂诱导液培养1周后，倒置相差显微镜下见细胞由长梭形变为椭圆形，细胞内开始出现脂滴，2周后见多数细胞内充满脂滴，培养液表面见漂浮少量小脂滴。

流式细胞术检测细胞表面抗体结果可见，与干细胞相关的抗体CD29、CD44均高表达，而与造血细胞相关的CD33、CD34均低表达，见图4-7，证实所取得细胞确为脂肪来源干细胞。

2.3 细胞生长曲线的绘制 实验组分别于复合培养后每日进行MTT检测，见细胞曲线呈S形，培养前48 h细胞生长较慢，第3天细胞进入对数生长期，于第5天细胞达到缓慢生长期，第5-9天无明显上升，说明细胞基本长满96孔板；对照组细胞生长曲线与实验组相似，见图8，说明明胶海绵与脂肪干细胞具有良好的生物相容性。

2.4 可吸收明胶海绵的大体、扫描电镜观察结果 可吸收明胶海绵呈白色，表面较光滑、多孔的三维立体结构，肉眼见可吸收明胶海绵存在许多大孔想通，扫描电镜下见可吸收明胶海绵内部存在许多大小不一的小孔，彼此相通，孔径大小在200-400 μm。

2.5 诱导后脂肪干细胞的显微镜及扫描电镜观察结果见图9-11。

倒置相差显微镜下观察可见诱导后脂肪干细胞接种于可吸收明胶海绵24 h后，细胞聚集于明胶海绵周围，48 h见细胞黏附于明胶海绵表面，但易于脱落。三四天见细胞大量黏附于明胶海绵表面，晃动不易脱落，7 d见细胞包绕大部分明胶海绵。

扫描电镜观察见48 h细胞伸出伪足黏附于明胶海绵表面，见图9；72 h见细胞逐渐成梭形，见图10；7 d见细胞成片黏附，见图11，并可见细胞分泌大量细胞基质。 10 d见可吸收明胶海绵略降解，可见少量碎片。

