骨髓间充质干细胞及与胰岛细胞共移植治疗糖尿病

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2013.31.021

中国组织工程研究

• 器官移植学术探讨 academic discussion of organ transplantation • 上一篇下一篇

骨髓间充质干细胞及与胰岛细胞共移植治疗糖尿病

吴立萍¹，李蒙²，李瑞玉³，孙艳浮³，颜军礼⁴

1邢台市人民医院检验科，河北省邢台市 054031；2武警新疆总队和田地区支队卫生队，新疆维吾尔自治区和田市 848011；3邢台医学高等专科学校第二附属医院中西医结合研究所，河北省邢台市 054000； 4河北省任县医院，河北省邢台市 055150

收稿日期:2013-03-15 修回日期:2013-06-18 出版日期:2013-07-30 发布日期:2013-07-30
通讯作者: 李瑞玉，教授，主任医师，硕士研究生导师，邢台医学高等专科学校第二附属医院中西医结合研究所，河北省邢台市 054000 liruiyu651021@163.com
作者简介:吴立萍★，女，1973年生，河北省广宗县人，汉族，2009年河北工程大学毕业，硕士，主管检验师，主要从事临床检验的科研及教学研究。 18233928966@163.com
基金资助:
河北省中医药管理局资助项目(2012068)。

Co-transplantation of bone marrow mesenchymal stem cells and islet cells in the treatment of diabetes mellitus

Wu Li-ping¹, Li Meng², Li Rui-yu³, Sun Yan-fu³, Yan Jun-li⁴

1Department of Laboratory, Xingtai People’s Hospital, Xingtai 054031, Hebei Province, China; 2Department of Health, Hotan Detachment of the Xinjiang Armed Police Corps, Hotan 848011, Xinjiang Uygur Autonomous Region, China; 3Institute of Integrative Medicine, Second Hospital of Xingtai Medical College, Xingtai 054000, Hebei Province China; 4Ren County Hospital, Xingtai 055150, Hebei Province, China

Received:2013-03-15 Revised:2013-06-18 Online:2013-07-30 Published:2013-07-30
Contact: Li Rui-yu, Professor, Chief physician, Master’s supervisor, Institute of Integrative Medicine, Second Hospital of Xingtai Medical College, Xingtai 054000, Hebei Province China liruiyu651021@163.com
About author:Wu Li-ping★, Master, Chief examiner, Department of Laboratory, Xingtai People’s Hospital, Xingtai 054031, Hebei Province, China 18233928966@163.com
Supported by:
Projects of Hebei Province Pharmaceutical Administration, No. 2012068*

摘要/Abstract

摘要：

背景：药物是目前糖尿病治疗最主要的方法，但病情的进展以及相关并发症的发生使药物的作用受到挑战。
目的：探讨骨髓间充质干细胞与胰岛细胞共移植治疗糖尿病的应用效果以及可行性。
方法：分离、纯化大鼠骨髓间充质干细胞并进行体外培养，建立糖尿病模型，对糖尿病模型大鼠分别注射骨髓间充质干细胞、骨髓间充质干细胞和胰岛细胞共培养混合物以及生理盐水或磷酸盐缓冲液作为对照。通过观察监测各糖尿病模型大鼠血糖水平的变化、胰岛素分泌情况以及胰腺组织的病理学变化评估移植治疗效果。
结果与结论：骨髓间充质干细胞移植治疗糖尿病模型大鼠，移植后C-肽值明显升高，血糖水平明显下降，但仍未降至正常范围内，且随着时间的延长，血糖水平再次升高。骨髓间充质干细胞与胰岛细胞共移植治疗糖尿病模型大鼠，血糖水平亦明显下降，且下降程度大于单纯骨髓间充质干细胞移植治疗，可下降至正常水平，并在一定时间内能够维持。骨髓间充质干细胞与胰岛细胞共移植治疗糖尿病具有一定的效果，具有应用的可行性。

