深低温冻存羟基磷灰石/骨髓间充质干细胞修复兔桡骨缺损

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2013.25.010

中国组织工程研究 ›› 2013, Vol. 17 ›› Issue (25): 4629-4636.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.2013.25.010

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深低温冻存羟基磷灰石/骨髓间充质干细胞修复兔桡骨缺损

邢志远^{1, 2}，张继波²，孔令菊²，刘建生²，郑德宇²

1 盘锦市中心医院骨科，辽宁省盘锦市 124000
2 辽宁医学院解剖学教研室，辽宁省锦州市 121001

收稿日期:2013-02-18 修回日期:2013-05-17 出版日期:2013-06-18 发布日期:2013-06-18
通讯作者: 郑德宇，博士，教授，硕士生导师，辽宁医学院解剖学教研室，辽宁省锦州市 121001 zdy4673349@163.com
作者简介:邢志远★，男，1969年生，辽宁省营口市人，汉族，2012年辽宁医学院毕业，硕士，副主任医师，主要从事骨关节外科研究。
基金资助:
实验获得辽宁省教育厅一般项目的支持 (L2011144)。

Combination of cryopreserved hydroxyapatite/bone marrow mesenchymal stem cells repairs rabbit radial defects

Xing Zhi-yuan^{1, 2}, Zhang Ji-bo², Kong Ling-ju², Liu Jian-sheng², Zheng De-yu²

1 Department of Orthopedics, Municipal Central Hospital of Panjin, Panjin 124000, Liaoning Province, China
2 Department of Anatomy, Liaoning Medical University, Jinzhou 121001, Liaoning Province, China

Received:2013-02-18 Revised:2013-05-17 Online:2013-06-18 Published:2013-06-18
Contact: Zheng De-yu, M.D., Professor, Master’s supervisor, Department of Anatomy, Liaoning Medical University, Jinzhou 121001, Liaoning Province, China zdy4673349@163.com
About author:Xing Zhi-yuan★, Master, Associate chief physician, Department of Orthopedics, Municipal Central Hospital of Panjin, Panjin 124000, Liaoning Province, China; Department of Anatomy, Liaoning Medical University, Jinzhou 121001, Liaoning Province, China
Supported by:
the Educational Bureau of Liaoning Province, No. L2011144

摘要/Abstract

摘要：

背景：以往研究表明羟基磷灰石复合骨髓间充质干细胞具有良好的骨缺损修复效果，但这种复合材料在冻存后是否具有骨缺损修复效果还不清楚。
目的：观察深低温冻存羟基磷灰石/骨髓间充质干细胞复合修复骨缺损的效果。
方法：制备27只日本大耳白兔桡骨10 mm缺损模型，随机分为冻存复合材料组、新鲜复合材料组与羟基磷灰石组，3组分别于骨缺损处植入-80 ℃保存3个月的羟基磷灰石/同种异体骨髓间充质干细胞复合物、新鲜制备的羟基磷灰石/同种异体骨髓间充质干细胞复合物及单纯羟基磷灰石，植入后8，12周行大体观察、X射线观察及苏木精-伊红染色等组织学观察，并于12周行生物力学检测。
结果与结论：术后12周，冻存复合材料组、新鲜复合材料组骨缺损大部分愈合，有成熟骨小梁通过，有的可见髓腔通畅，塑形较好；羟基磷灰石组骨痂生成少，骨缺损部分愈合，塑形欠佳，新骨生成少于冻存复合材料组、新鲜复合材料组(P < 0.05)。冻存复合材料组、新鲜复合材料组最大载荷明显大于羟基磷灰石组(P < 0.05)。表明低温冻存羟基磷灰石/骨髓间充质干细胞复合植骨材料的骨缺损修复能力与新鲜制作的复合材料几乎一致，未因冻存受到影响。

关键词: 生物材料, 骨组织构建, 羟基磷灰石, 骨髓间充质干细胞, 支架材料复合物, 低温冻存, 桡骨缺损, 省级基金

Abstract:

