长距离跑步大鼠膝关节滑膜基质金属蛋白酶的表达

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2013.33.002

中国组织工程研究

• 软骨组织构建 cartilage tissue construction • 上一篇下一篇

长距离跑步大鼠膝关节滑膜基质金属蛋白酶的表达

上官雅娴¹，卫小春²，李凯²，卫建平¹

山西医科大学第二医院，1病理科，2骨科，山西省太原市 030001

收稿日期:2013-03-05 修回日期:2013-04-27 出版日期:2013-08-13 发布日期:2013-08-13
通讯作者: 卫建平，主任医师，山西医科大学第二医院病理科，山西省太原市 030001 wjp123555@sina.com
作者简介:上官雅娴★，女，1985年生，河南省三门峡市人，汉族，山西医科大学在读硕士，主要从事骨关节研究。 lianzihuaigu@163.com
基金资助:
国家自然科学基金(81000815)：“在体观察过度应力负荷对大鼠关节软骨损伤作用及机制研究”；山西省自然科学基金项目(2010021034-5)：“在体观察过度应力负荷对大鼠关节软骨损伤作用及机制研究”；山西省卫生厅科技攻关计划项目(2011036)，“在体应力负荷对大鼠关节软骨代谢平衡的影响”。

Expression of matrix metalloproteinases in the synovium of rat knee joint during long-distance running

Shangguan Ya-xian¹, Wei Xiao-chun², Li Kai², Wei Jian-ping¹

1Department of Pathology, Second Hospital of Shanxi Medical University, Taiyuan 030001, Shanxi Province, China; 2Department of Orthopedics, Second Hospital of Shanxi Medical University, Taiyuan 030001, Shanxi Province, China

Received:2013-03-05 Revised:2013-04-27 Online:2013-08-13 Published:2013-08-13
Contact: Wei Jian-ping, Chief physician, Department of Pathology, Second Hospital of Shanxi Medical University, Taiyuan 030001, Shanxi Province, China wjp123555@sina.com
About author:Shangguan Ya-xian★, Studying for master’s degree, Department of Pathology, Second Hospital of Shanxi Medical University, Taiyuan 030001, Shanxi Province, China lianzihuaigu@163.com
Supported by:
National Natural Science Foundation of China, No. 81000815*; Natural Science Foundation of Shanxi Province, No. 2010021034-5*; Key Scientific and Technological Planning Projects of Shanxi Province Health Department, No. 2011036*

摘要/Abstract

摘要：

背景：很多研究表明基质金属蛋白酶 1，3，9和13 对关节软骨的退变存在影响，但是针对关节滑膜进行的专项研究相对较少。
目的：观察长距离跑步运动对基质金属蛋白酶1，3， 9以及基质金属蛋白酶13在滑膜上的表达的影响。
方法：Wistar雄性大鼠15只随机分为3组：对照组、平板组和上坡组。对照组普通笼养；平板组每天在平板0°的水平面跑步机上以1 km/h，运动1 h，持续45 d；上坡组先在平板0°跑步机上以1 km/h，运动1 h，持续15 d，然后在上坡+20°的跑步机上每天以1 km/h，运动1 h，持续30 d。造成不同程度的膝关节滑膜损伤模型，造模成功后取双后肢膝关节，进行石蜡包埋，矢状面整体切片，而后进行苏木精-伊红和免疫组织化学染色，观察并分析实验结果。
结果与结论：长距离跑步运动后，平板组和上坡组的滑膜组织中基质金属蛋白酶1的表达都比对照组增高 (P < 0.05)，但平板组和上坡组之间差异无显著性意义(P > 0.05)；而3组基质金属蛋白酶3的表达并无明显变化(P > 0.05)；基质金属蛋白酶9和基质金属蛋白酶13在滑膜组织中的表达呈梯度递增状态(P < 0.05)，对照组表达最低，平板组有所升高，上坡组的表达最高。说明长距离跑步运动可通过改变基质金属蛋白酶的表达而影响大鼠膝关节滑膜组织的正常生理结构。

关键词: 组织构建, 软骨组织构建, 滑膜炎, 膝关节, 滑膜损伤, 基质金属蛋白酶, 长距离, 跑步运动, 免疫组织化学, 国家自然科学基金

Abstract:

