变形链球菌gcp基因敲除菌株表达谱基因芯片

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2013.33.014

中国组织工程研究

• 组织构建细胞学实验 cytology experiments in tissue construction • 上一篇下一篇

变形链球菌gcp基因敲除菌株表达谱基因芯片

谢苗苗¹，胡晓聪²，吴补领¹，闫文娟¹

1南方医科大学南方医院口腔科，广东省广州市 510515；2 深圳市宝安区人民医院口腔科，广东省深圳市 518101

收稿日期:2012-03-05 修回日期:2012-04-06 出版日期:2013-08-13 发布日期:2013-08-13
通讯作者: 吴补领,主任医师，院长，主任，博士生导师，南方医科大学南方医院，南方医科大学口腔医学院，广东省广州市 510515 wubuling@yahoo.com.cn 并列通讯作者：闫文娟，博士，副教授，南方医科大学南方医院，南方医科大学口腔医学院，广东省广州市 510515 ywj918@sohu.com
作者简介:谢苗苗☆，女，1982年生，汉族，山东省青岛市人，南方医科大学在读博士，主要从事口腔内科方向的研究。 medabc@163.com。
基金资助:
国家自然科学基金(81100747)。

Streptococcus mutans gcp gene knockout strains expression profile gene chip

Xie Miao-miao¹, Hu Xiao-cong², Wu Bu-ling¹, Yan Wen-juan¹

1Department of Stomatology, Nanfang Hospital of Southern Medical University, Guangzhou 510515, Guangdong Province, China; 2Department of Stomatology, Baoan District People’s Hospital of Shenzhen, Shenzhen 518101, Guangdong Province, China

Received:2012-03-05 Revised:2012-04-06 Online:2013-08-13 Published:2013-08-13
Contact: Wu Bu-ling, Chief physician, Doctoral supervisor, Department of Stomatology, Nanfang Hospital of Southern Medical University, Guangzhou 510515, Guangdong Province, China wubuling@yahoo.com.cn Yan Wen-juan, M.D., Associate professor, Department of Stomatology, Nanfang Hospital of Southern Medical University, Guangzhou 510515, Guangdong Province, China ywj918@sohu.com
About author:Xie Miao-miao☆, Studying for doctorate, Department of Stomatology, Nanfang Hospital of Southern Medical University, Guangzhou 510515, Guangdong Province, China medabc@163.com
Supported by:
National Natural Science Foundation of China, No. 81100747*

摘要/Abstract

摘要：

背景：前期研究中经证实变形链球菌内部存在单磷酸鸟苷环二聚体信号通路，构建了变形链球菌gcp基因敲除菌株。
目的：比较变形链球菌野生菌种和gcp基因突变菌株基因表达的差异情况，筛选与生物膜相关的基因，进入后续研究。
方法：提取两种细菌的总RNA，反转录后分别用cy3和cy5染色。与基因芯片杂交后，扫描结果，进行数据分析，获取差异基因信息，对筛选的基因进行Real-Time PCR验证。
结果与结论：差异基因主要与糖代谢、生物膜形成有关，选择了2个基因进行验证，PCR结果与芯片结果相符合。变形链球菌gcp基因敲除后，突变菌株ahpC基因表达上调，磷酸转移酶系统基因表达下调，说明这2个基因与c-di-GMP信号通路的下游途径相关。

关键词: 组织构建, 组织构建细胞学实验, 变形链球菌, 基因芯片, c-di-GMP信号通路, ahpC, 磷酸转移酶系统, 国家自然科学基金

Abstract:

BACKGROUND: Previous studies have confirmed the presence of bis-(3'-5')-cyclic dimeric guanosine monophosphate signaling pathway in Streptococcus mutans, which construct the streptococcus mutans gcp gene knockout strains.
OBJECTIVE: To compare the gene expression differences between Streptococcus mutans wild strains and gcp mutant strains, and to screen the biofilm-related genes from them for the follow-up study.
METHODS: The total RNA of two kinds of strains were extracted and stained with cy3 and cy5 respectively after reverse transcription. The gene chip was scanned after hybridization and the differential gene were obtained through the data analysis. The different expression genes were verified by real-time PCR.
RESULTS AND CONCLUSION: Differential genes were mainly relative about glucose metabolism and biofilm formation. We selected two genes for real-time PCR verification. The PCR results were consistent with the microarray results. After Streptococcus mutans gcp gene knockout, the gene expressions of gcp mutant strains were upregulated and the gene expressions of phosphotransferase system were downregulated, this result suggested that two different genes were related with the c-di-GMP signal pathway downstream.

