动员血管内皮祖细胞促进真皮支架移植区的血管新生

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2013.24.003

中国组织工程研究 ›› 2013, Vol. 17 ›› Issue (24): 4386-4393.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.2013.24.003

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动员血管内皮祖细胞促进真皮支架移植区的血管新生

张炜¹，蔡第心²，汪虹²，朱永翠²

1皖南医学院弋矶山医院烧伤科，安徽省芜湖市 214000
2昆明医科大学第二附属医院烧伤科，云南省昆明市 650101

收稿日期:2012-10-30 修回日期:2013-01-14 出版日期:2013-06-11 发布日期:2013-06-11
通讯作者: 汪虹，硕士生导师，主任医师，昆明医科大学第二附属医院烧伤科，云南省昆明市 650101 ynwh631015@sina.com
作者简介:张炜★，男，1986年生，安徽省马鞍山市人，汉族，2012年昆明医科大学毕业，硕士，医师，主要从事创面修复研究。 jlve@163.com
基金资助:
国家自然科学基金(30760260)；云南省科技计划项目(2007C247M)

Angiogenesis of dermal scaffold transplantation zone promoted by moboilizing endothelial progenitor cells

Zhang Wei, Cai Di-xin, Wang Hong, Zhu Yong-cui

1 Department of Burn, the First Affiliated Hospital of Wannan Medical College, Wuhu 214000, Anhui Province, China
2 Department of Burn, the Second Affiliated Hospital of Kunming Meidical University, Kunming 650101, Yunnan Province, China

Received:2012-10-30 Revised:2013-01-14 Online:2013-06-11 Published:2013-06-11
Contact: Wang Hong, Master’s supervisor, Chief physician, Department of Burn, the Second Affiliated Hospital of Kunming Meidical University, Kunming 650101, Yunnan Province, China ynwh631015@sina.com
About author:Zhang Wei★, Master, Physician, Department of Burn, the First Affiliated Hospital of Wannan Medical College, Wuhu 214000, Anhui Province, China jlve@163.com
Supported by:
National Natural Science Foundation of China, No. 30760260*; Science and Technology Planning Project of Yunnan Province, No. 2007C247M*

摘要/Abstract

摘要：

背景：近年研究发现促红细胞生成素可以动员自体骨髓中的血管内皮祖细胞至外周血，趋化其至创面，促进创面血管新生。
目的：观察促红细胞生成素对血管内皮祖细胞动员效果的时效关系。
方法：不同剂量促红细胞生成素通过腹腔注射7 d动员小鼠血管内皮祖细胞，以注射生理盐水作为对照，采用流式细胞仪定点检测外周血中内皮祖细胞数量以比较动员效果，优选安全有效的促红细胞生成素动员剂量，并观察促红细胞生成素动员内皮祖细胞对脱细胞猪皮移植区血管新生的影响。
结果与结论：在开始注射后1，3，5，7，10，14 d等6个时间点内，生理盐水对照组外周血内皮祖细胞无明显变化，促红细胞生成素动员组外周血内皮祖细胞逐渐增加，于7 d达到高峰。高剂量促红细胞生成素动员组内皮祖细胞比例较低剂量组增加明显，促红细胞生成素动员组促进脱细胞猪皮移植区血管新生的效果明显强于对照组。结果可见，促红细胞生成素连续7 d腹腔注射能增加外周血内皮祖细胞的数量，在动员后第7天时达到高峰，效果成剂量依赖性，并能促进脱细胞猪皮移植区血管新生。

关键词: 组织构建, 血管组织构建, 血管内皮祖细胞, 促红细胞生成素, 脱细胞猪皮, 真皮支架, 血管新生, 组织工程皮肤, 国家自然科学基金

Abstract:

