Bio-gide胶原膜体外复合培养犬骨髓间充质干细胞的软骨分化

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2013.29.004

中国组织工程研究 ›› 2013, Vol. 17 ›› Issue (29): 5282-5289.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.2013.29.004

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Bio-gide胶原膜体外复合培养犬骨髓间充质干细胞的软骨分化

谢辉¹，杨飞^{1, 2}，赵德伟¹，王本杰¹，崔大平¹，王威¹，黄诗博¹

¹大连大学附属中山医院骨一科，辽宁省大连市 116001；²贵州省遵义医学院，贵州省遵义市 563000

收稿日期:2013-02-04 修回日期:2013-02-22 出版日期:2013-07-22 发布日期:2013-07-22
通讯作者: 赵德伟，大连大学附属中山医院骨一科，辽宁省大连市 116001 xiehui424@163.com
作者简介:谢辉★，男，1984年生，安徽省宿州市人，汉族，2012年大连大学毕业，硕士，主要从事骨与关节损伤研究。并列第一作者：杨飞★，男，1986年生，山东省临沂市人，汉族，遵义医学院在读硕士，医师，主要从事骨与关节损伤研究。
基金资助:
国家科学自然基金支持项目(30970699)：不同应力刺激对犬坏死股骨头自身修复影响的实验研究

Chondrocyte differentiation of dog bone marrow mesenchymal stem cells co-cultured with Bio-gide collagen membrane in vitro

Xie Hui¹, Yang Fei^{1, 2}, Zhao De-wei¹, Wang Ben-jie¹, Cui Da-ping¹, Wang Wei¹, Huang Shi-bo¹

¹First Department of Orthopedics, Affiliated Zhongshan Hospital of Dalian University, Dalian 116001, Liaoning Province, China; ²Zunyi Medical University, Zunyi 563000, Guizhou Province, China

Received:2013-02-04 Revised:2013-02-22 Online:2013-07-22 Published:2013-07-22
Contact: Zhao De-wei, First Department of Orthopedics, Affiliated Zhongshan Hospital of Dalian University, Dalian 116001, Liaoning Province, China xiehui424@163.com
About author:Xie Hui★, Master, First Department of Orthopedics, Affiliated Zhongshan Hospital of Dalian University, Dalian 116001, Liaoning Province, China Yang Fei★, Studying for master’s degree, Physician, First Department of Orthopedics, Affiliated Zhongshan Hospital of Dalian University, Dalian 116001, Liaoning Province, China; Zunyi Medical University, Zunyi 563000, Guizhou Province, China Xie Hui and Yang Fei contributed equally to this paper
Supported by:
the National Natural Science Foundation of China, No. 30970699*

摘要/Abstract

摘要：

背景：应用组织工程方法修复股骨头坏死后的软骨损伤应解决的2个关键因素是种子细胞和支架材料。
目的：探讨Bio-gide胶原膜体外与犬骨髓间充质干细胞复合成软骨的可行性。
方法：采用全骨髓血离心法结合贴壁筛选法体外分离培养比格犬骨髓间充质干细胞，观察细胞形态学变化，以细胞表面抗原进行鉴定。采用成软骨诱导培养基诱导第3代骨髓间充质干细胞向软骨细胞分化作为实验组，设置普通培养基培养对照组，MTT比色法测试软骨细胞生长曲线，并行Ⅱ型胶原免疫组织化学和甲苯胺蓝染色等生物学鉴定。将第3代骨髓间充质干细胞与Bio-gide胶原膜体外复合培养行倒置相差显微镜、扫描电镜观察。
结果与结论：采用全骨髓血离心法结合贴壁筛选法获得了高纯度高活性的骨髓间充质干细胞，生长状态良好，扩增能力强，并成功诱导分化为软骨细胞。大量骨髓间充质干细胞在Bio-gide胶原膜上贴附增殖并复层生长，细胞与Bio-gide胶原膜逐渐融为一体；在胶原膜的断面可见胞体伸出突起相互连接包绕胶原膜，其间有明显细胞基质分泌。表明犬骨髓间充质干细胞可在Bio-gide胶原膜上生长并向软骨细胞分化。