BACKGROUND: Previous studies have showed that hydroxyapatite combined with bone marrow mesenchymal stem cells has a good effect on bone defects, but the repair effect of cryopreserved composite material is unclear.
OBJECTIVE: To observe the effect of cryopreserved hydroxyapatite/bone marrow mesenchymal stem cells on bone defects.
METHODS: Twenty-seven Japanese rabbits were used to prepare 10 mm radial defect models and then randomly divided into cryopreserved composite group, fresh composite group and hydroxyapatite group. The three groups were respectively implanted with cryopreserved hydroxyapatite/bone marrow mesenchymal stem cells which were cryopreserved at -80℃ for 3 months, fresh hydroxyapatite/bone marrow mesenchymal stem cells and pure hydroxyapatite. After 8 and 12 weeks, general observation, X-ray observation and hematoxylin-eosin staining were performed, and biomechanical test was done at 12 weeks.
RESULTS AND CONCLUSION: At postoperative 12 weeks, bone defects were almost healed in the cryopreserved composite group and fresh composite group. Mature trabecular bone was seen, some canals were of patency, and good shape was found. While in the hydroxyapatite group, callus formation was less, only part of bone defects were healed, shaping was poor, and new bone formation was also less than the other two groups (P < 0.05). In addition, the maximal loading in the cryopreserved composite group and fresh composite group was significantly higher than that in the hydroxyapatite group (P < 0.05). These findings indicate that the cryopreserved hydroxyapatite/bone marrow mesenchymal stem cells composite material is similar to the fresh one in the repair capacity.

Key words: biomaterials, bone tissue construction, hydroxyapatite, bone marrow mesenchymal stem cells, composite scaffold materials, cryopreservation, radial defects, provincial grants-supported paper

中图分类号:

R318

邢志远，张继波，孔令菊，刘建生，郑德宇. 深低温冻存羟基磷灰石/骨髓间充质干细胞修复兔桡骨缺损[J]. 中国组织工程研究, 2013, 17(25): 4629-4636.

Xing Zhi-yuan, Zhang Ji-bo, Kong Ling-ju, Liu Jian-sheng, Zheng De-yu. Combination of cryopreserved hydroxyapatite/bone marrow mesenchymal stem cells repairs rabbit radial defects[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2013, 17(25): 4629-4636.

图/表（结果） 5

2.1 实验动物数量分析 27只2月龄日本大耳白兔均进入结果分析。

2.2 原代骨髓间充质干细胞的培养 接种前3 d原代培养的细胞并没有明显贴壁，从第4天开始，在培养瓶底部能看到一些多角形的细胞或分散存在或聚在一起，见图1A。此后的1周内细胞数量开始逐渐增加，直到14 d左右，细胞相互融合到一起，多平行排列，细胞呈长梭形，见图1B。

细胞传代后生长速度较原代培养快，约8 d能达到80%融合。流式细胞仪检测结果显示：培养的第3代兔骨髓间充质干细胞均一表达CD44、CD90及CD105，阳性率分别为94.23%，86.23%及96.24%；而CD34、CD45呈阴性，阳性率分别为1.36%及1.45%，结合他人文献可以认为实验获得的细胞主要为间充质干细胞。

2.3 羟基磷灰石复合成骨诱导后骨髓间充质干细胞构成的复合植骨材料 见图2。成骨诱导的骨髓间充质干细胞与多孔羟基磷灰石共培养7 d后，扫描电镜可见骨髓间充质干细胞在多孔羟基磷灰石表面伸出了突起，相互接触，彼此连接成片，有的细胞已经伸入到羟基磷灰石的孔隙内。在部分骨髓间充质干细胞之间有丝状纤维连接，在细胞表面也可见到有大小不等的白色钙质颗粒，见图2B。复合植骨材料冻存复苏后，多孔羟基磷灰石的表面及孔隙内骨髓间充质干细胞状态与冻存前并没有明显区别，细胞也没有从羟基磷灰石表面脱落的趋势，见图2C。