Key words: tissue construction, cytology experiment in tissue construction, Streptococcus mutans, gene chip, c-di-GMP signal pathway, ahpC, phosphotransferase system, National Natural Science Foundation of China

中图分类号:

R318

谢苗苗，胡晓聪，吴补领，闫文娟. 变形链球菌gcp基因敲除菌株表达谱基因芯片[J]. 中国组织工程研究, doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.2013.33.014.

Xie Miao-miao, Hu Xiao-cong, Wu Bu-ling, Yan Wen-juan. Streptococcus mutans gcp gene knockout strains expression profile gene chip[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.2013.33.014.

图/表（结果） 3

2.1 使用DEVA软件进行数据分析及标准化处理首先将芯片对其网格，使用缩略图或者通过软件自带的“调整对齐”功能来查看手动对齐的效果，检查芯片的角落位置。从DEVA“项目管理器”对话框中选择“RMA分析功能”(多阵列分析功能)。用“RMA分析对话框”选择数据文件，设置计算方法和目标文件夹，点击“RUN”来进行数据分析。DEVA软件会自动运行每一个应用程序的默认分析，当分析工作完成后，可以查看结果。DEVA软件使用Bolstad描述的“位数正常化”的方法对表达的数据进行标准化。
通过标准化消除空间偏移误差后，这两列数据表示的就是实际表达水平。
2.2 上下调基因分析差异基因的筛选标准为国内外基因芯片实验的常用标准Ratio’=2和Ratio’=0. 5，Ratio’值大于2或小于0.5的点被认为是有显著表达差异的基因。实验以G’ i和R’ i为横纵坐标绘制杂交信号散点图，见图1，图中每个点的斜率代表该点的Ratio’值。分别以实验组数据和对照组数据为横纵坐标，根据自身比较和相互比较的结果绘制杂交信号散点图。通过标准化消除空间偏移误差后，这两列数据表示的就是实际表达水平。图1A和图1D分别显示的是实验组数据和对照组数据自身比较的结果，两组数据基本集中在对角线上，自身偏移小。图1B显示了实验组数据和对照组数据比较后的结果，大部分数据分布在左下角分值较小的区域，同时可以看到在对角线以上分布的数据较均匀，对角线以下分布的数据较离散，说明有个别基因表达下调的程度较高。图1C显示了对照组数据和实验组数据比较后的结果，同图1B相似，大部分数据分布在左下角分值较小的区域，但是与图1B不相同的是，在对角线以上分布的数据较离散，对角线以下分布的数据较均匀。

归一化后的箱图，实验组和对照组数据离散程度相似，M值相同，说明两组数据归一化程度好，见图2。
2.3 信号通路分析结果将所得的差异基因进行编码注释，只有309个基因得到了kegg编码，其中上调基因有142个，用红色表示，下调基因有167个，用绿色表示，将这些基因输入到“KEGG Mapper”数据库，进行信号通路分析。结果显示，有96个基因对应的kegg编码在数据库中找不到相应的信号通路信息，其他213个基因分布于代谢、生物合成、转运以及糖酵解途径相关。

图3由GIF等平板问卷类型图示，方框显示为设计的酶EC名称，红色代表上调基因编码，绿色代表下调基因编码，圆滑框为反应类型，以实线和箭头连接反应物和方向，虚线指向预测的反应类型。
2.4 Real-Time PCR结果在S. mutans UA159标准菌株及转化菌株中，内参照16SrRNA均得到稳定地扩增。突变菌株的ahpC基因表达增加，但是磷酸转移酶系统基因表达降低，见图4。