BACKGROUND: In recent years, erythropoietin is found to mobilize autologous vascular endothelial progenitor cells from the bone marrow to peripheral blood, which are moved to the wound and promote wound angiogenesis and wound healing ultimately.
OBJECTIVE: To observe the effect of erythropoietin on the mobilization of vascular endothelial progenitor cells.
METHODS: The vascular endothelial progenitor cells were mobilized by intraperitoneal injection of erythropoietin with different concentrations for 7 days, and the cells injected with normal saline were as control. The number of endothelial progenitor cells in the peripheral blood was detected with flow cytometry to compare the mobilization effect. The safe and effective erythropoietin mobilization dose was selected to observe the effect of erythropoietin- mobilized endothelial progenitor cells on the angiogenesis of the dermal scaffold transplantation zone.
RESULTS AND CONCLUSION: In 1, 3, 5, 7, 10 and 14 days after injection, there was no significant change in the number of endothelial progenitor cells in the peripheral blood of the normal saline group, while the number of endothelial progenitor cells in the peripheral blood of the erythropoietin mobilization group was increased gradually and reached peak at 7 days after injection. The proportion of endothelial progenitor cells was significantly increased in the high-dose erythropoietin mobilization group when compared with the low-dose erythropoietin mobilization group. The erythropoietin mobilization group had better effect on the angiogenesis in the dermal scaffold transplantation zone than the control group. Consecutive intraperitoneal injection of erythropoietin for 7 days can increase the number of endothelial progenitor cells in the peripheral blood that reaches peak at 7 days after mobilization. The mobilization effect is in a dose-dependent manner, and the injection can promote the angiogenesis in the dermal scaffold transplantation area.

Key words: tissue construction, vascular tissue construction, endothelial progenitor cells, erythropoietin, acellular porcine dermis, dermal scaffold, angiogenesis, tissue-engineered skin, National Natual Science Foundation of China

中图分类号:

R318

张炜，蔡第心，汪虹，朱永翠. 动员血管内皮祖细胞促进真皮支架移植区的血管新生[J]. 中国组织工程研究, 2013, 17(24): 4386-4393.

Zhang Wei, Cai Di-xin, Wang Hong, Zhu Yong-cui. Angiogenesis of dermal scaffold transplantation zone promoted by moboilizing endothelial progenitor cells[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2013, 17(24): 4386-4393.

图/表（结果） 6

2.1 实验动物基本情况 各组小白鼠体毛有光泽，反应敏捷，饮食正常，无意外死亡。

2.2 第一阶段实验CD133/FLK-1双荧光阳性细胞比例及变化趋势 生理盐水对照组在6个时间点双荧光阳性细胞比例差异均无显著性意义(P > 0.05)。低剂量促红细胞生成素动员组与高剂量促红细胞生成素动员组于动员后1，3，5 d双荧光阳性细胞比例逐渐增加，且于7 d达到高峰。自动员3 d起，各时间点3组间双荧光阳性细胞比例差异均有显著性意义(P < 0.05)；高剂量促红细胞生成素动员组双荧光阳性细胞比例较低剂量促红细胞生成素动员组和生理盐水对照组增加明显 (P < 0.05)；低剂量促红细胞生成素动员组双荧光阳性细胞比例较生理盐水对照组增加明显(P < 0.05)，见表1和图1。

2.3 第二阶段实验CD133/FLK-1双荧光阳性细胞比例及变化趋势 生理盐水对照组在3个时间点双荧光阳性细胞比例差异均无显著性意义(P > 0.05)；促红细胞生成素动员组各时间点组间双荧光阳性细胞比例差异均有显著性意义(P < 0.05)。促红细胞生成素动员组动员后3 d的双荧光阳性细胞比例逐渐增加且于7 d达到高峰。促红细胞生成素动员组双荧光阳性细胞比例较生理盐水对照组增加明显(P < 0.05)。行脱细胞猪皮移植未引起这种变化趋势改变，见表2和图2。

促红细胞生成素动员组外周血中CD133，FLK-1双阳性细胞含量在动员第7天达到高峰。两组流式细胞检测的二维点阵图对比明显，图示为第二阶段实验流式细胞检测的二维点阵图，见图3。其右上象限代表双荧光阳性细胞所占的比例，图中可见促红细胞生成素动员组在3个时间点内双荧光阳性细胞所占点阵的比例基本上大于生理盐水对照组，且促红细胞生成素动员组双荧光阳性细胞所占点阵的比例从动员后3 d开始上升，7 d达到高峰，达到高峰后有所下降，14 d低于 3 d水平。

