达利珠单抗免疫诱导治疗在肝移植后的应用

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2013.31.004

摘要/Abstract

摘要：

背景：达利珠单抗可与人体内活化T细胞表面的白细胞介素2受体特异性结合，可反映白细胞介素2受体被封闭的程度，进而推断诱导治疗的效果。目前达利珠单抗在肾移植中的应用较成熟，但在肝移植临床应用中尚无共识。
目的：观察接受两剂达利珠单抗诱导治疗的肝移植患者围手术期血清CD25+T及可溶性白细胞介素2受体的表达。
方法：共纳入从2008年1月至2009年1月首次接受同种异体原位肝移植患者58例，随机分为对照组28例和治疗组30例。两组均采用他克莫司、吗替麦考酚酯、皮质类固醇激素三联免疫抑制方案治疗。治疗组于移植中无肝期及移植后第10天分别给予达利珠单抗进行免疫诱导治疗，对照组不接受达利珠单抗的免疫诱导治疗。
结果与结论：流式细胞仪及酶联免疫吸附法检测显示，与对照组相比，治疗组移植后各时间点血清CD25+T表达显著降低(P < 0.01)；治疗组移植中和移植后第1天血清可溶性白细胞介素2受体表达降低(P < 0.05，P < 0.01)；移植后6个月，治疗组急性排斥反应发生率降低(P < 0.01)。证实，达利珠单抗可以有效抑制肝移植患者血清CD25+T的表达，并可在移植后早期抑制血清可溶性白细胞介素2受体的表达，以此降低肝移植后早期急性排斥反应的发生率。

关键词: 器官移植, 肝移植, 达利珠单抗, CD25, 可溶性白细胞介素2受体, 免疫诱导, 急性排斥反应

Abstract:

BACKGROUND: Daclizumab can be specially combined with the inerleukin-2 receptor on the surface of activated T cells in human body, and this method can reflect the close of interleukin-2 receptor thus inferring the effect of induction therapy. At present, the daclizumab has been widely used in renal transplantation, but there is no consensus on its clinical application in liver transplantation.
OBJECTIVE: To investigate the expression of serum CD25+ T cells and soluble interleukin-2 receptor in the patients receiving daclizumab for liver transplantation during perioperative period.
METHODS: A total of 58 patients received orthotopic liver transplant for the first time were included and then the patients were randomly divided into two groups: control group (n=28) and treatment group (n=30). The patients in the two groups were treated with tacrolimus, mycophenolate mofetil and corticosteroids triple immunosuppressive regimen. The patients in the treatment group received immune induction therapy with daclizumab, and the patients in the control group did not receive daclizumab.
RESULTS AND CONCLUSION: Flow cytometry and enzyme-linked immunosorbent assay showed the expression levels of CD25+ T cells in the treatment group were significantly lower than those in the control group at different time points after liver transplantation (P < 0.01); and the expression levels of soluble interleukin-2 receptor in the treatment group were lower than those in the control group during transplantation and at the first day after transplantation (P < 0.05, P < 0.01). At 6 months after transplantation, the incidence of acute rejection was decreased in the treatment group (P < 0.01). The results indicate that daclizumab can effectively suppress the expression level of CD25+T cells, as well as the expression level of soluble interleukin-2 receptor in the peripheral blood in the early stage of liver transplantation, thus effectively reducing the rate of acute rejection.

Key words: organ transplantation, liver transplantation, daclizumab, CD25, soluble interleukin-2 receptor, immune induction, acute rejection

中图分类号:

R318

刘颖，朱志军. 达利珠单抗免疫诱导治疗在肝移植后的应用[J]. 中国组织工程研究, doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.2013.31.004.

Liu Ying, Zhu Zhi-jun. Application of daclizumab as an immune induction therapy after liver transplantation[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.2013.31.004.

图/表（结果） 2

2.1 受试者数量分析按意向性处理分析，纳入对象58例均进入结果分析，无中途退出者。
2.2 受试者基线资料比较见表1。

两组在年龄、体质量、移植前终末期肝病模型(Model for end-stage liver disease，MELD)评分(可以预测终末期肝病的死亡率及移植后的生存时间)、移植前肌酐水平等方面差异无显著性意义(P > 0.05)，均具可比性。
2.3 肝移植患者血清CD25+T的表达流式细胞仪检测显示，对照组和治疗组移植前血清CD25+T的表达差异无显著性意义(P > 0.05)，移植中至移植后21 d各时间点治疗组CD25+T的表达较对照组明显下降(P < 0.01)，见表2。