2.4 复合材料原位成骨结果 术后所有动物全身状况良好，正常进食。切口无红肿及渗出液，部分动物术区周围有一定程度肿胀，虽未进行特殊处理这些肿胀也逐渐自行消退。无动物死亡，所有动物均计入实验统计。

大体观察：术后8周，冻存复合材料组植骨材料两端均有骨痂生长，断端仍然清晰可见，桡骨及支架材料周围软组织未见充血、变性及坏死表现；其中冻存复合材料组和新鲜复合材料组的支架材料均无移位；羟基磷灰石组有部分标本支架材料可轻微活动。术后12周，冻存复合材料组和新鲜复合材料组植骨材料完全被骨样组织包裹，并形成连续性骨痂，塑形较好；羟基磷灰石组支架材料与自体骨间界限模糊，结合处被骨痂包绕，在某些植骨材料的表面多为纤维样组织包裹。

X射线观察：术后8周，冻存复合材料组和新鲜复合材料组复合植骨材料与自体骨两端交错，可见少量骨痂，断端可见；羟基磷灰石组几乎未见骨痂，断端清晰，见图3。术后12周，冻存复合材料组和新鲜复合材料组可见支架材料与自体骨融合，材料的密度与正常骨相似，有连续性骨痂通过断端，皮质骨形成，髓腔通畅，塑形良好；羟基磷灰石组断端变模糊，骨痂量少，塑形欠佳，仍可见部分支架，见图4。

组织学观察：术后所有时间点在材料周围均未发现明显的炎性细胞浸润情况。术后8周，冻存复合材料组和新鲜复合材料组复合植骨材料开始降解，在材料边缘有大量类骨质形成，材料内部可见新生的骨岛形成，偶可见小血管，新骨形成增多；而羟基磷灰石组的复合材料内很少见到骨岛形成，仅在材料的边缘形成一薄层的骨组织，大部分为纤维结缔组织，见图5。术后12周，冻存复合材料组和新鲜复合材料组支架材料与自体骨之间可见大量新生骨组织，有规则骨小梁通过，局部可见有少量皮质骨形成，内部可见小血管；羟基磷灰石组支架材料与自体骨间也见新生骨组织，但较少且骨质薄，中间的空隙多数为纤维结缔组织相连，近骨断端侧有骨小梁形成，但尚没有与羟基磷灰石表面组织形成有效连接、贯通，见图6。

2.5 各组生物力学检测结果 术后12周，分别取3组各4只动物前肢行最大载荷比较，其中冻存复合材料组(178.00±22.34) N和新鲜复合材料组(191.67±24.01) N载荷明显较羟基磷灰石组大(87.67±21.22) N (P < 0.05)，但与正常桡骨(248.00±28.58) N比较，还有很大差距。

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引言

临床上创伤、肿瘤及感染等疾患引起的大块骨缺损相当普遍^[1-4]，骨缺损治疗一直是骨科难题之一^[5-8]，国内外学者进行了广泛的实验与临床实践。目前的骨修复技术主要集中在自体骨移植、同种异体骨移植和人工合成生物材料充填等。自体骨移植治疗骨缺损因为疗效最佳仍是“金标准” ^[9]，但其取材有限，并且它以牺牲正常骨组织为代价达到修复病损组织的目的，因此也造成取材部位新的损伤，还有可能出现并发症，如骨感染、骨痛、局部畸形等。随着人们生活质量的提高，对自身保护及形体美观的要求也越来越高，同种异体骨移植给人们带来了新的希望，其生物力学有着与自体骨相似的特点，也可通过骨性愈合被自体骨替代，完成骨重建和修复作用，通过实验和临床应用人们注意到异体皮质骨仍不同于自体骨，连接部位愈合缓慢，爬行替代时间长[10]。此外，异体骨移植还存在发生免疫排斥反应及传播疾病等缺陷。