关键词: 器官移植, 器官移植学术探讨, 骨髓间充质干细胞, 胰岛细胞, 糖尿病, 移植, 胰腺, 血糖, 胰岛素, 免疫荧光染色, 省级基金

Abstract:

BACKGROUND: Drug treatment is the main method for the treatment of diabetes currently, but the development of the disease and occurrence of related complications are the challenges to the effect of drugs.
OBJECTIVE: To investigate the effect and feasibility of co-transplantation of bone marrow mesenchymal stem cells and islet cells for the treatment of diabetes.
METHODS: The rat bone marrow mesenchymal stem cells were separated and purified, and cultured in vitro to establish the diabetes models. The rat diabetes models were injected with bone marrow mesenchymal stem cells, co-cultured mixture of bone marrow mesenchymal stem cells and islet cells, and normal saline or phosphate buffer (control). The effect of transplantation was evaluated through observing the blood glucose levels, insulin secretion, and pathological changes of pancreatic tissue in the rat diabetes models.
RESUTLS AND CONCLUSION: In the diabetes rats treated with bone marrow mesenchymal stem cell transplantation, the C-peptide levels were significantly increased after transplantation, while the blood glucose levels were significantly decreased, but not lower than the normal level, and the blood glucose levels were increased again with the time prolonging. In the diabetes rats treated with co-transplantation of bone marrow mesenchymal stem cells and islet cells, the blood glucose levels were decreased significantly and lower than the normal level which was maintained in a certain time, and the decreasing degree was larger than that in the rats treated with simple bone marrow mesenchymal stem cell transplantation. Co-transplantation of bone marrow mesenchymal stem cells and islet cells is feasible for the treatment of diabetes with a certain effect.

Key words: organ transplantation, organ transplantation academic discussion, bone marrow mesenchymal stem cells, islet cells, diabetes, transplantation, pancreas, blood glucose, insulin, immunofluorescence, provincial grants-supported paper

中图分类号:

R318

吴立萍，李蒙，李瑞玉，孙艳浮，颜军礼 . 骨髓间充质干细胞及与胰岛细胞共移植治疗糖尿病[J]. 中国组织工程研究, doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.2013.31.021.

Wu Li-ping, Li Meng, Li Rui-yu, Sun Yan-fu, Yan Jun-li. Co-transplantation of bone marrow mesenchymal stem cells and islet cells in the treatment of diabetes mellitus[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.2013.31.021.

图/表（结果） 1

2.1 骨髓间充质干细胞移植治疗糖尿病肖红珍等^[11]对外源性骨髓间充质干细胞移植至糖尿病模型大鼠体内分化为胰岛细胞治疗糖尿病进行了研究。实验采用密度梯度离心结合贴壁培养的方法分离、纯化雄性大鼠骨髓间充质干细胞，并采用免疫组织荧光法进行鉴定。鉴定后将30只大鼠随机分为生理盐水组、骨髓间充质干细胞组以及糖尿病模型组，每组10只大鼠，骨髓间充质干细胞组给予大鼠尾静脉注射骨髓间充质干细胞悬液0.2 mL，生理盐水组给予大鼠尾静脉注射0.2 mL生理盐水，糖尿病模型组检测各大鼠血糖值及体质量，按一定剂量腹腔注射链脲佐菌素，检测各大鼠血糖值，当血糖≥ 16.7 mmol/L且稳定2 d后给予尾静脉注射骨髓间充质干细胞0.2 mL。应用原位杂交法检测各大鼠胰腺组织内Y染色体标志物及放射免疫法测定C-肽值。

研究结果显示，大鼠腹腔注射链脲佐菌素后 2 d，血糖水平开始迅速升高，4 d后血糖值大于 16.7 mmol/L，且稳定在21.0 mmol/L左右，注射骨髓间充质干细胞后，血清中C-肽值明显升高，而生理盐水组未予注射骨髓间充质干细胞，C-肽值无明显变化，且生理盐水组中各大鼠胰腺组织中未见黄绿荧光Y染色体标记物存在，而骨髓间充质干细胞组和糖尿病模型组各大鼠胰腺组织中均可见黄绿荧光Y染色体标记物存在，且糖尿病模型组大鼠胰腺组织中黄绿荧光强度较大，Y染色体标记物的数目较多。