BACKGROUND: Many studies have shown that matrix metalloproteinases 1, 3, 9 and 13 play an important role in articular cartilage degeneration and destruction, but there is less special research on the articular synovium.
OBJECTIVE: To observe the effect of long-distance running on the expressions of matrix metalloproteinases 1, 3, 9 and 13 in the synovium.
METHODS: Fifteen male Wistar rats were divided into three groups: control group, tablet group and uphill group. Rats in the control group received ordinary captivity; rats in the tablet group ran on the horizontal treadmill (0°) at the speed of 1 km/h for 1 hour daily, and lasted for 45 days; rats in the uphill group daily ran on the horizontal treadmill (0°) at the speed of 1 km/h for 1 hour, and lasted for 15 days, and then the rats ran on the uphill treadmill (+20°) at the speed of 1 km/h for 1 hour daily and lasted for 30 days. The knee joint synovium injury models with varying degrees were established. The dual hind knee joints were obtained after modeling for paraffin-embedded. Then the overall sagittal slices were obtained for hematoxylin-eosin staining and immunohistochemical staining, and the experimental results were observed and analyzed.
RESULTS AND CONCLUSION: After long-distance running, the expression of matrix metalloproteinases 1 in synovium of the tablet group and uphill group was increased when compared with that of the control group (P < 0.05), but there was no significant difference between tablet group and uphill group (P > 0.05). There was no significant difference in matrix metalloproteinases 3 expression (P > 0.05). The expressions of matrix metalloproteinase 9 and matrix metalloproteinase 13 in synovium were in gradient increasing state (P < 0.05), which were lowest in the control group, increased in the tablet group and highest in the uphill group. The results indicate that long-distance running exercise can influence the normal physiological structure of rat knee joint synovium by changing the expression of matrix metalloproteinases.

Key words: tissue construction, cartilage tissue construction, synovitis, knee joint, synovial injury, matrix metalloproteinase, long-distance, running exercise, immunohistochemistry, National Natural Science Foundation of China

中图分类号:

R318

上官雅娴，卫小春，李凯，卫建平. 长距离跑步大鼠膝关节滑膜基质金属蛋白酶的表达[J]. 中国组织工程研究, doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.2013.33.002.

Shangguan Ya-xian, Wei Xiao-chun, Li Kai, Wei Jian-ping. Expression of matrix metalloproteinases in the synovium of rat knee joint during long-distance running[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.2013.33.002.

图/表（结果） 6

2. 1 造模过程共使用Wistar大鼠15只，均纳入实验结果，实验过程中无死亡，标本处理中无损耗。

2.2 苏木精-伊红染色切片在显微镜下的组织学改变对照组显示正常滑膜组织结构，滑膜细胞排列分布较规则，未见明显增生，毛细血管未见明显异常，在很多滑膜和纤维层之间的某些区域有一层疏松的结蹄组织或脂肪组织，形成一些滑膜皱褶或以“绒毛”的形式突入关节腔，见图1。而平板组和上坡组均可见滑膜的慢性炎症性表现，大量滑膜细胞增生，毛细血管增生，并伴淋巴细胞和单核巨噬细胞浸润，且多围绕血管分布，而滑膜和纤维层之间的疏松结蹄组织和脂肪组织则比对照组减少，滑膜褶皱增多，表面凹凸不平现象更常见。其中上坡组的滑膜和毛细血管增生情况比平板组更加明显，见图2，3。

2.3 免疫组织化学染色切片基质金属蛋白酶1，3，9，13的表达

基质金属蛋白酶1：在滑膜组织中，对照组的基质金属蛋白酶1表达基本为阴性，见图4；而在平板组和上坡组中，基质金属蛋白酶1均出现了阳性表达，见图5，6。经图像分析和统计，发现平板组和上坡组基质金属蛋白酶表达均明显高于对照组(P < 0.05)，但两组之间差异无显著性意义(P > 0.05)，见表1。