应用骨组织工程方法构建人工植骨材料是修复大面积骨缺损的有效方法^[11-12]。在骨组织工程中载体支架材料是首先要面临的一个问题。现在常用的支架材料包括人工合成或天然无机材料、人工合成生物大分子材料及天然生物衍生材料等，人工合成或天然无机材料有羟基磷灰石、β-磷酸三钙等。其中羟基磷灰石作为正常骨组织中的无机成分，被研究的最早也最多。羟基磷灰石具有良好的骨传导作用和生物相容性，与骨细胞复合具有骨诱导能力；许多实验室证明单独或复合应用羟基磷灰石均能有效修复骨缺损，既包括承重骨也包含不承重骨的修复；其不足之处是降解性稍差，脆性大，很长时间才能完成骨“爬行”替代，使得新生骨改建困难。人工合成生物大分子材料如聚乙酸、聚乙交酯、聚乳酸、聚乳酸共聚物等，具有易成形、生物相容性、可降解性等优点，但细胞在生长过程中受到它们酸性降解产物的影响，故其应用受到极大影响。天然生物衍生材料如壳聚糖、胶原、纤维蛋白等都含有细胞外基质成分，具有组织相容性好、孔隙结构优良等特点。无论应用哪种支架材料，都需要与种子细胞复合才能更好地达到促进骨缺损愈合的作用。但根据骨组织工程方法，从设计、细胞培养等到最后获得组织工程骨需要复杂的过程，体外构建需要一定的时间，不能满足临床上即刻应用骨缺损修复的要求^[13-18]。同时，随着组织工程研究的深入，组织工程产品的产业化、市场化的需要使其保存也成为新的研究课题，探索标准化的保存方法，研究组织工程骨的有效保存技术对组织工程开发和临床应用至关重要^[19-23]。以往研究中有低温保存颅骨骨瓣修复颅骨缺损获得成功的报道^[24-27]。

实验拟低温保存自行构建的羟基磷灰石/骨髓间充质干细胞修复兔桡骨缺损，探讨深低温冻存下的羟基磷灰石支架材料复合物修复骨缺损的能力以及深低温保存支架材料复合物的可行性。

材料方法

设计：对比观察动物实验。

时间及地点：于2011年4月至2012年1月在辽宁医学院解剖实验室完成。

材料：

实验动物：2月龄健康日本大耳白兔27只，体质量 2 kg，雌雄不拘，随机分为3组，每组9只；日本大耳白乳兔5只，均由辽宁医学院动物实验中心提供。

深低温冻存羟基磷灰石/骨髓间充质干细胞修复兔桡骨缺损实验的主要试剂及仪器：

Main reagents and instruments:

实验方法：

骨髓间充质干细胞的分离培养及鉴定^[28-29]：无菌条件下从1 d龄健康乳兔股骨和胫骨中分离培养骨髓间充质干细胞，用完全培养基(按青霉素200 U/mL、链霉素 200 g/g、DMEM、体积分数15%FBS自行制备)冲洗减去两端骨骺的骨干，所得冲洗液1 200 r/min离心10 min，吸弃上清，所得细胞沉淀以1×10⁹L^-1浓度接种于3 cm培养皿中，于37 ℃、体积分数5%CO₂条件下的培养箱内进行培养，72 h半量换液，以后每2 d换液1次。待细胞相互融合达80%生长面积时，用0.25%胰蛋白酶进行第，1次传代培养。取第3代生长状态良好细胞，0.25%胰酶消化，4 ℃，1 000 r/min离心5 min，用PBS清洗细胞3次，计数细胞，各管依次加入单克隆抗体CD34，CD44，CD45，CD90，CD105，同时每管样品设立同型阴性对照，避光冰上孵育45 min，用PBS洗涤细胞3次，除去未结合抗体，重悬细胞于PBS中，进行流式细胞仪检测分析行间充质干细胞鉴定。

骨髓间充质干细胞的成骨诱导：选择传3代对数生长期的骨髓间充质干细胞，加入成骨诱导培养基(完全培养基内含50 mg/L维生素C、10^-8 mol/L地塞米松、10 mmol/L β-磷酸甘油钠)进行诱导培养15 d，诱导过程中进行常规的传代培养。