刘弘光等^[12]将体外培养的骨髓间充质干细胞移植至糖尿病模型大鼠体内，观察移植后各大鼠的血糖水平变化，结果发现，骨髓间充质干细胞移植3 d后，糖尿病模型大鼠的血糖为(21.84± 3.37) mmol/L，移植7 d后，糖尿病模型大鼠的血糖为(20.90±3.46) mmol/L，移植10 d后，糖尿病模型大鼠的血糖为(18.86±2.80) mmol/L，而未予以骨髓间充质干细胞移植糖尿病模型大鼠始终处于高血糖状态，并无下降趋势。此外，研究中还发现骨髓间充质干细胞移植3 d后，在大鼠胰腺血管周围可见大量BrdU阳性细胞。

孟凡彪^[13]在实验中也对骨髓间充质干细胞进行分离培养，并将培养后的骨髓间充质干细胞注射至糖尿病模型大鼠尾静脉中，监测空腹血糖的变化，利用胰岛素免疫荧光染色评估胰岛的大小。结果发现，骨髓间充质干细胞移植后11 d，糖尿病模型大鼠的空腹血糖水平明显降低，但此后又再次升高。胰岛免疫荧光染色面积增大，损伤的胰岛细胞获得再生。胰腺组织中发现带有标记物的骨髓间充质干细胞，移植的骨髓间充质干细胞移植入胰腺组织内部，获得一定的增殖，但骨髓间充质干细胞本身不表达胰岛素。与胰岛细胞共培养后，能够增加胰岛细胞的表达量。

高斌等^[14]对分离培养骨髓间充质干细胞并注射至糖尿病模型的大鼠进行对比观察，将注射骨髓间充质干细胞的糖尿病模型大鼠与注射生理盐水的糖尿病模型大鼠进行血糖监测比较，结果显示，移植2周后，骨髓间充质干细胞移植治疗糖尿病大鼠血糖为(23.63±6.42) mmol/L，胰岛素水平为(13.89± 7.89) mU/L，生理盐水对照组糖尿病大鼠血糖为(27.96±1.87) mmol/L，胰岛素水平为(11.57± 3.25) mU/L，而正常对照大鼠血糖水平为(7.97± 1.00) mmol/L，胰岛素水平为(33.68±6.21) mU/L。免疫组织化学染色观察可见正常对照大鼠胰岛中心部胰岛细胞的胰岛素为强阳性，细胞内可见深褐色粗大颗粒；生理盐水对照组大鼠可见胰岛及胰岛中心细胞数明显减少，胰岛素反应基本阴性，仅见个别胰岛细胞内出现少量微弱淡黄色细颗粒；而骨髓间充质干细胞移植糖尿病模型大鼠胰岛中心部细胞增多，大部分胰岛素反应阳性或强阳性呈黄色或褐色颗粒。

高赟等^[15]和董庆玉^[16]同样对同种异体骨髓间充质干细胞移植治疗糖尿病大鼠分别进行了研究，研究均显示移植后大鼠的血糖有明显下降趋势，胰岛中增殖细胞明显增多。

2.2 骨髓间充质干细胞与胰岛细胞联合移植治疗糖尿病田烁^[17]、叶永峰^[18]和贾辰乐等^[19]分别对骨髓间充质干细胞与胰岛细胞联合移植治疗糖尿病进行了实验研究。田烁^[17]在实验中选取三四周龄的大鼠，采用密度梯度离心法结合贴壁培养法分离纯化骨髓间充质干细胞，并进行传代扩增，取第4代细胞与胰岛细胞共培养。通过腹腔注射链脲佐菌素破坏胰腺组织设立糖尿病模型大鼠，经大鼠尾静脉分别注射磷酸盐缓冲液、骨髓间充质干细胞、骨髓间充质干细胞和胰岛细胞设立对照组及实验组。