两组移植前血清可溶性白细胞介素2受体水平差异无显著性意义(P > 0.05)。治疗组在给予首剂达利珠单抗后移植中和移植后第1天血清可溶性白细胞介素2受体水平比对照组明显下降(P < 0.05或P < 0.01)。移植后3-21 d，两组血清可溶性白细胞介素2受体水平差异无显著性意义(P > 0.05)。
2.5 肝移植后患者急性排斥反应发生率移植后6个月，对照组中有4例在观察期内经病理证实发生轻-中度急性排斥反应(14.29%)，经甲强龙冲击治疗后恢复。治疗组患者未发生急性排斥反应(0%)。
Fisher精确概率检验结果显示，治疗组急性排斥反应发生率低于对照组(P < 0.01)。
2.6 肝移植后患者肝功能恢复情况两组移植移植前及移植后3周内谷丙转氨酶、谷草转氨酶浓度差异无显著性意义(P > 0.05)。治疗组谷丙转氨酶恢复至正常值范围时间为(12.50±5.95) d，对照组为(16.60±3.85) d；治疗组谷草转氨酶恢复至正常值范围时间为(6.50±5.32) d，对照组为(7.80±3.56) d，两组移植肝功能恢复时间差异无显著性意义(P > 0.05)。
2.7 肝移植后患者的感发生率治疗组未出现过敏反应，也未出现应用其他单克隆抗体出现的细胞因子释放综合征。对照组中有5例患者发生感染，其中肺感染4例，腹腔感染1例；治疗组中有5例发生感染，肺感染4例，胆道感染2例，其中1例为肺感染合并胆道感染。
对照组感染的发生率为62.5%，治疗组为50%，两组差异无显著性意义(P > 0.05)。

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引言

合理有效的免疫诱导方案对肝移植后早期移植物功能的恢复及急性排斥反应的预防至关重要。但是不同移植中心的免疫诱导方案存在差异，对移植中及移植后是否应用达利珠单抗进行诱导亦存在较大争议[1-2]。
异体移植物抗原刺激人体免疫系统，由免疫细胞产生的细胞因子白细胞介素2能与经抗原活化的T淋巴细胞表面的白细胞介素2受体相结合，诱导T淋巴细胞的快速增殖，产生排斥反应。达利珠单抗是一种重组的人源化抗Tac(CD25)抗体，可以特异性抑制T淋巴细胞介导的免疫反应。T细胞表面白细胞介素2 受体由α，β，γ共3个亚单位组成，大多数T细胞、B细胞和NK细胞表面存在白细胞介素2 受体β和γ共2个亚单位，而α亚单位，又称Tac或CD25仅表达于激活T淋巴细胞表面[3]。作为白细胞介素2的受体，CD25与白细胞介素2结合后，虽不能传导信息，但能启动T细胞进入有丝分裂期[4]。在受体内，由于异体移植物刺激人体免疫系统，由免疫细胞如T细胞及NK细胞产生的细胞因子白细胞介素2能与经抗原活化的T淋巴细胞表面的受体(CD25+T)相结合，诱导T细胞的快速增殖，产生排斥反应。达利珠单抗的功能类似于白细胞介素2受体拮抗剂，与活化的T细胞表面表达的白细胞介素2受体复合物的α亚单位高特异性结合，从而抑制白细胞介素2介导的T淋巴细胞激活，阻断了排斥反应过程中细胞免疫的关键通道[5]。
可溶性白细胞介素2受体是由细胞分泌或从细胞膜表面脱落的白细胞介素2受体的α链，在T淋巴细胞激活的早期释放，其水平升高与体内淋巴细胞处于高激活状态有关，是淋巴细胞被活化敏感的可溶性指标。同时可溶性白细胞介素2受体仍具有与白细胞介素2结合的能力，可与膜表面白细胞介素2受体竞争结合白细胞介素2，阻断白细胞介素2依赖的免疫反应，抑制已活化的T细胞克隆性扩增，控制过强的免疫反应，在许多疾病如恶性肿瘤、自身免疫性疾病、器官移植中可以明显升高，是人体免疫反应和免疫调节的重要物质[6]。达利珠单抗可以与人体内活化的T细胞表面的白细胞介素2受体特异性结合，由于抗体与受体的结合，脱落于血清中的可溶性白细胞介素2受体减少，故监测其水平可以反映白细胞介素2受体被封闭的程度，进而推断诱导治疗的效果[7]。
目前达利珠单抗在肾移植的应用中已取得了较成熟的经验[8]，但在肝移植的临床应用中尚无被广泛认同的治疗方案，因此制定一个合理有效的免疫诱导治疗方案是需进一步探索的问题[9]。实验从达利珠单抗的作用机制入手，通过测定血清CD25+T的表达水平及可溶性白细胞介素2受体水平的变化，了解两剂达利珠单抗对CD25+T及白细胞介素2受体的封闭效果，探讨达利珠单抗的药效学特性，为临床制定合理的免疫诱导方案提供参考与依据。