基质金属蛋白酶3：滑膜组织中，对照组、平板组和上坡组的基质金属蛋白酶3表达均较弱，3组之间比较，差异无显著性意义(P > 0.05)，见图7-9，表1。

基质金属蛋白酶9：在滑膜组织中，3组基质金属蛋白酶9的表达呈现梯度递增，即平板组比对照组表达增高，上坡组比平板组表达增高，差异均有显著性意义(P < 0.05)，见图10-12，表1。

基质金属蛋白酶13：基质金属蛋白酶13的表达与基质金属蛋白酶9一致，滑膜组织中梯度递增，即平板组比对照组表达增高，上坡组比平板组表达增高，差异均有显著性意义(P < 0.05)，见图13-15，表1。

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引言

材料方法

设计：随机对照动物实验。

时间和地点：实验于2012年3至11月在山西医科大学第二医院骨科实验室完成。

材料：

实验动物：8周Wistar大鼠15只，初始体质量200- 250 g，山西医科大学实验动物中心提供，动物生产许可证号：SCXK(晋)2009-0001。所有大鼠饲料均来源于山西医科大学实验动物中心，饮用水来自普通自来水。实验中对动物的处理完全符合中华人民共和国科学技术部颁发的《关于善待实验动物的指导性意见》。

实验方法：

实验动物分组及干预：采用随机排序法将15只大鼠均分为3组：对照组普通笼养；平板组在0°平板1 km/h， 1 h/d，连续运动45 d；上坡组在0°平板1 km/h，1 h/d，连续运动15 d，然后20°上坡运动，1 km/h，1 h/d，连续运动30 d。

长距离跑步运动对大鼠膝关节滑膜基质金属蛋白酶表达实验的试剂及仪器：

被动运动装置：此装备由两部分组成：跑步机和跑道笼罩。跑道笼罩为一自制的罩盒，罩盒笼罩于跑步机上时，可将跑步机分为4个独立的跑道，跑道前端为暗室，中部由强光照射，后部有连接电线的电极。如果大鼠停止运动，则会随传送带后退而触及后部电极，实验者可及时给予电击，迫使大鼠继续运动，如此反复多次后，大鼠可以产生条件反射，在跑步机上持续向前奔跑，直至实验结束。

标本的采集与处理：45 d的持续运动结束后，将全部大鼠用脊髓脱臼法处死，取双后肢膝关节，认真去除关节周围多余组织，保留关节囊。置于体积分数10%甲醛中固定7 d，20%乙二胺四乙酸二钠(EDTA二钠，pH=7.1)溶液浸泡，每2 d换液1次，连续脱钙45 d。沿正中矢状面剖开，取内外侧半关节，切面紧贴蜡块表面包埋，切片机去除交叉韧带等组织，在软骨负重区以3 μm切片，染色观察。苏木精-伊红、免疫组织化学染色。

免疫组织化学试剂来源与染色方法：所有抗体和DAB显色剂均来自武汉博士德生物工程有限公司。石蜡切片二甲苯脱蜡(二甲苯10 min×3次)，梯度乙醇水化，体积分数100%乙醇5 min×2次，体积分数95%乙醇5 min×2次，体积分数75%乙醇5 min；室温、体积分数3%过氧化氢10 min，灭活内源性过氧化物酶，蒸馏水洗3遍；37 ℃，0.1%胰酶12 min，PBS(pH 7.2-7.6)洗 2 min×3次；正常血清封闭液室温20 min，甩干不洗；滴加适当稀释的一抗，37 ℃ 1 h，PBS(pH 7.2-7.6)洗2 min×3次；滴加二抗(生物素化羊抗兔IgG)，37 ℃ 30 min，PBS (pH 7.2-7.6)洗2 min×3次；滴加试剂SABC，37 ℃ 20 min，PBS(pH 7.2-7.6)洗5 min×4次；DAB染色，镜下控制显色时间，蒸馏水洗涤；苏木精复染5 min；梯度乙醇脱水(体积分数75%乙醇5 min，体积分数95%乙醇5 min×2次，体积分数100%乙醇5 min×2次)，透明(二甲苯5 min×2次)，中性树脂封固。用非免疫的羊血清做阴性对照。

图像观察与处理：使用IPP6.0专业图像分析软件，每只大鼠的左右后肢各选一张免疫组织化学切片，每张随机取5个视野下的滑膜组织，所有切片的分析均在同一强度光源下，在同一放大倍数的光镜(×400)下进行，分别统计分析基质金属蛋白酶1，3，9和基质金属蛋白酶13的平均的吸光度值。