研究结果显示，磷酸盐缓冲液治疗糖尿病模型大鼠血糖较治疗前无明显下降，骨髓间充质干细胞移植治疗糖尿病大鼠和骨髓间充质干细胞与胰岛细胞联合移植治疗糖尿病大鼠在移植后14 d血糖开始下降，且血糖水平与移植前相比较，差异有显著性意义(P < 0.01)，并且骨髓间充质干细胞与胰岛细胞联合移植治疗糖尿病大鼠在移植后血糖下降更明显。

叶永峰^[18]对骨髓间充质干细胞与胰岛细胞共培养进行了实验研究，分离大鼠骨髓间充质干细胞和胰岛，设立共培养组和单独培养组，并进行体外培养，结果显示，随体外培养时间的延长，胰岛与骨髓间充质干细胞混合培养组的存活率与胰岛单独培养组的存活率差异有显著性意义(P < 0.05)，随培养时间延长，胰岛对葡萄糖反应性逐渐减弱，刺激指数从第1天的3.1-3.3降至第7天的1-1.6。此外，研究结果还显示单独胰岛移植治疗(10.2±2.0) d内，血糖可控制在16.7 mmol/L以下，但随后血糖逐渐上升，半量胰岛联合骨髓间充质干细胞移植后(15.2±1.3) d内，血糖能够控制在16.7 mmol/L以下，胰岛联合骨髓间充质干细胞移植后(21.0±1.7) d内，血糖能够控制在16.7 mmol/L以下。胰岛联合骨髓间充质干细胞移植治疗的糖尿病模型大鼠，移植治疗前尾部皮肤存在溃疡病变，移植治疗15 d后，皮毛变光滑，动作敏捷，尾部病变好转。

贾辰乐等^[19]也对骨髓间充质干细胞与胰岛细胞共培养移植治疗糖尿病模型大鼠进行了研究，实验采用密度梯度离心法分离骨髓间充质干细胞，胶原酶消化法分离胰岛细胞，链脲佐菌素制备糖尿病模型大鼠，分别给予糖尿病模型大鼠单纯胰岛细胞移植和胰岛细胞联合骨髓间充质干细胞共移植，并设立生理盐水对照，比较血糖的变化。结果显示，生理盐水对照组糖尿病模型大鼠血糖水平一直较高，移植后1 d，血糖水平为(26.22±3.37) mmol/L，移植后5 d，血糖水平为(24.83±3.97) mmol/L，移植后 15 d，血糖水平为(27.47±2.65) mmol/L；单纯胰岛细胞移植治疗糖尿病模型大鼠，移植后1 d，血糖水平为(8.43±1.34) mmol/L，移植后5 d，血糖水平为(10.46±1.37) mmol/L，移植后15 d，血糖水平为(12.31±1.87) mmol/L；胰岛细胞联合骨髓间充质干细胞共移植治疗糖尿病模型大鼠，移植后1 d，血糖水平为(6.61±1.95) mmol/L，移植后5 d，血糖水平为(7.35±2.03) mmol/L，移植后15 d，血糖水平为(7.71±1.84) mmol/L。骨髓间充质干细胞与胰岛细胞联合移植和单纯胰岛细胞移植后的血糖水平相比较，差异有显著性差异意义。