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引言

材料方法

设计：基因芯片检测。

时间及地点： 实验于2012年3月至2013年2月在南方医院中心实验室完成。

材料：

基因及菌株来源：变形链球菌UA159(S. mutants UA159)由中山大学光华口腔医学院惠赠，采用脑心浸液(BHI)固体及液体培养基。

gcp基因突变菌株(gcp-ko)由本课题组构建，采用选择性脑心浸液培养基，加入质量浓度为1 g/L的壮观霉素。

细菌的培养条件是37 ℃，混合气体中CO₂、H₂和N₂含量分别是体积分数10%，10%，80%。

实验方法：

总RNA的提取、反转录和标记：利用TaKaRa公司“细菌总RNA提取试剂盒”提取S. mutants UA159和gcp-ko的总RNA，质检合格后反转录为cDNA，在产物中加入RNase Free dH₂O将浓度稀释为100 µg/L备用。在暗室中将Cy3和Cy5短暂离心后，溶解在缓冲液中，分别用Cy3标记突变菌株gcp-ko，Cy5标记野生菌株S. mutants UA159。

将标记后的样品放在ABI9700PCR仪上，98℃加热10 min使样品热变性。热变性完成后，将样品放在ABI9700PCR仪上，37 ℃温育2 h，将全部的样品分别转移到一个新的1.5 mL eppendorf管中，加入110 µL的异丙醇，每种样品总体积为231.5 µL。室温下避光放置10 min，然后1 000×g离心10 min，用移液管去掉上清液。在沉淀中加入500 µL浓度为80%的预冷的乙醇溶液，轻轻震荡使沉淀溶解，12 000×g离心2 min，弃掉上清液，将样品避光置于真空抽干仪中进行抽干。

基因芯片杂交和洗片：将杂交炉在42 ℃预热3 h，使用5 µLVWR水重悬cDNA沉淀，样品放在ABI9700PCR仪内，95 ℃反应5 min，干燥后封闭芯片，放入预热的杂交炉内，42 ℃下进行芯片杂交20 h。

杂交完成后，按照nimblegen芯片说明书准备芯片洗脱液Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ，将芯片的拆卸工具放入到42 ℃预热的洗脱液Ⅰ中，芯片杂交结束后，从芯片杂交炉内取出芯片放入到拆卸工具里，在42 ℃预热的洗脱液Ⅰ中小心的取出芯片上面的mixer，在洗脱液Ⅰ中轻轻漂洗slider 10-15 s以去除杂交缓冲液。然后将slider放入洗脱液Ⅱ中漂洗1 min，洗脱液Ⅲ中漂洗15 s，然后放入芯片干燥仪中干燥30 s，用滤纸吸去边缘多余的洗脱液。

基因芯片扫描及结果分析：打开芯片扫描仪NimbleGen MS 200，将芯片字符面向内，插入到芯片夹中，并将其置入基因芯片扫描仪中，采用MS 200 Data Collection软件，在激光控制按钮处选择“红、绿激光”，按照下列数据设置参数：

基因芯片扫描仪参数设定：

由仪器自动平衡红绿荧光的激发光能量及增益值进行扫描，获得双色叠加的杂交结果图，保存该结果。

实验数据的标准化处理：实验使用的nimblegen芯片通过“看家基因”的方法来进行实验数据标准化处理^[7]。预先选择一组表达水平不变的看家基因，计算出这组基因平均ratio值为1时的标准化系数，然后将其应用与全部的数据以达到标准化的目的。

KEGG Pathway分析：Kegg(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes)(京都大学基因和基因组百科全书数据库)是系统分析基因功能的数据库，将基因组的信息和基因功能联系起来，揭示生命现象的遗传和化学蓝图。Kegg数据库包括“通路分析”、“基因组分析”和“化学信息”3个方面，分别查找可能的反应途径、类似的基因序列和类似的复合物结构。

将所得的差异基因，输入信号通路分析网站kegg mapper Search&Color Pathway(http://www. genome. jp/kegg/tool/map_pathway2.html)进行分析。

验证差异基因：实验采用国内外基因芯片实验的常用标准Ratio'=2和Ratio'=0.5作为差异基因的筛选标准，Ratio’值大于2或小于0.5的点被认为是有显著表达差异的基因。分别比较两组数据中Cy5荧光信号强度和Cy3荧光信号强度，对于同一个探针，如果前者大于后者2倍或2倍以上，认为该探针所代表的基因表达降低，如果后者是前者的2倍或2倍以上，说明该探针代表的基因表达升高。NimleGen基因组芯片上，每一个基因均设计了2-5个探针，如果该基因所对应的探针同时升高或者同时降低，说明探针的结果可信度较高，将该基因纳入下一步研究。结合kegg通路分析的结果，实验最终确定了2个验证基因，分别是ahpC基因(上调)和磷酸转移酶系统基因(下调)：