复合植骨材料的构建：取10⁶个成骨诱导的骨髓间充质干细胞约1 mL，与预先用DMEM培养液浸泡24 h的无菌羟基磷灰石柱(长1 cm，直径为4 mm)共培养7 d，应用扫描电镜观察骨髓间充质干细胞在羟基磷灰石表面的形态、生长状况及胶原分泌情况。

复合植骨材料的冻存与复苏：将培养1周的支架细胞材料复合物移入含有DMEM保存液(含10% DMSO、体积分数20% FBS)的冻存管中，于4 ℃环境预冷1 h后，将冻存管置于-80 ℃冰箱中保存3个月。3个月后取出冻存管，快速置于37 ℃水浴箱中快速复温至保存液完全融化，置于37 ℃、体积分数5%CO₂饱和湿度条件下培养过夜。应用扫描电镜观察部分标本骨髓间充质干细胞在羟基磷灰石表面的形态、生长状况。

实验动物造模及复合支架移植^[30]：将健康2月龄大耳白兔应用100 g/L水合氯醛按3 mL/kg进行麻醉，先取1/2量行耳缘静脉注入，视情况腹腔注射剩余量。麻醉成功后将动物俯卧，四肢固定在手术台上。严格无菌条件下双侧前臂中段外侧纵行切口，切开皮肤、皮下，显露桡骨中段，截除10 mm的桡骨及骨膜造成骨缺损。在无菌条件下分别应用冻存后复苏的复合材料(冻存复合材料组)、新鲜制备的复合材料(新鲜复合材料组)和单纯羟基磷灰石(羟基磷灰石组)修复兔桡骨缺损。术后前3 d连续肌注青霉素80×10⁴U/d，分2次注射。

分别于术后8，12周处死动物进行大体观察、X射线检测和苏木精-伊红染色检测。于术后12周分别取3组各4侧动物前肢，在万能试验机上进行三点抗弯曲负荷测试。

主要观察指标：各组骨缺损区大体形态、X射线、组织学及三点抗弯曲负荷检测结果。

统计学分析：采用SPSS 16.0软件包进行统计学处理，实验数据以x(_)±s表示；组间计量资料行配对t 检验，P < 0.05为差异有显著性意义。

讨论

应用自体骨是修复骨缺损的金标准^[31-34]，但由于各种原因造成的大范围骨缺损难以获得足够的自体骨缺损修复材料^[35-37]。应用组织工程方法可获得较理想的骨缺损修复材料^[38-39]，但从组织工程骨的设计到获得能应用的人工植骨材料需要一个漫长的过程，不能满足即刻应用的目的^[40-42]。所以部分研究者和临床工作者开始将目光转向组织工程骨的保存上^[43-44]。虽然临床上有应用冻存自体颅骨骨瓣修复的报道^[45-47]，但对于组织工程骨的报道较少。实验室以往研究表明，应用原代培养的自体或异体骨髓间充质干细胞首先在体外与羟基磷灰石复合后，形成人工植骨材料，应用这一植骨材料修复颅骨缺损和桡骨缺损均取得了良好的效果^[48-49]。根据检索的信息，植骨材料的保存及即刻应用问题也成为解决组织工程骨临床应用的首要问题。实验室制作的各种人工植骨材料在低温冷冻保存后是否还具有骨缺损修复效果尚不清楚。为此实验根据实验室以往的方法制作人工植骨材料，通过扫描电镜等检测发现成骨诱导后的骨髓间充质干细胞在羟基磷灰石表面生长良好，并且有少量白色颗粒状物质形成，这与实验室早期结果一致。这种骨缺损修复材料在-80 ℃冻存3个月复苏培养后，可见成骨诱导后的骨髓间充质干细胞在羟基磷灰石表面附着良好，并没有因为冷冻保存而影响其活性。应用冻存后材料修复桡骨缺损，分别于术后8周和12周，大体观察发现，人工植骨材料与桡骨缺损周围连接良好，并没有出现骨不连现象，应用X射线检测发现与对照组相比，冷冻保存的人工植骨材料与新制成人工植骨材料的骨缺损修复的效果是一致的。说明从X射线的表现上，冷冻保存的植骨材料可以用于骨缺损的修复。苏木精-伊红染色方法初步证实冻存后植骨材料的骨缺损修复效果与新构建植骨材料的骨缺损修复效果相似，明显优于单纯羟基磷灰石的修复效果。在12周取骨缺损修复后的桡骨进行最大载荷实验，检测结果也与上述实验结果一致，应用冻存后材料修复的桡骨载荷与新构建的植骨材料一致，说明应用低温冻存方法可简单有效地保存羟基磷灰石支架材料复合物，可满足临床上即刻应用的要求。