材料方法

设计：回顾性病例分析。

时间及地点：实验于2008年1月至2009年7月在天津市第一中心医院实验室完成。

对象：实验所选病例为天津市第一中心医院移植中心2008年1月至2009年1月首次接受同种异体原位肝移植的成人患者共58例，用随机数字表法分为2组：对照组28例，移植前诊断原发性肝癌12例，慢性肝炎后肝硬变14例；治疗组30例，移植前诊断原发性肝癌15例，慢性肝炎后肝硬变15例。

入选患者均为同ABO血型移植，移植前巨细胞病毒、EB病毒、人类免疫缺陷病毒血清及病原学检测均为阴性，无结核活动史，无其他特殊感染病史。治疗均采用经典非转流式原位肝移植，病肝整体切除，供肝肝上、肝下下腔静脉与受体腔静脉行端端吻合，门静脉、肝动脉、胆总管采用端端吻合。

根据中华人民共和国国务院颁发的《医疗机构管理条例》^[10]，在实验前将实验方案和风险告知对方，并签署知情同意书。

纳入标准：①年龄18-75岁，性别不限。②入选治疗组病例必须完成两剂达利珠单抗注射，并且至少观察至移植后21 d。③入选病例必须具有良好的依从性，能配合药物调整及进行检查。④入选病例未使用可能影响实验结果的其他治疗方法。

排除标准：①未能完成两剂达利珠单抗注射的病例。②使用了抗胸腺球蛋白、OKT3、巴利昔单抗等作为免疫诱导的病例。③有严重的糖尿病或其他代谢性疾病不能应用他克莫司至观察期结束的病例。④对吗替麦考酚酯不能耐受，如出现严重的胃肠道症状、白细胞减少而在观察期内停药的病例。

达利珠单抗的药效学特性检测的试剂及仪器：

方法：

达利珠单抗的给药方案：对照组未接受达利珠单抗诱导治疗。治疗组接受两剂达利珠单抗诱导治疗，第1剂于移植中无肝期给予，第2剂于移植后第10天给予。给药剂量按体质量< 75 kg者，每剂50 mg；体质量≥75 kg者，每剂75 mg，静脉给药。

两组均接受他克莫司、吗替麦考酚酯、皮质类固醇激素联合抗排斥治疗，如果病理证实发生急性排斥反应，给予甲强龙冲击治疗。

标本的采集：两组分别于移植前、移植中(新肝血流开放即刻)、移植后1，3，5，7，10，14，21 d采集血标本。

将新鲜的全血用生理盐水按1∶1稀释混匀；在 10 mL淋巴细胞分离管中加入3 mL葡聚糖/泛影酸钠细胞分离液，将稀释后的全血用滴管缓慢贴壁加入到细胞分离液上层，用滴管缓慢贴壁加入到盛有2 mL淋巴细胞分离液的试管中，放入水平离心机中，室温下以2 000 r/min离心20 min。

用吸管取出位于血浆层和分离液层之间的单个核细胞层(白膜层)，置于1个洁净的5 mL试管中，加入PBS，用振荡混匀器混匀，放入离心机中，室温下以2 000 r/min离心5 min。离心后弃去上清液，剩余的细胞液用振荡器混匀，再加入PBS 2 mL，室温下2 000 r/min离心5 min。离心后弃去上清液，用振荡混匀器混匀。加入PBS制成细胞悬液并将细胞浓度调整为1×10⁹ L^-¹待用。

肝移植患者血清CD25⁺T表达水平的检测：取2支FALCON管，分别标记为对照管(-)和标本管(+)；在阳性上样管中分别加入CD3-PE单抗、CD25-FITC单抗各20 μL，阴性上样管中加入同型阴性对照IgG1-PE、IgG1-FITC各20 μL，将混匀的细胞悬液分别加入2个上样管中，每管100 μL，振荡器混匀后室温避光孵育30 min。加入2 mL的PBS，室温下以300×g离心5 min，弃上清；加入多聚甲醛悬浮细胞。加入PBS 2 mL后振荡器混匀，室温下2 000 r/min离心5 min。弃去上清液后再加入缓冲液重复洗涤1次。加入多聚甲醛固定 10 min后，用流式细胞仪分析。