2.3 国外学者对骨髓间充质干细胞移植以及胰岛细胞移植治疗糖尿病的研究文献举例见表1。

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引言

糖尿病是由于胰岛素缺乏以及不同程度的胰岛素抵抗引起碳水化合物、脂肪、蛋白质代谢紊乱的综合症，使血糖持续处于高水平表达状态。糖尿病主要分为1型糖尿病和2型糖尿病以及其它原因引起的继发性糖尿病。1型糖尿病是一种自身免疫性疾病，由于体内的免疫系统杀死分泌胰岛素的β细胞引起，具有家族遗传性。2型糖尿病是由于体内胰腺组织产生分泌胰岛素的能力下降，甚至丧失，或者发生胰岛素抵抗引起血糖水平增高，2型糖尿病患者多伴有肥胖。目前，糖尿病的治疗主要以降血糖类药物为主，但药物治疗并未取得满意的治疗效果，只是控制血糖的水平，并未从根本上解决胰腺组织胰岛分泌不足的问题。

近年来，随着干细胞研究的迅速发展，干细胞移植治疗糖尿病成为研究的热点。由于其它来源的干细胞增殖能力和分化潜能均有限，并且缺乏明确统一的标志，无鉴定、纯化方法等原因，使其在糖尿病的治疗方面受到不同程度的限制，而骨髓间充质干细胞易于获得、分选和体外培养，具有良好的分化潜能和植入组织能力，成为干细胞移植治疗糖尿病中的主要种子细胞^[1-2]。2003年，Jahr等^[3]首先在低血糖、低血清条件下，诱导骨髓间充质干细胞分化为胰岛素分泌细胞。随后，Oh等^[4]和Tang等^[5]采用不同的方法均成功诱导骨髓间充质干细胞分化为胰岛样细胞。之后，众多学者对此进行了研究，发现骨髓间充质干细胞具有诱导分化胰岛β细胞的能力，在糖尿病的治疗方面表现出巨大的潜力^[6-9]。

目前，国内外研究报道中已经明确骨髓间充质干细胞能够诱导分化为胰岛细胞，但是其对糖尿病的治疗效果如何尚不明确，且骨髓间充质干细胞移植治疗糖尿病仍然处于实验研究阶段，其用于移植治疗糖尿病的机制仍不清楚，尚未被临床医生所应用，因此，对该领域的深入研究具有重要的意义。

文章对骨髓间充质干细胞移植治疗糖尿病以及骨髓间充质干细胞与胰岛细胞共移植治疗糖尿病进行大鼠模型实验研究，从模型大体外观、血糖水平变化以及组织病理观察等方面评估移植治疗效果，以明确骨髓间充质干细胞与胰岛细胞共移植治疗糖尿病的可行性。

材料方法

讨论

骨髓间充质干细胞是干细胞家族的重要成员，来源于发育早期的中胚层和外胚层。骨髓间充质干细胞最初在骨髓中发现，因其具有多向分化潜能、造血支持和促进干细胞植入、免疫调控和自我复制等特点而日益受到人们的关注。如骨髓间充质干细胞在体内或体外特定的诱导条件下，可分化为脂肪、骨、软骨、肌肉、肌腱、韧带、神经、肝、心肌、内皮等多种组织细胞，连续传代培养和冷冻保存后仍具有多向分化潜能，可作为理想的种子细胞用于衰老和病变引起的组织器官损伤修复。骨髓间充质干细胞由于其来源广泛，易于分离培养，并且具有较强的分化潜能和可自体移植等优点而被广泛研究应用。

在移植治疗中，一般情况下，移植物会引起宿主的免疫排斥反应。但对于骨髓间充质干细胞来说却不是这样。实验表明骨髓间充质干细胞可以抑制T细胞的增殖从而导致免疫耐受^[2⁵^-2⁸^]。T细胞与其它细胞的相互作用可以通过混和淋巴细胞反应来观察。被标记的T细胞与其它细胞混合后，如果可以引起T细胞的免疫反应，则可以观察到T细胞的增殖现象。但是，当把骨髓间充质干细胞与T细胞混合后却观察不到T细胞的增殖反应，而且这种现象并不是由于T细胞凋亡或其它的有害作用引起的。因为在去除骨髓间充质干细胞后，这些T细胞仍然可以对其它物质进行免疫反应。此外，使用趋化膜将2种细胞分隔开培养后，骨髓间充质干细胞对T细胞的抑制作用依然存在，表明这种抑制作用可能通过某种可溶性的小分子起作用。另外,除了未分化的骨髓间充质干细胞可以抑制T细胞的增殖外，实验也表明，随着骨髓间充质干细胞的分化，其抗原性并没有随之增加^[2⁹^]。总之，间充质干细胞可以通过某种机制抑制T细胞的成熟来逃避免疫系统的清除。也暗示骨髓间充质干细胞可能在机体免疫系统的调节及骨髓中各种干细胞未分化状态的维持方面起作用。