关键词: 生物材料, 组织工程软骨材料, 膜生物材料, 骨髓间充质干细胞, Bio-gide胶原膜, 组织工程, 股骨头坏死, 软骨缺损, 种子细胞, 国家科学自然基金

Abstract:

BACKGROUND: Seed cells and scaffold are two key factors for cartilage defects after osteonecrosis of femoral head using tissue-engineered method.
OBJECTIVE: To explore the feasibility of Bio-gide collagen membrane combined with dog bone marrow mesenchymal stem cells into chondrocytes.
METHODS: Bone marrow mesenchymal stem cells were isolated from beagle dogs by whole bone marrow blood centrifugation method and adherence screening method in vitro and cultured. Morphological changes in cells were observed, and identification was done using cell surface antigens. Bone marrow mesenchymal stem cells of passage 3 were induced by chondrocyte induction medium to differentiate into chondrocytes (experimental group). Cells cultured in normal medium were considered as control group. 3-(4, 5-Dimethylthiazol-2-yl) 2, 5-diphenyl tetrazolium bromide assay was used to measure growth curve of chondrocytes. Cells underwent type Ⅱ collagen immunohistochemistry and toluidine blue staining. The coculture of bone marrow mesenchymal stem cells at passage 3 and Bio-gide collagen membrane were observed under an inverted phase contrast microscope and scanning electron microscope.
RESULTS AND CONCLUSION: Bone marrow mesenchymal stem cells with high purity and high viability were obtained by whole bone marrow blood centrifugation method and adherence screening method. Cells grew well
and had strong amplified ability, and successfully differentiated into chondrocytes. Numerous bone marrow mesenchymal stem cells adhered on the Bio-gide collagen membrane, showing a tendency of multi-layer growth. Cells and Bio-gide collagen membrane seem to blend into an integrant part. Cell processes appeared and connected each other and gradually wrapped the Bio-gide collagen membrane, with the presence of obvious cell matrix secretion. These results suggested that bone marrow mesenchymal stem cells can grow and differentiate into chondrocytes on the Bio-gide collagen membrane.

Key words: biomaterials, tissue-engineered cartilage bone materials, membrane biomaterials, bone marrow mesenchymal stem cells, Bio-gide collagen membrane, tissue engineering, osteonecrosis of the femoral head, cartilage defects, seed cells, National Natural Science Foundation of China

中图分类号:

R318

谢辉，杨飞，赵德伟，王本杰，崔大平，王威，黄诗博. Bio-gide胶原膜体外复合培养犬骨髓间充质干细胞的软骨分化[J]. 中国组织工程研究, 2013, 17(29): 5282-5289.

Xie Hui, Yang Fei, Zhao De-wei, Wang Ben-jie, Cui Da-ping, Wang Wei, Huang Shi-bo. Chondrocyte differentiation of dog bone marrow mesenchymal stem cells co-cultured with Bio-gide collagen membrane in vitro[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2013, 17(29): 5282-5289.

图/表（结果） 5

2.1 骨髓间充质干细胞的镜下形态 倒置显微镜下骨髓间充质干细胞形态学观察：原代培养16-24 h首次换液，可见有少数单个核细胞贴壁铺伸，呈短小梭形或多角形，培养液中仍有较多悬浮细胞。

72 h贴壁细胞增多，呈散在或集落分布，细胞多为梭形，细胞核圆形或椭圆形，胞浆内含较多颗粒，并可形成突起，悬浮细胞随换液次数增多逐渐减少。培养七八天细胞增殖加快，并逐渐融合成片。10-12 d，细胞融合达95%以上，呈漩涡状、辐射状排列，形态以长梭形为主，可传代，见图1A-C。

传代后细胞生长速度较快，接种3.0-4.0 h已见细胞贴壁生长，见图1D，经二三天缓慢生长后进入对数增长期，七八天细胞融合90%以上可传下一代。各代细胞形态较为均一，为长梭形紧密排列，相互交织成网状生长。

2.2 MTT法测绘骨髓间充质干细胞生长曲线 第1，2，3，4，5代细胞生长曲线显示细胞生长具有一些共同特点：传代后36-48 h处于潜伏期，第3天左右开始进入对数生长期，约在第7天进入生长平台期。同一时间点，第3代细胞增殖速度较第1，2，4，5代稍快，对数期持续时间也相对较长，因此考虑各项生物学指标选取第3代处于对数生长期细胞检测，见图2。