低温冻存技术的发展在许多新的领域具有很大的发展空间和潜力，但也有许多关键环节需要更深入的探讨^[51-52]。实验仅对深低温冻存3个月的支架材料复合物进行初步研究，未来需要研究延长冻存时间或增加冻存保护剂或改变冻存方式(玻璃化冻存)等，尹宏宇等^[53]实验证明，对于组织工程骨而言玻璃化冻存是更具有发展潜力的深低温保存方法。蓝旭等^[54]研究了冻存保护剂对低温保存的组织工程骨修复骨缺损的影响，发现选择适宜的冻存保护剂对组织工程骨的生物活性有一定的保护作用。随着科学实验和技术的发展，研究各类细胞、组织、器官的低温耐受性和生物材料传热规律的成熟^[55-58]，减轻损伤的技术最终会实现器官的低温保存。

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应用自体骨是修复骨缺损的金标准，但由于各种原因造成的大范围骨缺损难以获得足够的自体骨缺损修复材料。应用组织工程方法可获得较理想的骨缺损修复材料，但从组织工程骨的设计到获得能应用的人工植骨材料需要一个漫长的过程，不能满足即刻应用的目的。所以部分研究者和临床工作者开始将目光转向组织工程骨的保存上。虽然临床上有应用冻存自体颅骨骨瓣修复的报道，但对于组织工程骨的报道较少。实验室以往研究表明，应用原代培养的自体或异体骨髓间充质干细胞首先在体外与羟基磷灰石复合后，形成人工植骨材料，应用这一植骨材料修复颅骨缺损和桡骨缺损均取得了良好的效果。根据检索的信息，植骨材料的保存及即刻应用问题也成为解决组织工程骨临床应用的首要问题。实验室制作的各种人工植骨材料在低温冷冻保存后是否还具有骨缺损修复效果尚不清楚。为此实验根据实验室以往的方法制作人工植骨材料，通过扫描电镜等检测发现成骨诱导后的骨髓间充质干细胞在羟基磷灰石表面生长良好，并且有少量白色颗粒状物质形成，这与实验室早期结果一致。这种骨缺损修复材料在-80℃冻存3个月复苏培养后，可见成骨诱导后的骨髓间充质干细胞在羟基磷灰石表面附着良好，并没有因为冷冻保存而影响其活性。应用冻存后材料修复桡骨缺损，分别于术后8周和12周，大体观察发现，人工植骨材料与桡骨缺损周围连接良好，并没有出现骨不连现象，应用X射线检测发现与对照组相比，冷冻保存的人工植骨材料与新制成人工植骨材料的骨缺损修复的效果是一致的。说明从X射线的表现上，冷冻保存的植骨材料可以用于骨缺损的修复。苏木精-伊红染色方法初步证实冻存后植骨材料的骨缺损修复效果与新构建植骨材料的骨缺损修复效果相似，明显优于单纯羟基磷灰石的修复效果。在12周取骨缺损修复后的桡骨进行最大载荷实验，检测结果也与上述实验结果一致，应用冻存后材料修复的桡骨载荷与新构建的植骨材料一致，说明应用低温冻存方法可简单有效地保存羟基磷灰石支架材料复合物，可满足临床上即刻应用的要求。

深低温冻存羟基磷灰石/骨髓间充质干细胞修复兔桡骨缺损

Combination of cryopreserved hydroxyapatite/bone marrow mesenchymal stem cells repairs rabbit radial defects

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