2.4 脱细胞猪皮及其移植区苏木精-伊红染色结果 镜下见两组移植后的脱细胞猪皮结构较移植前均未出现明显变化，未出现结构松散，坏死等现象。移植后3，7，14 d两组脱细胞猪皮内均未见血管新生，移植后 21 d 促红细胞生成素动员组脱细胞猪皮内部及边缘见小鼠成纤维组织长入，并在脱细胞猪皮内发现少量血管新生，见图4；生理盐水对照组移植后21 d未见此改变，较14 d切片变化不大。促红细胞生成素动员组动员内皮祖细胞促进移植脱细胞猪皮血管新生的效果略强于生理盐水对照组。

2.5 脱细胞猪皮移植区CD34标记结果 促红细胞生成素动员组移植后3 d脱细胞猪皮移植区均未见明显血管新生，7，14，21 d脱细胞猪皮移植区出现大量血管新生，并逐渐增加。生理盐水对照组脱细胞猪皮移植区在移植后3，7，14 d无明显变化，亦无明显血管新生，21 d有少量血管新生。促红细胞生成素动员组动员内皮祖细胞促进脱细胞猪皮移植区血管新生的效果明显强于生理盐水对照组，见图5，6。

2.6 脱细胞猪皮移植区微血管计数结果 见表3。移植后7，14，21 d 促红细胞生成素动员组血管内皮祖细胞趋化至脱细胞猪皮移植区促进血管新生的效果均明显强于生理盐水对照组(P < 0.05)，而生理盐水对照组脱细胞猪皮移植区新生血管基本处于同一水平，于21 d有所上升，基本无明显变化。

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引言

创面修复一直以来都是医学领域的难题，创面愈合是一个复杂而有序的过程，包括炎性细胞、修复细胞的聚集，受损组织的清除，细胞外基质的产生，最后完成再上皮化或形成瘢痕。由于真皮组织能增强移植皮的韧性，抑制肉芽组织生长和瘢痕形成，降低创面挛缩程度，被应用于创面治疗，但自体真皮来源有限，应用和开发异体甚至异种真皮或真皮代替物就成为科学研究和临床应用的迫切需要^[1]。

组织工程皮肤由细胞或细胞外基质或由两者共同结合组成的皮肤产品，是应用生命科学和工程学的原理与技术将种子细胞与适当的支架材料相结合构建出的用于修复、维护和改善损伤皮肤组织功能和形态的生物替代物。脱细胞猪皮作为真皮支架是构建组织工程皮肤的关键部分，其具有良好的生物相容性及生物可降解性。但由于其不具备血管结构，常产生异物、感染、创面封闭无效等问题，导致移植失败^[2]，严重制约了组织工程皮肤的临床应用。只有新生的血管提供营养才能使损伤的组织、器官生长，所以促进创面血管新生对创面愈合至关重要。血管内皮细胞是血液和组织间物质交换的选择性通透屏障，而且在造血调控、血管动力学、血管生成、炎症和免疫应答等许多方面具有十分重要的作用^[3]。血管内皮细胞的特殊功能及日益成熟的分离和扩增技术使得它可以应用于组织工程皮肤。Schultheiss等^[4]研究结果表明，内皮祖细胞在聚合物支架中生长很好，并与支架建立了良好的接触。Butzal等^[5]也利用内皮祖细胞构建了小口径的组织工程化动脉血管。汪道新等^[6]研究发现人脐静脉血管内皮细胞移植具有促进脱细胞猪真皮早期血管化的作用。

近年发现损伤、药物等因素可以刺激自体骨髓中的血管内皮祖细胞向外周血迁移，促进血管新生、参加炎症和免疫应答等。研究显示，促红细胞生成素可以动员内皮祖细胞促进血管新生、创面愈合^[7-14]。因此课题据此设计，应用流式细胞仪检测、免疫组化等方法，采用不同剂量促红细胞生成素动员小鼠内皮祖细胞向移植的脱细胞猪皮趋化，以优选安全有效的促红细胞生成素动员剂量，并观察促红细胞生成素动员内皮祖细胞对脱细胞猪皮移植区血管新生的影响。