参考文献

[1]Huang SJ,Fu RH,Shyu WC,et al.Adipose-Derived Stem Cells: Isolation, Characterization and Differentiation Potential,Cell Transplant.2012; [Epub ahead of print]
[2]Zhu Y, Liu T, Song K, et al. Adipose-derived stem cell: a better stem cell than BMSC. Cell Biochem Funct. 2008;6(6):664- 675.
[3]Zuk PA, Zhu M, Mizuno H, et al. Multilineage cells from human adipose tissue:Implication for cell-based therapies. Tissue Eng. 2001;7(2):211-238.
[4]Zuk PA. The Adipose-derived Stem Cell: Looking Back and Looking Ahead. Mol Biol Cell. 2010;21(11): 1783-1787.
[5]Pak J.Autologous adipose tissue-derived stem cells induce persistent bone-like tissue in osteonecrotic femoral heads.Pain Physician. 2012;15(1):75-85.
[6]邓春华,孙祥宙,高勇,等.大鼠脂肪组织来源干细胞的分离、培养和生物学特性的研究[J].中华男科学杂志,2008,14(2):99-105.
[7]Du Y, Roh DS, Funderburgh ML, et al. Adipose-derived stem cells differentiate to keratocytes in vitro. Mol vis.2010;16: 2680-2689.
[8]田霖,孙筱放,刘海波,等.人脂肪干细胞的分离培养与生物学特性[J].中国组织工程研究, 2012,16(32):5946-5952.
[9]Zuk PA, Zhu M, Ashjian P, et al. Human Adipose Tissue Is a Source of Multipotent Stem Cells. Mol Biol Cell. 2002;13:(12): 4279-4295.
[10]鞠晓东,娄思权,田华,等.脂肪间充质干细胞的基本生物学特性及向成骨细胞诱导分化的实验研究[J].中华实验外科杂志, 2004, 21(6):654-656.
[11]李晓峰,赵劲民,苏伟,等.大鼠成骨细胞的原代培养和鉴定[J].中国组织工程研究与临床康复, 2011,15(6):990-994.
[12]殷小雪,陈仲强,郭昭庆,等.人骨髓间充质干细胞定向诱导分化为成骨细胞及其鉴定[J].中国修复重建外科杂志, 2004,18(2): 88-91.
[13]项鹏,张丽蓉,陈振光,等.成人骨髓间质干细胞定向诱导为脂肪细胞的研究[J].中国病理生理杂志,2001,17(7):598-601.
[14]凌宏艳,文格波,胡弼,等.小鼠间充质干细胞诱导分化成脂肪细胞miRNA表达的变化[J].中国应用生理学杂志, 2011,27(4): 391-395.
[15]余方圆,卢世璧,袁玫,等.脂肪干细胞向软骨细胞方向诱导的初步研究[J].中国矫形外科杂志, 2004,5(12):2042-2043.
[16]Yarak S, Okamoto OK. Human adipose-derived stem cells: current challenges and clinical perspectives. An Bras Dermatol. 2010;85(5):647-656.
[17]路坦,李小伟,张江峰,等.多聚赖氨酸对脂肪来源干细胞三维立体条件下生物学特性的影响[J].中国组织工程研究与临床康复, 2011,15(40):7489-7492.
[18]刘彦春,王炜,曹谊林,等.卵磷脂、多聚赖氨酸和PLA包埋PGA与软骨细胞体外培养的实验研究[J].实用美容整形外科杂志,1997, 10(8):225-228.
[19]郝新保,张利朝,殷缨,等.MTT比色法测定细胞生长曲线[J].第四军医大学学报,1997,8(4):390-391.
[20]张云松,高建华,鲁峰,等.Ⅰ型胶原支架材料与人脂肪干细胞体外生物相容性研究[J]. 南方医科大学学报,2007,27(2):223.
[21]聂绪强,陈怀红,唐宁,等.脂肪干细胞的共培养及其分化应用概述[J].生物工程学报, 2011, 27(8):1121-1131.
[22]郭翔,管欣,赵珩,等.脂肪干细胞与三维支架体内外培养构建的组织工程化气管[J].中国组织工程研究, 2012,16(41):7658-7663.
[23]张端珍,盖鲁粤,刘宏伟,等.脂肪干细胞与间充质干细胞体外诱导分化为心肌细胞的差别[J].生理学报,2008,60(3):341-347.
[24]方丽茹,翁文剑,沈鸽,等.骨组织工程支架及生物材料研究[J].生物医学工程学杂志, 2003,20(1):148-152.
[25]Sasai Y,Eiraku M,Suga H,et al.In vitro organogenesis in three dimensions: self-organising stem cells. Development. 2012; 139(22):4111-4121.
[26]燕卫东,吴春华.胚胎干细胞的研究进展[J].赤峰学院学报:自然科学版, 2010,26(2):27-28.
[27]董效信,任晓敏,董雅妮,等.胚胎干细胞研究的伦理和心理学问题[J].中国组织工程研究, 2011,15(49):9303-9306.
[28]邴丽娟,付蓉.间充质干细胞的研究进展[J].临床血液学杂志, 2012, 25(6):750-753.
[29]Baglioni S, Francalanci M, Squecco R, et al. Charaterization of human adult stem-cell populations isolated from visceral and subcutaneous adipose tissue. FASEB J. 2009;23: 3494-3505.
[30]Zuk PA. The adipose-derived stem cell:Looking back and looking ahead. Mol Biol Cell. 2010;21:1783-1787.
[31]韩长杰,杨向群,张传森,等.脂肪干细胞的免疫学性质[J].中国组织工程研究与临床康复, 2010,14(27):5095-5098.
[32]De Ugarte DA, Morizono K, Elbarbary A, et al. Comparison of multi-lineage cells form human adipose tissue and bone marrow. Cells Tissues Organs. 2003;174:101-109.
[33]Qing W, Guang-Xing C, Lin G, et al.The osteogenic study of tissue engineering bone with BMP2 and BMP7 gene-modified rat adipose-derived stem cell. J Biomed Biotechnol.2012; 2012: 410879.
[34]毛天球,陈富林,杨维东,等.骨组织工程的研究进展[J].中国临床康复, 2001,5(16):5-7.
[35]樊国栋,陈佑宁,张光华,等.医用聚乳酸类高分子材料的应用[J].中国组织工程研究与临床康复,2007,11(18):3617-3620.
[36]王彦平,朱凌云,张红梅,等.聚磷酸钙纤维/羟基磷灰石/明胶软骨组织工程支架材料的制备及性能[J].中国组织工程研究, 2012, 16(43):8005-8008.
[37]王新,刘玲蓉,张其清,等.纳米羟基磷灰石-壳聚糖骨组织工程支架的研究[J].中国修复重建外科杂志,2007,21(2):120-124.
[38]郝伟,胡蕴玉,魏义勇,等.脂肪干细胞/Ⅰ型胶原凝胶复合体的构建及其体内外成骨分化研究[J].中华实验外科杂志,2007,24(6): 659-661.
[39]王海燕,苏冠方.可吸收明胶海绵载体与骨髓间充质干细胞的相容性[J].眼科研究, 2009,27(9):743-746.
[40]何艳新,刘超.可吸收材料生物蛋白胶及明胶海绵在肝部分切除的应用[J].中国组织工程研究, 2012;16(12):2180-2182.