第3代细胞 CD44、CD90阳性，CD34阴性，成纤维细胞、造血细胞及内皮细胞表达特异性抗原CD34，说明所获得细胞不是成纤维细胞、造血细胞及内皮细胞。

2.4 体外软骨细胞诱导分化结果及生物学鉴定 取第3代生长良好的骨髓间充质干细胞向软骨细胞诱导分化，可见软骨细胞呈梭形，圆形，多角形相互交织生长，见图4A，B。

诱导7天后可见Ⅱ型胶原免疫组化呈阳性反应，细胞外基质内可见大量絮状棕褐色着色，诱导21 d后，阳性细胞数较多，阳性反应较明显。甲苯胺蓝染色诱导组细胞第7天即呈阳性反应，细胞内外见较多深蓝色斑块状着色，细胞相互交织成网状，第14天时阳性反应更明显，见图4C，D。原代至第4代甲苯胺蓝染色均匀一致，呈强阳性，第5代软骨细胞染色较淡，也呈阳性表达，但较第4代之前明显减弱。原代软骨细胞Ⅱ型胶原免疫染色强阳性，以后第1-4代表达仍较强，第5代开始逐渐减弱，可见细胞内棕黄色颗粒沉淀，见图4E，F。MTT比色法检测第2代关节软骨细胞生长情况，其生长曲线如下第2天起软骨细胞即进入指数生长期，至第6天进入平台期，第8天开始进入抑制期，见图5。

2.5 骨髓间充质干细胞与Bio-gide胶原膜的复合培养结果 选取生长状态良好的第3代骨髓间充质干细胞，接种于Bio-gide胶原膜复合培养，细胞接种21 h后部分伸展开来呈纤维状。随培养时间延长，细胞数目增多，移行于材料周边，形成膜状结构，并可观察到分泌的细胞外基质。透射电镜观察：空白Bio-gide胶原膜表面及断面可见粗细不等的胶原纤维结构，其间有一定的孔隙，见图6A。复合培养后，骨髓间充质干细胞在胶原膜支架上密度较高，细胞增殖连接成复层，与Bio-gide胶原膜逐渐融为一体；在胶原膜的断面可见胞体伸出突起相互连接包绕胶原膜，其间有明显细胞基质分泌，见图6B。

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引言

材料方法

设计：细胞学体外观察实验。

时间及地点：于2011年7至12月在大连大学附属中山医院辽宁省重点实验室-干细胞实验室完成。

材料：

主要试剂与仪器：

实验动物：6月龄健康雄性比格犬，体质量25-30 kg，由大连医科大学实验动物中心提供，动物质量合格证号10005，实验过程中对动物的处置符合动物伦理学标准。

实验方法：

犬骨髓间质干细胞的分离及培养：选取健康比格犬1只，30 g/L戊巴比妥钠按30 mg/kg静脉麻醉，麻醉成功后在50 mL无菌注射器中预吸2mL抗凝液(抗凝液制备：10.5 mL的DMEM中加入肝素1支，12 500 U/L，即2 mL，得肝素浓度为1 000 U/mL)，分别在双侧股骨近端用16号骨髓穿刺针穿刺骨髓，每侧抽取4 mL，采用全骨髓法分离细胞，将所取骨髓液至15 mL离心管中，1 500 r/min离心10 min，弃上清液，加入无菌的PBS 10 mL， 1 200 r/min离心5 min，弃上清，加入12 mL培养基，用滴管吹打均匀；接种于25 cm²的培养瓶，每瓶4 mL，恒温箱进行培养(培养条件：37 ℃、体积分数5%CO₂、饱和湿度)；培养液主要成分包括 DMEM-低糖培养液、体积分数10%的胎牛血清、青霉素及链霉素各100 IU/mL等，pH值为7.2。原代培养24 h首次换液，除去血细胞及未贴壁的细胞，此后每3 d更换培养液1次，直到增殖达到融合，倒置显微镜下观察细胞生长及形态特征^[8]。