全部数据用流式细胞仪(美国BD公司)进行双色荧光参数获取和分析。根据前向散射光和侧向散射光二维Dot-plot图中，划出淋巴细胞区，检测标本管CD3-PE/CD25-FITC双阳性细胞群所占比例，并以阴性对照管作对照，以确定细胞染色的特性，每管获取细胞10⁴个。计数CD3⁺T细胞上表达CD25的细胞百分数，即为CD25⁺T表达的检测结果。

肝移植患者血清可溶性白细胞介素2受体水平检测：采取静脉非抗凝血4 mL，静置2 h，待其析出血清后，使用离心机2 000 r/min 离心5 min，提取上层血清后置-20 ℃冻存待测。

待标本采集完成后统一利用抗可溶性白细胞介素2的ELISA试剂盒(法国Diaclone公司)检测。结果数据以吸光度值做纵坐标，以可溶性白细胞介素2标准浓度做横坐标建立一线性标准曲线，测定每一样本的浓度值(mg/L)。

主要观察指标：记录移植后患者的急性排斥反应发生情况、移植肝功能恢复情况、肝移植患者血清CD25⁺T和可溶性白细胞介素2受体的表达、感染发生情况及药物不良反应。

统计学分析：计量资料用x(_)±s表示，计数资料用率表示，应用SPAW18.0软件进行数据分析。组间均数差异的比较采用独立样本t检验、配对样本样本t检验。组间计数资料的比较采用χ²检验和Fisher精确概率检验，P < 0.05为差异有显著性意义。

讨论

白细胞介素2在器官移植受者人群的免疫功能网络中具有至关重要的免疫调节作用。该细胞因子由激活的T淋巴细胞产生，激活和维持免疫反应^[11]。达利珠单抗与激活的T细胞表面表达的白细胞介素2受体复合物的α亚单位高特异性结合,从而竞争性抑制白细胞介素2与白细胞介素2受体结合，抑制白细胞介素2依赖的T细胞克隆性增生的“瀑布”式程序^[5]，能够有效地从免疫反应机制上降低急性排斥反应的发生率。

3.1 达利珠单抗可以有效地抑制CD25⁺T的表达实验结果显示，对照组和治疗组移植前CD25⁺T的表达水平分别为(6.43±4.42)%和(4.77±3.13)%。对照组CD25⁺T的表达水平在移植移植后第3天开始升高，移植后第7天达到最高水平，约为移植前的3倍，之后缓慢下降，至移植后第21天仍高于移植前水平，说明移植受体体内T淋巴细胞接触抗原递呈细胞提呈的移植肝脏的异体主要组织相容性复合体(major histocompatibility complex，MHC)后，T淋巴细胞识别外来抗原并产生一定程度的活化，使T细胞表面白细胞介素2受体的表达增加，从而更加有利于第三信号因子白细胞介素2的结合，实现T细胞的增殖^[12]。

实验显示，治疗组从移植中到移植后21 d各时间点CD25⁺T的表达水平与对照组比较明显降低。治疗组在给予首剂达利珠单抗后移植中CD25⁺T的表达水平就有明显下降，直到第2剂达利珠单抗给药之前CD25⁺T始终呈低水平表达(<1%)，给予两剂达利珠单抗后CD25的表达水平在移植后3周内呈现明显的抑制状态，与移植前CD25表达水平比较明显降低。结果说明，达利珠单抗可以有效地抑制CD25⁺T的表达水平，从而竞争性抑制白细胞介素2与白细胞介素2受体的结合，阻断第三信号的转导，抑制白细胞介素2依赖的T细胞增殖，从而防止急性排斥反应的发生。

3.2 达利珠单抗对血清可溶性白细胞介素2受体的抑制作用在实验中对照组与治疗组移植前血清中可溶性白细胞介素2受体水平差异无显著性意义。两组患者移植前血清中可溶性白细胞介素2受体水平比正常人群明显升高，可能与患者移植前原发病导致人体免疫状态紊乱有关。和对照组比较，治疗组在给予首剂达利珠单抗后移植中和移植后第1天血清可溶性白细胞介素2受体水平明显下降，移植中可溶性白细胞介素2受体水平下降更加明显。说明达利珠单抗在移植后早期对白细胞介素2受体有较强的封闭作用，从而使脱落到血清中的可溶性白细胞介素2受体减少。