主要观察指标：①各组大鼠滑膜组织的苏木精-伊红染色：将各组大鼠的双后肢膝关节进行整体石蜡包埋，使用苏木精-伊红染色，观察组织和细胞形态。②各组大鼠滑膜组织的免疫组织化学染色：将各组大鼠的双后肢膝关节进行整体石蜡包埋，而后使用免疫组织化学方法对基质金属蛋白酶1，基质金属蛋白酶3，基质金属蛋白酶9和基质金属蛋白酶13进行染色。观察组织细胞形态，并进行统计学分析。

统计学分析：使用SPSS 13.0软件进行统计学分析，数据以x(_)±s表示，使用单因素方差分析，LSD-t 检验进行统计，P < 0.05为差异有显著性意义。

讨论

基质金属蛋白酶广泛分布于植物和动物组织中，是一类自然进化中高度保守的酶。实验将目前已发现的人源性基质金属蛋白酶称统称为基质金属蛋白酶家族。在正常稳定状态的组织中，基质金属蛋白酶的表达量极少；而在涉及人体多种生理和病理过程中，其表达量上升。基质金属蛋白酶是锌离子依赖性内肽酶^[1]，它们在结构上有着较高的同源性，大多数基质金属蛋白酶都含有N-末端前肽结构域、催化结构域、信号结构域和C-末端血结合素样结构域。基质金属蛋白酶广泛存在于结蹄组织中，可由成纤维细胞，上皮细胞，炎症细胞和内皮细胞等分泌。基质金属蛋白酶在降解细胞外基质^[2]，促新血管形成^[7]，与细胞黏附作用的调节中起到非常重要的作用，基质金属蛋白酶还可以激活有潜在活性的蛋白质^[8]。在正常生理情况下, 基质金属蛋白酶与结缔组织逆转和重塑、胚胎发育、骨与软骨的发育、乳腺退化及伤口愈合等生理过程有关。而基质金属蛋白酶异常则可引起包括癌症、骨性关节炎和类风湿性关节炎在内的多种疾病。基质金属蛋白酶对细胞外基质的降解是许多病理生理过程中非常关键的一个步骤。

目前的研究以表明，在绝大多数可造成滑膜炎的骨关节病变中，都有基质金属蛋白酶表达的升高，但这些研究多集中在针对血清或关节液的研究中，针对滑膜的研究很少。关节囊的内面即所谓滑膜，它由纤维母细胞样细胞(滑膜细胞，B细胞)和可能来自骨髓的巨噬细胞构成。滑膜细胞分泌胶原及糖蛋白，并具有高度特异的表型特征。当关节发生病变时，滑膜可保持正常，亦可增厚，而在病变晚期，可见有不同程度的滑膜增生，伴充血和淋巴细胞浸润。滑膜炎症可改变关节内环境, 进而引起关节软骨的损伤^[9-10]。

基质金属蛋白酶3是基质降解素，它降解的主要底物之一为与组织的黏弹性有关且在外在应力时维持其应有的弹性的凝集聚糖。凝集聚糖下降时，在组织学上可表现为嗜染程度下降, 在生物力学上表现为压应力刚度、张应力刚度降低, 关节功能下降。国外有研究表明，基质金属蛋白酶3在成纤维细胞增生中也起一定的中介作用^[19]。且在基质金属蛋白酶激活过程中，激活的基质金属蛋白酶3可再激活其他基质金属蛋白酶^[20]。既往研究表明，骨关节炎患者的血清和关节液中基质金属蛋白酶3含量较健康人增高^[21]。但也有研究结论是血清基质金属蛋白酶3水平在骨关节炎患者和正常人血清之间的没有不同^[15]。大量临床研究表明，类风湿性关节炎患者血清和关节液中基质金属蛋白酶3 浓度显著增高^{[15, 22]}。但对于类风湿关节炎患者的血清和滑液中，基质金属蛋白酶3的表达水平与关节的破坏程度是否相关，仍有争论。针对性抑制基质金属蛋白酶3分泌和其活性的治疗方法也已开始进行研究^[20]。然而，在这次研究中，基质金属蛋白酶3的表达在3组中却无明显差异，根据其他指标的表达，且根据实验中动物模型滑膜及软骨组织损伤程度判断，出现这样的结果与滑膜组织中基质金属蛋白酶3的绝对含量较低，而免疫组织化学法的敏感度有限有关。如果使用敏感度更高的研究方法，则更可能获得有统计学意义的的数据。