犬骨髓间充质干细胞的生长曲线测定：MTT法测绘第1，2，3，4，5代细胞生长曲线。0.25%胰酶消化融合达 90%以上的第1，2，3，4，5代，以1.0×10⁷ L^-1细胞浓度接种于96孔培养板内，每孔加入细胞悬液200 μL。从第0-8天，固定时间取3孔加入5 g/L的MTT液20 μL，每次均做空白对照。孵育4 h后，弃上清液，每孔加入 150 μL DMSO，振荡10 min，使结晶物充分溶解，酶联免疫检测仪波长490 nm处测A值并绘制生长曲线^[9]。

细胞免疫荧光鉴定骨髓间充质干细胞^[10]：取生长良好的第3代细胞，以1×10⁷L^-1的浓度接种于24孔板(内置经多聚赖氨酸包被的盖玻片)，培养5 d后，待细胞接近长成单层时取出盖玻片，PBS清洗，40 g/L多聚甲醛固定 10 min，体积分数3%过氧化氢消除内源性过氧化物酶，PBS清洗，分别滴加自带荧光抗体CD90、CD34、CD44(浓度均为1∶10)37 ℃孵育2 h，甘油封固，荧光显微镜下观察并拍照。

向软骨细胞诱导分化及生物学鉴定：取第2代骨髓间充质干细胞向软骨细胞诱导分化，实验组以成软骨诱导培养基培养，培养条件：1 mmol/L 丙酮酸钠、0.1 mmol/L 左旋维生素C、0.1 nmol/L 地塞米松、10 μg/L 转化生长因子β3、6.25 U/mL 重组人胰岛素、6.25 mg/L 转铁蛋白、6.25 μg/L亚硒酸、1.25 μg/L牛血清白蛋白、 5.35 mg/L亚油酸。对照组以普通培养基(含体积分数20%胎牛血清的DMEM/LG培养液)进行培养。

MTT比色法测试软骨细胞生长曲线^[11-12]：取实验组细胞用胰蛋白酶消化后以5.0×10⁴/孔接种于96孔培养板，共8组，每组7个复孔。培养24 h时开始，每日取1组加入 5 g/L MTT 20 μL，37 ℃、体积分数为5%CO₂、饱和湿度孵育4 h，弃上清，加二甲基亚砜 200 μL/孔，振荡 10 min后测吸光度值，波长为490 nm，连续8 d。以培养时间为横轴，吸光度值为纵轴，绘制生长曲线。

Ⅱ型胶原免疫组织化学^[13]：取两组爬满细胞的玻片，加入体积分数95%乙醇固定，滴加体积分数3%H₂O₂，室温封闭10 min，滴加山羊血清封闭液1滴，在37 ℃温箱内孵育15 min；吸去多余液体，滴加兔抗人Ⅰ抗 50 μL，4 ℃过夜；吸去细胞爬片表面液体，PBS漂洗；滴加生物素标记山羊抗兔IgG二抗1滴，37 ℃温箱孵育15 min；再行滴加辣根标记链霉卵白素工作液1滴， 37 ℃温箱孵育，DAB显色。避光依次滴加DAB缓冲液(A液)、底物(B液)及显色剂(C液体)，方法参照SABC试剂盒、DAB显色操作方法进行；树胶封固，镜下观察软骨细胞染色情况。

甲苯胺蓝染色：将培养甁中细胞的培养液吸去；D-hank’s液3-5 mL漂洗二三次，每次3 min，轻轻吹打；加入体积分数70%乙醇3 mL，固定30 min；倒去瓶中的乙醇，D-hank’s液3-5 mL，漂洗二三次，每次2 min；每瓶加入甲苯胺蓝乙醇液3 mL，染色20 min；D-hank’s液3-5 mL漂洗3-5次，每次3 min，直至洗出D-hank’s液未见甲苯胺蓝乙醇液染色为止。倒置显微镜下观察各代软骨细胞甲苯胺蓝染色情况并照相记录。

骨髓间充质干细胞与Bio-gide胶原膜的复合培养：选取生长状态良好的第3代骨髓间充质干细胞，用0.25%胰蛋白酶消化，重悬为单细胞悬液，调整细胞浓度为5× 10⁹L^-1，接种到预置Bio-gide胶原膜(每块胶原膜平均剪切为约0.5 cm²大小)的24孔板中，每个孔1 mL，以后每 3 d换液1次。置于37 ℃、体积分数5%CO₂孵箱中行倒置相差显微镜观察。于21 d将骨髓间充质干细胞/ Bio-gide胶原膜取出，分别进行苏木精-伊红染色、胶原蛋白染色、扫描电镜及透射电镜观察。