材料方法

设计：随机分组，对比观察。

时间及地点：实验于2011年6月至2012年5月在昆明医科大学动物实验中心、昆明医科大学第二附属医院病理科及昆明医科大学第三附属医院流式细胞室完成。

材料：

实验动物：健康雄性(避免雌激素对内皮祖细胞的影响)昆明种小白鼠156只，体质量(20.00±0.50) g，均由昆明医科大学实验动物中心提供。

主要试剂及移植材料：

Main reagents and transplanted materials:

实验方法：

第一阶段：采用重组人促红素注射液，参照文献[11]介绍的剂量[促红细胞生成素剂量1 000 U/(kg·d)与 3 000 U/(kg·d)]和方法(连续腹腔注射7 d)进行小鼠血管内皮祖细胞的动员，观察促红细胞生成素的量效情况。选用健康雄性昆明种小白鼠108只，随机分为低剂量促红细胞生成素动员组、高剂量促红细胞生成素动员组、生理盐水对照组，每组36只。各组在开始注射后1，3，5，7，10，14 d 6个时间点随机取6只小鼠，心脏采血进行流式细胞仪检测Flk-1、CD133双标细胞的阳性率，结果以秩均值表示，统计学处理并进行对比分析。

第二阶段：重组人促红素注射液以1 000 U/(kg·d)剂量连续腹腔注射7 d动员小鼠血管内皮祖细胞，动员第7天于小鼠背部皮下包埋脱细胞猪皮(1 cm×1 cm)，观察注射+移植对内皮祖细胞动员的影响及脱细胞猪皮移植区血管新生的情况。选用健康雄性昆明种小白鼠48只，随机分为促红细胞生成素动员组、生理盐水对照组，每组24只。各组在移植后3，7，14 d 3个时间点随机取6只小鼠，心脏采血进行流式细胞仪检测Flk-1、CD133双标细胞的阳性率，结果以秩均值表示，统计学处理并进行对比分析。

在移植后3，7，14，21 d 4个时间点观察脱细胞猪皮移植区病理形态学组织变化及免疫组化观察CD34标记的血管新生情况，微血管计数结果以x(_)±s表示，统计学处理并进行对比分析。

染色结果判定：苏木精-伊红染色将内有染色为红粉色的环形细胞(红细胞)的完整管腔结构视为微血管；免疫组化染色将由染色为棕色条索状细胞(血管内皮细胞)围成完整管腔结构视为微血管。

微血管密度计数：任何被CD34抗体染成棕黄色的细胞围成的管腔结构就作为一个微血管；只要结构不相连，其分支结构也作为一个血管。微血管密度计数参照Weidner^[15]报道的方法，每个标本随机选取6个视野，计数每个×200视野下的阳性血管数。凡分辨不清或染色模糊的细胞不计数；血管腔大于8个红细胞大小，有较厚肌层的血管及硬化区域的血管均不计数。在单盲法下进行，每张切片由两人分别判定计数，两人计数相差10%以上者重新计数。

统计学分析：由第一作者采用SPSS 17.0统计软件包进行分析，数据分别以x(_)±s、秩均值表示，采用单因素方差分析及秩和检验，P < 0.05为差异有显著性意义。