在实验中，治疗组血清可溶性白细胞介素2受体的水平与T细胞CD25的表达水平没有明显相关性，与给药后T细胞CD25的持续低表达不同，可溶性白细胞介素2受体的浓度上升较快，约在移植后第3天上升至移植前水平，在移植后第7天升至最高水平后缓慢下降，于移植后14 d降至移植前水平。在给予第2剂达利珠单抗后血清可溶性白细胞介素2受体的浓度有所下降，但下降幅度不大，不如第一剂给药后下降明显。而在移植后第3-21天内治疗组和对照组比较并无统计学差异。达利珠单抗对血清可溶性白细胞介素2受体的抑制作用不如对T细胞CD25表达水平的抑制作用明显，推测可能与人体自身免疫调节有关，因为可溶性白细胞介素2受体可与膜白细胞介素2受体竞争结合白细胞介素2，起到抑制活化T细胞克隆性扩增的作用，可以控制过强的免疫反应。另外T细胞CD25的表达水平与血清可溶性白细胞介素2受体在预示急性排斥反应的发生上哪个指标更加敏感有待进一步研究证明^[13]。

3.3 达利珠单抗能降低移植后6个月发生急性排斥反应的风险 Eckhoff等^[14]在97例肝移植患者的研究中其中39例应用两剂达利珠单抗，首剂以2 mg/kg在移植前24 h内给予，第2剂以1 mg/kg在移植后第5天给予，同时联合他克莫司+环孢素A+激素免疫抑制，发现两剂达利珠单抗组与对照组相比，移植后6个月内急性排斥反应发生率有明显下降。Sellers等^[15]对209例接受两剂达利珠单抗诱导治疗的肝移植患者进行回顾性研究，移植后6个月达利珠单抗组急性排斥反应的发生率较对照组低。实验结果显示治疗组未发生排斥反应，而对照组有4例病例发生急性排斥，与Sellers等^[15]报道结果相一致。

3.4 两剂达利珠单抗的应用对CD25⁺T的封闭作用可以持续到移植后21 d甚至更长时间在肝移植免疫抑制方案中两剂达利珠单抗的诱导治疗一直作为主导方案，但是给药间隔时间并不统一。在同种异体肾移植受者中，达利珠单抗清除半衰期较长，平均大约480 (270- 919) h，与人类IgG相似^[6-19]。

在一组肝移植的临床研究中(n=28)，该药的半衰期是99 h，全身清除率是57 mL/h^[20]，认为与肝移植患者腹水及移植中失血较多，造成达利珠单抗的流失有关，所以有人认为应缩短给药间隔。实验首剂达利珠单抗于移植中无肝期给予，可以一定程度上减少因失血和放腹水造成的药物流失，延长达利珠单抗的清除半衰期及对CD25⁺T的封闭时间。

在本次实验中，治疗组给予首剂达利珠单抗后对CD25⁺T的有效封闭作用可以持续到第2剂给药前，即移植后9-11 d，在给予第2剂达利珠单抗后对CD25⁺T的封闭作用可以维持到移植后21 d，这一时间段正是急性排斥反应的高发时段。

实验在给予第2剂达利珠单抗时CD25⁺T的表达仍处于较低水平，提示可以适当延迟第2剂达利珠单抗的给药时间，这样可以避免使患者处于过度免疫抑制的状态，同时延长两剂达利珠单抗对CD25⁺T的封闭时间和效果，更符合卫生经济学效益。

达利珠单抗可以有效地抑制CD25⁺T的表达水平，使CD25⁺T的表达在移植后3周内始终维持在较低水平。达利珠单抗对移植后早期血清可溶性白细胞介素2受体水平有明显抑制作用，有效地降低移植移植后早期急性排斥反应的发生率；达利珠单抗未增加移植移植后感染性疾病的发生风险。常规三联免疫抑制剂虽然有较强的免疫抑制作用，但存在一定的毒不良反应，如：他克莫司有神经毒性和肾毒性，皮质类固醇激素会增加感染的风险及肿瘤等原发病的复发。

因此，在这次实验的基础上可以进一步探讨是否可以在移植后早期应用达利珠单抗减少或替代其他免疫抑制剂的应用，从而在不增加排斥反应的前提下减少肾损害及感染的风险。