主要观察指标：①观察骨髓间充质干细胞形态学变化及鉴定结果。②软骨细胞生长曲线。③Ⅱ型胶原免疫组织化学和甲苯胺蓝染色等生物学鉴定结果。④骨髓间充质干细胞与Bio-gide胶原膜体外复合培养倒置相差显微镜、扫描电镜观察结果。

统计学分析：应用IBM SPSS 17.0分析软件对各组数据进行方差分析。取α < 0.05，P < 0.05为差异有显著性意义。

讨论

股骨头坏死是由于股骨头血供中断或受损，引起骨细胞及骨髓成分死亡和随后的修复，继而发生股骨头结构的改变，导致软骨下骨和关节面软骨的塌陷，关节功能丧失，产生关节疼痛，具有发病率高、致残率高的特点^[14]。Sekiya等^[15]通过关节镜观察股骨头坏死软骨表现，并以关节软骨的形态表现为基础将其分为6个时期：正常关节软骨、关节软骨表面出现裂纹、可复性关节软骨凹陷、关节软骨面塌陷、关节软骨剥脱、软骨下骨外露及髋臼软骨面出现退变。股骨头坏死继发关节软骨的改变，骨坏死后骨组织碎裂、塌陷，关节软骨失去支撑，即出现塌陷、退变、破坏。因为关节假体的使用寿命年限及以后面临多次翻修的问题，都促使各种保留股骨头的治疗方式被探索和研究，其目的是避免或延缓股骨头坏死进展到终末期。目前髓芯减压、骨瓣修复、植骨等治疗方法即使能减轻骨内高压，改善血运，恢复股骨头的外形，但因为这些手术不重视修复关节软骨，可能导致保头修复术后股骨头坏死继续进展^[16]。股骨头缺血性坏死软骨缺损修复的主要目的就是保持股骨头关节面的完整，预防或阻止软骨下骨微骨折的发生，延缓及避免股骨头塌陷，进而为行保头治疗提供一种新的思路和方法，为年轻患者带来新的希望。一直以来关节软骨缺损修复问题是骨科临床的重要课题之一。应用组织工程方法去修复股骨头坏死后软骨损伤包含两个必须的关键因素-种子细胞和支架材料。

种子细胞研究是骨组织工程学的重要内容，早在20世纪70年代，Friedenstein等在骨髓标本中首次发现骨髓间充质干细胞，它是存在于哺乳动物骨髓中具有间叶组织特性的干细胞，正常情况下大多处于休眠状态，而在病理或外因诱导下可表现出不同程度的再生、分化能力。Hartman等^[4]将那些具多向分化潜能的细胞称作骨髓多能基质干细胞，又称作骨髓间充质干细胞。有研究则应用骨髓间充质干细胞与星形胶质细胞共培养方法诱导骨髓间充质干细胞分化为神经元。Wakitani等^[6]将这些细胞植入小鼠的腹腔或肾脏包膜，发现可以形成骨样和软骨样的组织。Nevo等^[5]比较不同干细胞对关节软骨缺损的移植修复效果，发现自体骨髓间充质干细胞的成功率为100%，异体肢芽和异体胚胎来源的骨髓间充质干细胞为75%，而异体骨髓间充质干细胞仅为31%。Wakitani等^[6]在1994年首先报道了用体外纯化培养的自体骨髓间充质干细胞，以Ⅰ型胶原为载体修复兔膝关节软骨大面积缺损，收到一定疗效。

实验选择犬的骨髓间充质干细胞作为种子细胞，从骨髓穿刺获得，避免损伤供体完整的血管结构。先采用全骨髓血培养法培养，继而采用贴壁筛选纯化，方法简便，所获细胞数量及纯度满意，并在体外成功诱导分化出软骨细胞，实验证明是一种经济高效的方法。同时实验结果表明骨髓间充质干细胞在体外生长状态良好，扩增能力强，可表达较高的碱性磷酸酶活性，具有统计学上的显著性差异；经各种鉴定可以显示骨髓间充质干细胞具有较高的活性，并能成功诱导分化为软骨细胞。因此，骨髓间充质干细胞可以作为骨坏死后软骨组织工程理想种子细胞。但如何直接介入软骨缺损区，从而有效促进软骨细胞生长和缺损组织得到修复再生有待进一步研究。