引言

材料方法

设计：细胞学水平，体外对比观察实验。

时间及地点：于2011年3月至2012年3月在辽宁医学院骨组织工程研究实验室完成。

材料：

实验动物：7 d龄家兔，雌雄不限，辽宁医学院动物实验中心提供，许可证号：SCXK(辽)2003-0007。实验过程中对动物的处置符合2009年《Ethical issues in animal experimentation》相关动物伦理学标准的条例。

实验方法：

脂肪干细胞的原代培养及扩增^[6-7]：7 d龄家兔，用体积分数75%乙醇浸泡消毒20 min，无菌条件下取其颈背部及腹股沟皮下脂肪，去除肉眼可见筋膜、血管等组织，无菌磷酸盐缓冲液冲洗3遍，将组织剪成1.0 mm× 1.0 mm×1.0 mm组织块，置于脂肪组织2倍体积的 0.75 g/LⅠ型胶原酶中，37 ℃摇床搅拌消化1 h，加入等体积的低糖DMEM中和Ⅰ型胶原酶，200目筛网过滤，以低糖DMEM培养液(含体积分数为10%胎牛血清)重新悬浮、离心(1 000 r/min，5 min)。弃去上层的脂肪细胞、脂滴和液体，沉积的细胞用含体积分数10%胎牛血清的DMEM培养基重新悬浮，以2×10⁴接种于25 cm²细胞培养瓶中，置入37 ℃，体积分数5%CO₂，饱和湿度培养箱中培养，48 h首次换液，去除未贴壁细胞。待细胞达80%-90%汇合时用0.25%胰蛋白酶消化传代，之后每两三天更换培养基1次。

脂肪干细胞的鉴定：分别取第3代脂肪干细胞体外诱导成脂肪、成骨等细胞，以及做流式细胞学检查脂肪干细胞的表面标记抗体^[8]。

成脂、成骨细胞诱导分化：取第3代脂肪干细胞，以10⁵/孔接种6孔板爬片，待细胞完全贴壁，分别更换成脂诱导液^[9](DMEM培养液中含10^-⁶ mol/L地塞米松、胰岛素10 mg/L、0.5 mmol/L 3-异丁基-1-甲基黄嘌呤(IBMX)和0.2 mmol/L吲哚美辛)、成骨诱导液^[10](DMEM培养液中含1.0×10^-⁷ mol/L地塞米松、10 mmol/L β-磷酸甘油钠和50 mg/L左旋维生素C)，每3 d更换培养液1次，培养2周后终止，爬片固定。

诱导脂肪干细胞成骨细胞后鉴定：

茜素红染色^[11]： ①将诱导4周长满细胞的6孔培养板用PBS冲洗2次，体积分数95%乙醇固定10 min，双蒸水反复洗3次。②将0.1%茜素红-Tris-Hcl(pH 8.3)加入培养版中37 ℃孵育30 min。③蒸馏水冲洗。④倒置相差显微镜下观察结果并拍照。

矿化结节染色法^[12](Von Kossa染色)：①细胞爬片后，磷酸盐缓冲液洗涤3遍，体积分数75%乙醇固定10 min，加入3%硝酸银紫外线灯下孵育1 h，蒸馏水冲洗3次，甲苯胺蓝复染5 min，流水冲洗，干燥，中性树胶固定，倒置相差显微镜下观察并拍照。