骨髓间充质干细胞具有其独特的优点，首先骨髓间充质干细胞具有很强的自我更新能力和多向分化潜能；获取方法简单，采用骨髓穿刺或从外周血中提取即可得到骨髓间充质干细胞；体外易增殖，采用合适的纯化、增殖方法可以在6周内增加2×10⁹倍，按此计算，一次骨髓穿刺所获的骨髓间充质干细胞可以在较短时间内增殖到能够满足移植的需要数量；易于基因修饰，可以将外源性基因修饰骨髓间充质干细胞建立一种安全的基因治疗的“细胞载体”；自体骨髓间充质干细胞的应用，避免了免疫排斥的难题且不存在伦理学上的争议问题^[³⁰^-³¹^]。

文章研究显示骨髓间充质干细胞移植以及骨髓间充质干细胞与胰岛细胞联合移植糖尿病大鼠体内后，虽然能够使血糖在一定程度上下降，但是只是短暂性的，并不能永久维持血糖的正常水平状态，表明骨髓间充质干细胞对血糖的影响可能只是暂时性的，在糖尿病持续高血糖状态下植入的细胞很难分化为可分泌胰岛素的细胞，可能与高血糖状态容易导致骨髓间充质干细胞或胰岛β细胞凋亡有关。

尽管近年来对骨髓间充质干细胞的研究取得了很大进展，但仍然存在下列问题有待解决：①骨髓间充质干细胞缺少特异性表面标志物，对其鉴定困难，只能结合其形态和部分表面标志物进行综合判断。目前对于干细胞也仅限于功能上的定义，而没有足够的形态学和表型上存在的证据。因此在分离提取骨髓间充质干细胞时，由于对干细胞的特性尚缺乏足够的了解，使分离方法几乎不可能达到完全纯化。②骨髓间充质干细胞培养过程中的异质性，影响了干细胞分离纯化的效果。长期培养发现，骨髓间充质干细胞多次传代后，并不能保留其分化能力。对于传代后骨髓间充质干细胞分化能力丧失的原因，近来有人认为与端粒酶缺失有关，依据是端粒酶基因敲除后的小鼠骨髓骨髓间充质干细胞，即使是早期的骨髓间充质干细胞也不能分化为软骨细胞和脂肪细胞^[³²^-³³^]。

尽管对骨髓间充质干细胞的特性还有很多未知，但由于骨髓间充质干细胞具有多向分化潜能和高增殖特性，取材容易，对机体损伤小，易于基因操作，组织相容性好等优点，被认为是组织工程和基因工程理想的靶细胞。人们期望把骨髓间充质干细胞运用于临床疾病的治疗，比如心血管疾病、血液系统疾病、神经系统疾病及外科损伤等领域的治疗。在这些领域的研究中有很多已经获得成功，因此骨髓间充质干细胞有着广阔的临床应用前景。

总之，骨髓间充质干细胞与胰岛细胞共移植治疗糖尿病已经给患者带来的希望，对于骨髓间充质干细胞分化为胰岛细胞的机制，以及如何能够长期有效稳定控制血糖均是以后研究中的重点，将胰岛细胞与骨髓间充质干细胞共移植用于糖尿病的治疗，对于胰岛功能重建，血糖长期稳定控制，以及防止并发症的发生等均有重要意义。

骨髓间充质干细胞及与胰岛细胞共移植治疗糖尿病

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