目前软骨组织工程中Ⅰ型胶原作为多种组织，如骨、皮肤、肌腱及其他结缔组织的天然细胞外基质，其结构非常有利于培养中细胞的黏附、增殖和分化，能被细胞的酶识别，可重塑及降解，为新生组织提供足够的空间，而且外源性胶原还能刺激细胞分泌形成新的胶原基质。而Ⅲ型胶原通常是伴随着Ⅰ型胶原出现的。较常用的Ⅰ/Ⅲ型胶原膜应用于MACI种植，即基质诱导的自体软骨细胞移植，MACI技术是目前惟一的正在进行随机对照试验评估的第3代细胞载体，在欧洲和澳大利亚自1998年以来已开展 6 000 多例移植的临床研究^[17-35]。实验所采用的细胞支架材料为瑞士Geistlich公司生产的Bio-gide胶原膜，这是一种由Ⅰ型和Ⅲ型胶原组成复合材料，分为致密层和疏松层，种子细胞接种在胶原膜较为粗糙的疏松层，而光滑的致密层在体内实验中朝向关节腔，作为一种可吸收、降解的双层生物膜，具有以下优点：具有纤维网架结构，利于固定于软骨缺陷部位，Ⅰ型胶原是以粗纤维形式存在的，赋予组织较强的抗张能力，以细纤维形式存在的Ⅲ型胶原可以形成细网络，赋予组织较强的可扩张能力^[36]；软骨组织的基本成分含有胶原，与膜材料相似；可被细胞酶类识别、标记、降解，其降解速率与骨软骨生长速度相匹配；可以刺激移植物组织产生新的胶原，并且降解产物可被机体吸收，4-6个月可在体内完全吸收^[9]；多层胶原膜填充相比海绵材料具有足够的生物力学强度及抗压能力，能够保护种植的细胞^[37]。多层次胶原结构有利于骨髓间充质干细胞的黏附、生长及向软骨细胞的分化，三维立体培养有助于诱导生成的软骨细胞维持表型^[38]。

实验研究将骨髓间充质干细胞与Bio-gide胶原膜进行体外复合培养，构建细胞/生物载体支架材料复合物，为今后采用骨髓间充质干细胞作为软骨组织工程的种子细胞应用于软骨缺损再生修复的可能性提供依据，并探讨Bio-gide胶原膜作为软骨组织工程支架材料的可行性。研究结果表明将骨髓间充质干细胞与Bio-gide胶原膜体外复合培养，Bio-gide胶原膜的孔隙率为60%-70%，行形态学观察，通过电镜观察发现骨髓间充质干细胞在胶原膜表面复层生长，密度较高，生长状态良好；通过透射电镜观察骨髓间充质干细胞可以长入生物膜内，其间有明显基质分泌，促进软骨细胞再生。显示Bio-gide胶原膜与骨髓间充质干细胞有良好的生物相容性，有望成为骨髓间充质干细胞的支架材料应用于软骨组织工程研究。但能否体内构建组织工程软骨组织，促进软骨细胞的生长，缺损的软骨组织得到完整的修复，尚待进一步研究。

总之，实验结果表明，构建软骨组织工程在股骨头坏死软骨缺损的修复再生方面有着巨大潜力，但仍有许多问题亟待解决：种子细胞的选择，增殖纯化，分化的机制及信号调节，理想的细胞/生物载体支架材料复合物的构建；完善的软骨组织工程动物实验模型的建立等，这些问题也是今后进行软骨组织工程研究的重点。随着软骨组织工程学的不断发展，最终可能实现股骨头坏死区软骨缺损的修复，预防软骨下骨发生微骨折，延缓股骨头坏死区的塌陷，从而为进行保留股骨头延缓股骨头塌陷治疗带来新的曙光。

Bio-gide胶原膜体外复合培养犬骨髓间充质干细胞的软骨分化

Chondrocyte differentiation of dog bone marrow mesenchymal stem cells co-cultured with Bio-gide collagen membrane in vitro

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