诱导脂肪干细胞成脂肪细胞油红O染色鉴定^[13]： ①将诱导生长2周的6孔培养版进行油红O染色，弃去培养基，PBS反复冲洗3次，2 min/次。②加入40 g/L多聚甲醛室温下固定1 h，弃固定液，蒸馏水漂洗，每次2 min共3次。③加入60%异丙醇媒染2 min，蒸馏水漂洗。④加入2%油红O染液室温浸染30 min，异丙醇洗去染料，蒸馏水漂洗，倒置相差显微镜下观察结果并拍照^[14]。

流式细胞术鉴定^[3^，^15]：取第3代脂肪干细胞，0.25%胰蛋白酶消化、离心机1 000 r/min离心10 min，重悬细胞，调整细胞浓度，加入非特异性的IgG，封闭可能的Fc受体。按照抗体生产厂家的推荐浓度分别加入抗体CD29，CD33，CD34，CD44^[16]，4 ℃冰箱孵育半小时，用含0.5%牛血清白蛋白的磷酸盐缓冲液冲洗3遍，应用流式细胞仪检测细胞表面抗体。

可吸收明胶海绵的处理^[17]：用多聚赖氨酸对可吸收明胶海绵进行表面修饰可以提高其表面的细胞黏附能力^[18]。将明胶海绵制作成5.0 mm×5.0 mm×4.0 mm大小块状，浸入0.75 mg/L多聚赖氨酸中，双蒸水冲洗3次，用无菌滤纸吸尽水分，烘干箱37 ℃烘干备用。

脂肪干细胞的诱导及黏附：取生长良好的第3代脂肪干细胞，以2×10⁵细胞数接种于6孔板，加入成骨诱导液培养5 d，用0.25%胰蛋白酶充分消化细胞，体积分数10%胎牛血清中和胰蛋白酶，离心机1 000 r/min离心10 min，加入体积分数10%胎牛血清重悬细胞，计数细胞以2×10⁵细胞数接种于多聚赖氨酸包埋的可吸收明胶海绵，37 ℃培养箱培养。

诱导后脂肪干细胞与可吸收明胶海绵的黏附率检测：将诱导后的脂肪干细胞以10⁸ L^-¹接种于可吸收明胶海绵，于接种6 h后将明胶海绵移于另一培养板，计算原培养版中细胞数(A值)，继续培养24 h，轻轻摇晃培养版，取出明胶海绵，计算培养板中细胞数(B值)，随机选取3组计算黏附率。

MTT法绘制细胞生长曲线：将可吸收明胶海绵制作成0.2 cm×0.2 cm大小，放入96孔板中，取长势良好的第3代脂肪干细胞，调整细胞浓度为10⁷ L^-¹，取150 μL加入到96孔培养板中与可吸收明胶海绵复合培养，在复合培养后每日进行MTT检测^[19]，终止细胞培养，每孔加入MTT溶液15 μL，37 ℃孵育4 h，终止培养，弃去上清液，每孔加入150 μL二甲基亚砜，摇床震荡10 min，使结晶物充分溶解，570 nm下酶联免疫分光光度仪检测。以复合生长组作为实验组，以单纯脂肪干细胞生长组为对照组，以时间为横坐标，以吸光度值(A)为纵坐标绘制细胞生长曲线。

脂肪干细胞的扫描电镜观察：将诱导的脂肪干细胞接种后于24，72 h及诱导后7，10 d分别取出明胶海绵做扫描电镜检查，无菌磷酸盐缓冲液冲洗明胶海绵3遍，加入2.5%戊二醛4 ℃冰箱固定过夜，1%饿酸室温固定30 min，无菌磷酸盐缓冲液反复冲洗3遍，逐级梯度乙醇(体积分数50%-100%)脱水，室温下自然干燥，表面喷金后置于扫描电镜下观察^[20]。