基质金属蛋白酶9是明胶酶，它可以降解Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型胶原，也可以切割Ⅳ、Ⅴ、Ⅶ、Ⅺ型胶原。基质金属蛋白酶9降解多种细胞外基质成分，可为血管内皮细胞迁移和血管腔形成创造适宜的外部环境^[23]。另外基质金属蛋白酶9 还可参与血管形成的信号转导途径，作用于血管生长调节因子，并能促进内皮细胞上调血管内皮生长因子，使血管内皮生长因子更有效地作用于其受体。故而，实验可以认为基质金属蛋白酶9是与软骨基质降解和关节滑膜炎症有关的最重要的一种酶^[24]。在关节炎患者中，有学者使用RT-PCR方法检测到膝关节骨关节炎软骨和滑膜中的基质金属蛋白酶9mRNA 的表达活性较正常人明显升高^[25]；也有研究使用RT-PCR方法，测得早期膝骨关节炎患者的血浆中，外周血单核细胞中基质金属蛋白酶9mRNA的表达与临床症状的严重程度正相关^[26]。在本实验中，作者发现在滑膜组织中，对照组与平板组与上坡组3组之间，基质金属蛋白酶9的表达呈现梯度递增的表现。这与大多文献资料记载的血液和关节液中的情况完全一致。

基质金属蛋白酶13又称胶原酶3，是惟一能够裂解胶原分子中三维螺旋结构的酶。对胶原具有特异性，可以优先降解Ⅱ型胶原，可以说是最有效的Ⅱ型胶原降解酶^[27]，而关节软骨基质中的胶原90%-95%是Ⅱ型胶原。故而，基质金属蛋白酶13在有关节软骨损伤的关节病变中起着十分重要的作用^[28]。有研究表明，基质金属蛋白酶13在类风湿关节炎和骨关节炎的血管生成中发挥重要的作用^[29]。Wernicke等^[30]研究表明，骨关节炎患者滑膜组织上表达的基质金属蛋白酶13参与了骨关节炎关节组织的降解过程，证明了基质金属蛋白酶13在骨关节炎的滑膜组织呈高表达状态，而在正常人的滑膜组织中的表达量是极低的。亦有研究得知，基质金属蛋白酶13的表达可以刺激类风湿关节炎软骨的退化，且与疾病的发生发展关系密切^[21]。而通过基质金属蛋白酶13的 mRNA及蛋白水平的检测，实验得到骨关节炎中基质金属蛋白酶13有高水平的表达，并且骨关节炎中基质金属蛋白酶13的mRNA与蛋白的表达具有显著正相关性^[32]。本研究中发现，在基质金属蛋白酶13的表达上，滑膜组织中也是梯度递增的，这与以上研究的结果也表现出高度的一致性。

目前，针对骨关节炎和类风湿关节炎的研究越来越深入，虽然也有人针对基质金属蛋白酶1，基质金属蛋白酶3，基质金属蛋白酶9和基质金属蛋白酶13进行相关研究^[33]，但是但针对滑膜的组织学研究依然很少。这次实验不但在此方面有所创新，也可以对骨关节的其他相关研究起到一定指导作用。长距离跑步运动可造成关节的损伤，而关节损伤是滑膜损伤的重要原因之一。本研究参考Tang等^[34]的大鼠力竭运动研究，制造滑膜损伤模型，尝试探讨长距离跑步运动对大鼠膝关节滑膜基质金属蛋白酶表达的影响，以期更深入了解骨关节病变中滑膜的变化，帮助指导临床实践工作。而针对性控制和减少基质金属蛋白酶在关节中的表达，可能作为骨关节病变的治疗的一种手段。