利用天根公司“细菌总RNA提取试剂盒”提取S. mutants UA159和gcp-ko的总RNA，质检合格后反转录为cDNA，以cDNA为模板，以细菌16S rRNA(引物16SrRNA-F，16SrRNA-R)作为内参。内参及目的基因的引物设计，见表1。

讨论

近年来c-di-GMP的研究越来越受到人们的关注，随着c-di-GMP合成酶和降解酶结构^[8]、催化机制的解析^[9]，特别是c-di-GMP信号通路调节机制的诠释^[10]，更奠定了其胞内第一信使的地位^[11]。但是，c-di-GMP的研究尚处于起步阶段，还有众多的问题亟待解决^[12]，如GEMM核开关的发现部分解释了c-di-GMP功能的多样性和在细菌中的普遍性^[13]。但是，还有许多细菌并不含有GEMM RNA，那么，这些细菌中是否存在其它调节机制有待于进一步研究^[14]。所以在未来的研究中，鉴定新的c-di-GMP作用靶点是非常必要的。在这一方面，现代功能基因组学和生物信息学的快速发展，必将为c-di-GMP信号通路的研究带来新的契机^[15]。此外，在对c-di-GMP信号通路的研究上，阐明c-di-GMP与其它信号通路之间的联系将有助于对其作用靶点和作用机制的诠释^[16]。

微阵列芯片即一般所谓的基因芯片，也是基因组计划完成之后衍生出来的产品^[17]。基因芯片是一种反向的杂交技术，将已知序列的基因制成探针，有序的固定在玻片上，形成微阵列。这样微阵列中的每一个探针就代表了一个特定的基因序列。研究中把样本中的总DNA或者总RNA用染料进行标记，与基因芯片进行分子杂交。然后用专门的扫描仪对基因芯片进行扫描，检测芯片上面每一个探针的信号值，用信号值的差异反映样本中个基因表达情况的差异。基因芯片技术虽然花费成本高，但效用无限，是目前所有生物芯片中应用最广的^[18]，由于近年来不断改进，也是最有成效的生物技术。一般而言，基因芯片是利用微处理技术，先把人类所有的基因分别固着在一小范围的玻璃片(glass slide)、薄膜(membrane)或者硅芯片上；然后，可以平行地、大量地、全面性地侦测基因组中mRNA的量，也就是侦测基因的调控及相互作用表达。近年来，表达谱芯片的广泛应用成为基因功能研究的一种重要手段。在本实验中提取突变株和野生株的总RNA，反转录后产生的cDNA与表达谱基因芯片进行杂交，可以对这些基因表达的个体特异性进行综合的分析和判断，迅速将某个或几个基因与突变株联系起来，极大地加快这些基因功能的确立，同时进一步研究基因与基因间相互作用的关系。所以，采用表达谱芯片进行检测的意义在于利用表达谱基因芯片可以获得大量与研究领域相关的基因，使研究更具目的性和系统性，同时也拓宽研究领域。

这次研究所得数据采用在线工具GO(http://www. geneontology.org/)和PANTHER (http://www. pantherdb.org/)进行分析的结果表明，差异基因主要与细胞趋向性和生物膜形成、信号转导、糖代谢、核酸代谢、等途径相关。

其中与生物膜形成和代谢相关的上调基因主要有：“肽基转移酶”和“锰/锌ABC的转运子”。下调的基因主要有：丙酮酸甲酸裂解酶激活酶、丙酮酸激酶、右旋糖酐酶、烷基过氧化氢还原酶、柠檬酸裂解酶和磷酸转移酶系统磷酸转移酶系统。实验借助美国国立生物技术信息中心NCBI数据库中的生物学信息，对以上途径中的一些特征基因进行了进一步分析，试图寻找出与c-di-GMP对变形链球菌生理功能变化影响的原因所在。