主要观察指标：脂肪干细胞的原代培养及鉴定，细胞生长曲线的绘制，脂肪干细胞与可吸收明胶海绵复合培养的扫描电镜观察结果。

讨论

近年来随着组织工程的开展，主要集中在3大要素的选择上，即种子细胞、细胞因子与支架材料^[24] ，而组织工程的基础在于支架材料和种子细胞的选择。在本实验中，采用诱导自脂肪干细胞的成骨细胞与明胶海绵进行体外复合培养。
干细胞是一个种群，具有自我扩增能力、长时间生存能力及多系分化潜能^[25] 。干细胞主要分为胚胎干细胞及成体干细胞来源，尽管胚胎干细胞有巨大潜能^[26] ，但于此同时也有许多道德和政治问题^[27] 。近年对干细胞的研究与应用主要集中在骨髓来源的间充质干细胞，然而骨髓间充质干细胞的应用存在一些问题如取材时疼痛、低细胞数量等^[28] ，这些导致许多研究人员寻找间充质干细胞的替代来源。像骨髓一样，脂肪组织也源于中胚层并且有容易分离的基质，使得脂肪干细胞更易分离。
脂肪干细胞最初发现于2001年^[29] ，经过研究发现脂肪干细胞具有易获取、广泛来源、且对供区影响小，多向分化潜能、多克隆能力，此外其免疫排斥低、不具有伦理道德争议，体外分离培养、纯化容易且不易老化^[30-32] 、具有快速扩增能力等优点，使其能够替代骨髓间充质干细胞，也被用于多种疾病的细胞治疗和基因治疗的载体^[33] 。这次实验取7 d龄家兔颈背部脂肪组织消化后，采用贴壁培养法分离脂肪干细胞，通过三四次传代进行纯化，通过多向诱导分化、流式细胞术鉴定其阳性表达CD29，CD44，以上均与文献报道相似，证实该细胞为脂肪来源干细胞。
目前，用于组织工程的支架材料来源主要有天然生物材料和人工合成材料^[34] 。人工材料主要包括生物活性陶瓷、羟基磷灰石、磷酸三钙、聚乳酸、聚乙醇酸、PLGA共聚物、聚乙烯、聚丙烯、聚氯乙烯以及某些金属材料等。虽然聚乳酸、聚乙醇酸、PLGA共聚物具有良好的生物相容性，但降解率低且降解产物为酸性，具有一定的细胞毒性、以及加速自身降解等缺点^[35] ；羟基磷灰石、磷酸三钙同样具有良好的生物相容性和可降解性^[36] ，但其具有难塑形、难加工、价格较昂贵等缺点^[37] ；而聚丙烯、聚乙烯、聚氯乙烯不具有降解性，具有较强毒副作用。天然生物材料主要包括胶原、几丁质、葡聚糖、硫酸软骨素、纤维蛋白凝胶、珊瑚、灭活动物骨等；胶原属于细胞结构蛋白，广泛存在于组织器官中^[38] ，使其具有良好的生物相容性、适宜的降解性等。
本实验采用可吸收明胶海绵，其具有以下优点：①良好的生物形容性，具有良好的可降解性，降解产物为天然胶原，降解产物有利于成骨细胞复合、生长^[39] 。②具备三维立体结构，实验中经扫描电镜观察具有良好的孔隙率(97%)、孔隙大小均匀(200-400 μm)、良好的空隙交通性等。③广泛应用于外科止血、栓塞，不引起局部明显的异物刺激反应^[40] 。④来源广泛、价钱较低，应用方便。在生物力学方面，其机械强度较差、但其在软组织、非负重区修复等方面具备天然优越性。
作者将脂肪干细胞诱导成骨细胞后种植于经多聚赖氨酸处理后的可吸收明胶海绵上，在体外进行三维立体培养，使成骨细胞在载体上复合、增殖、成熟，通过倒置显微镜和扫描电镜下观察了载体以及复合成骨细胞生长情况及细胞学行为。细胞在种植于材料表面后，生长状态良好，在培养条件稳定时，细胞可以快速进行增殖、迁移。经观察复合后24 h细胞伸出伪足黏附与明胶海绵表面，48 h逐渐移向可吸收明胶海绵深层，7 d可见细胞包被整个可吸收明胶海绵，10 d可见可吸收明胶海绵已出现降解现象。
MTT法常用于细胞增殖、细胞生长抑制情况的检测，其机制是活细胞中的琥珀酸脱氢酶可使MTT分解产生蓝色结晶，其量与活细胞数成正比、也与细胞活力成正比。在实验中，细胞与材料复合后，可吸收明胶海绵与脂肪干细胞复合后无抑制生长现象、无明显细胞毒性作用，实验组与对照组细胞数差异无显著性意义(P > 0.05)，说明脂肪干细胞能够在可吸收明胶海绵上黏附、增殖，具有良好的生物形容性。
本实验结果证明，脂肪干细胞能够在可吸收明胶海绵表面进行附着、生长、增殖，具备良好的细胞界面，有良好的生物相容性，为进一步体内移植修复骨坏死提供基础实验依据。