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延伸阅读

创新性报告：

1 滑膜是关节囊的内层，由疏松结缔组织组成。滑膜可制造和调节滑液，并具有吸收和吞噬作用。滑膜炎(synovitis），是一种多发性疾病，其发病部位主要在膝关节。膝关节是人体滑膜最多，关节面最大和结构最复杂的关节，当患者发生骨质增生、关节炎、关节结核、风湿病等和创伤性外伤、骨伤、关节内损伤、周围软组织损伤、手术等情况时，均可诱发滑膜炎。

2 国内外对于骨关节炎和类风湿性关节炎模型以及患者的血液、关节炎和关节软骨的研究较多：pubmed检索中，Search (Osteoarthritis[Title/Abstract]) AND MMP[Title/Abstract] Filters: published in the last 5 years结果为416，而Search (RA) AND MMP Filters: published in the last 5 years结果则为322。但是专项针对滑膜炎病变的研究则较少，以Search(synovitis[Title/Abstract]) AND MMP[Title/Abstract]搜索，不限时间内，也只有77篇相关文献。而具体到使用免疫组织化学法进行研究的Search ((]immunohistochemistry) AND synovitis) AND MMP Filters: published in the last 10 years，十年内则只有22篇。而在国内，这类研究就更少了。

3附表：

检索词	时间范围	检索结果
Search (synovitis[Title]) AND MMP[Title]	任意时间	3
Search(synovitis[Title/Abstract])ANDMMP[Title/Abstract]	任意时间	77
Search(synovitis[Title/Abstract])ANDMMP[Title/Abstract]	近十年	53
Search(synovitis[Title/Abstract])ANDMMP[Title/Abstract]	近五年	32
Search (synovitis) AND MMP	任意时间	99
Search (synovitis) AND MMP	近十年	67
Search (synovitis) AND MMP	近五年	41
Search ((]immunohistochemistry) AND synovitis) AND MMP	近十年	22

检索时间：2013年3月7日

同类研究比较：

已发表文章：Arthritis Res Ther. 2008;10(1):R13.

主要观察指标：膝关节免疫组化染色，番红——固绿染色，高效液相色谱法

结论：大鼠剧烈运动引起的骨关节炎，血清硫酸角质素与骨性关节炎的进展相关。每周关节内注射透明质酸控制膝关节骨性关节炎的发展，并通过血清硫酸角质素的反映。

已发表文章：Rheumatol Int. 2008 ;29(1):31-36.

主要观察指标：免疫组织化学染色

结论：诱导OA兔子在软骨和滑膜，MMP-1均增加，且随OA进展稳步增加。在滑膜中落后于软骨MMP-1的表达增加，提示OA病理起源于软骨，但滑膜炎可能也参与软骨退化，特别是在中、晚期OA。

已发表文章：Rheumatology (Oxford). 2003;42(1):83-88.

主要观察指标：双抗酶联免疫吸附法

结论：血清MMP-1、MMP-3基线水平结合放射学可预测早期未经治疗的RA疾病活动性。

已发表文章：Rheumatol Int. 2011; 31(4):543-547.

主要观察指标：ELISA法测定

结论：胶原酶（总MMP-1和总MMP-13）和明胶酶（总MMP-2和总MMP-9）水平在RA关节液均显著高于OA。总MMP-9水平在RA液VEGF水平显著相关，但不是在OA，而总MMP-13在RA和OA与血管内皮生长因子水平密切相关。然而，MMP-2和总MMP-1水平是不相关的。血管内皮生长因子水平在RA或OA关节液在RA和OA，MMP-9和MMP-13比MMP-2和MMP-1在血管生成中发挥更重要的作用。

已发表文章：Przegl Lek. 2005;62(12):1321-1324.

主要观察指标：ELISA法测定，临床数据收集

结论：基质金属蛋白酶可能是在早期类风湿关节炎疾病活动有用的临床指标。

拟发表文章：《中国组织工程研究》

主要观察指标：苏木精-伊红染色，免疫组织化学染色

结论：说明长距离跑步运动可通过改变基质金属蛋白酶的表达而影响大鼠膝关节滑膜组织的正常生理结构。

长距离跑步大鼠膝关节滑膜基质金属蛋白酶的表达

Expression of matrix metalloproteinases in the synovium of rat knee joint during long-distance running

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