烷基过氧化氢还原酶(上调)：

ahpC是烷基过氧化氢还原酶(alkyl hydroperoxide reductase，ahpC)的编码基因^[19]。在厌氧菌中为了抵抗外界环境中的各种形式的含氧物质，包括氧气、过氧化阴离子、过氧化氢及有机过氧化氢等的伤害，细菌中具有还原能力的蛋白质对细菌的生存非常重要，能够把活性氧转换为无毒的分子^[20]。AxyR控制编码解毒酶基因如触酶过氧化物酶(katG编码)和烷基过氧化氢还原酶(ahpC编码)的表达。有学者将ahpC突变作为katG基因损伤的标志^[21]，还有学者认为ahpC编码基因突变极少^[22]。

变形链球菌中的烷基过氧化氢还原酶(alkyl hydroperoxide reductase，ahpR)由两个部分组成^[23]，分别是nox-1和ahpC。在变形链球菌基因组中，nox-1和ahpC位于相邻的位置，紧邻ahpC基因下游的是nox-1基因^[24]。对ahpC和nox-1的研究已经证实，这些蛋白在变形链球菌的双组份过氧化物酶系统中起作用,能够催化还原性辅酶II(nicotinamide adenine dinucleotide，NADH)途径将过氧化氢还原为醇类物质和水^[25]。Yamamoto等^[26]报道了对变形链球菌基因组中nox-1和ahpC基因序列的研究，描述了两种蛋白的表达情况。

研究发现Nox-1在变形链球菌中作能有效维持还原型ahpC的量，且可作为一种NADH依赖性过氧化物酶与ahpC联合起作用^[20]。但Nox-1无论是作为NADH依赖性氧化酶还是与ahpC一起作为过氧化物酶，它在耐氧菌株的有氧能量代谢中的作用可能被其他抗氧化系统的交叠作用所掩饰。Higuchi等^[20]学者从变形链球菌基因中删除nox-1和aphC基因后发现突变株的抗氧化能力无明显改变，提示变形链球菌中除烷基过氧化氢还原酶系统外还存在其他抗氧化的蛋白。在研究中他们发现了dpr基因(Dps-like Peroxide Resistance gene，dpr)在变形链球菌中同样具有抗氧化的作用，并且能够弥补细菌因nox-1和aphC基因突变带来的抗氧化能力下降的缺陷。

在这次研究中，变形链球菌gcp基因突变菌株的ahpC基因的表达量比野生菌株中的表达量高，说明细菌在gcp基因敲除后，其还原性辅酶II途径的抗氧化能力增强，但是在变形链球菌中存在不止一条抗氧化途径，其他途径有什么变化尚不得知，因此，突变菌株的抗氧化能力是否增加还需要进一步研究。

磷酸转移酶系统(下调)：

变形链球菌具有高效率的蔗糖转运系统，主要是高亲和力的磷酸转移酶系统 (phosphotransferase system，PTS)^[27]。葡萄糖转移酶和磷酸转移酶是变形链球菌蔗糖致龋的重要方式。在对牙菌斑形成的研究中发现，变形链球菌可以在胞外糖浓度极低时，充分利用唾液或环境中的多糖、单糖等能源物质。同时磷酸转移酶系统本身可以调控其它转运系统及碳源的储藏，协调氮、碳的代谢。对磷酸转移酶系统缺陷菌株的研究发现，该转运替代途径与“质子动力势”(proton motive force，PMF)有关。

磷酸转移酶系统及其替代途径使得变形链球菌复杂而又规则地进行碳水化台物的运输、糖酵解、糖原代谢^[28]。因此，它与龋病有着密切的关系^[29]。Alaluusua等研究发现高糖饮食使奶瓶龋儿童口腔内牙菌斑中变形链球菌的比例显著高于无龋儿童，而且感染不止一种克隆型，用rRNA杂交分析出多个核糖型(ribotype)。在唾液中，淀粉降解的主要产物是麦芽糖，Webb等^[30]发现变形链球菌通过磷酸转移酶系统发酵麦芽糖并将麦芽糖作为唯一的碳源。变形链球菌的这种能力增加了龋齿感染的可能性。

在这次实验中，变形链球菌gcp基因突变菌株的磷酸转移酶系统基因的表达量比野生菌株中的表达量低，说明变形链球菌在gcp基因敲除后，影响了变形链球菌磷酸转移酶系统途径蔗糖转运的效率，降低了通过该途径带来的龋病危险系数，可能在一定程度上降低了细菌的致龋能力。

变形链球菌gcp基因敲除菌株表达谱基因芯片

Streptococcus mutans gcp gene knockout strains expression profile gene chip

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