讨论

3.1 内皮祖细胞表面标志 根据内皮祖细胞表达的特异大分子蛋白和一些它所特有的功能来鉴定，而且目前发现较为特异的内皮祖细胞的细胞表面标志有CD133⁺，CD34⁺，FLK-1⁺。CD34是Ⅰ型跨膜糖蛋白，其选择性的表达于早期造血干细胞、造血祖细胞、胚胎纤维母细胞和血管内皮细胞表面。虽然大多数研究者认为内皮祖细胞为CD34⁺，但也有研究者指出可能存在 CD34阴性的内皮祖细胞亚群。CD133是一种5次跨膜的细胞表面分子，它选择性地表达于骨髓和外周血造血干细胞及内皮祖细胞表面，由Yin等^[16]1997年首次报道。在外周血中分离到的CD133⁺细胞可在体外诱导分化为内皮细胞，同时CD133表达阴性，所以CD133的表达是内皮祖细胞的一个标志，也是区分内皮祖细胞和成熟内皮细胞的主要指标。目前国内外比较一致的看法是FKL-1⁺/CD133⁺/CD34⁺的内皮祖细胞从骨髓释放到外周血过程中逐渐丢失CD133，转变为FKL-1⁺/CD34⁺的成熟血管内皮细胞^[17]。FKL-1又称为KDR或VEGFR-2，是一种络氨酸激酶受体，在体内分布于成熟内皮细胞和内皮祖细胞膜上。FKL-1是内皮祖细胞发育分化过程中最早出现的受体。FKL-1能诱导内皮祖细胞增殖与分化，刺激血管生成。Hirashima等^[18]观察到来源于胚胎干细胞的FKL-1⁺细胞最初不具有内皮细胞的其余标志，它们在体外不需要外源细胞因子即可经VE-钙黏蛋白⁺/PECAM2-1⁺/CD34^-阶段到VE-钙黏蛋白⁺/ PECAM-1⁺/CD34⁺阶段分化为内皮细胞，认为该细胞为内皮前体细胞，即内皮祖细胞。随着内皮祖细胞的培养，逐渐分化成熟，内皮细胞的标志表现出来，vWF和VE-cadherin表达率升高，同时CD133表达迅速下降，当细胞完全分化为成熟的内皮细胞，CD133表达阴性，但CD133何时丢失尚未清楚。由于内皮祖细胞和内皮细胞的表面标志十分相似，很难区分出以上两种细胞，CD133在区分两种细胞时发挥着重要作用。

目前一致认为，内皮祖细胞区别于成熟内皮细胞的主要标志为CD133⁺。由于可能存在CD34^-的内皮祖细胞亚群，Harraz等^[19]发现 CD34阴性的内皮祖细胞在内皮条件体外培养中能转化为内皮细胞。作者根据实验实施的体会，分析认为内皮祖细胞在向内皮细胞演变过程中，其表型也由幼稚向成熟进行着变化，表面标志相对应着这种变化，3种标志不可能在不同阶段均呈现阳性，CD34^-实际上是内皮祖细胞在一个阶段的表型，而并非存在 CD34阴性的细胞亚群。由于存在CD34^-的情况，实验在进行流式细胞定量检测时，可能会使得与CD34相匹配的双荧光阳性细胞的结果较实际内皮祖细胞的总数低。故作者考虑到CD34标记内皮祖细胞的指向性不强，选择CD133/Flk-1双阳性为内皮祖细胞表面标记物，确认促红细胞生成素具有剂量依赖性的动员内皮祖细胞的作用，并在动员后第7天达到动员高峰。

3.2 促红细胞生成素动员内皮祖细胞有效性、安全性分析 重组人促红素自从1989年由美国安进公司研发上市，用于治疗慢性肾功能衰竭所致贫血并取得了较好的治疗效果。现在还用于外科围手术期的红细胞动员，治疗非骨髓恶性肿瘤应用化疗引起的贫血。促红细胞生成素可以上调血管内皮生长因子表达，动员骨髓内皮祖细胞到外周循环，促进内皮增殖、迁移和管样结构形成，促进血管新生并且调控新生血管成熟^[20-21]。第一阶段实验的结果表明促红细胞生成素对由CD133/FLK-1双标阳性的内皮祖细胞具有明显的动员效果，且动员效果成剂量依赖性。实验结果与文献所报道的动员后外周血内皮祖细胞含量的变化趋势基本相同^[22]，均会在动员后出现峰值随后下降。可能由于动员药品及其剂量、动员周期不同，峰值出现的时间不同，按该研究方法使用促红细胞生成素动员内皮祖细胞的峰值暂无相关文献论证。

促红细胞生成素小鼠腹腔注射剂量大部分报道使用1 000 U/(kg·d)，实验中发现虽然3 000 U/(kg·d)的促红细胞生成素注射剂量远高于1 000 U/(kg·d)的常规使用剂量^[7]，但是实验全过程的28 d内未见3组小鼠饮食活动上有何明显差异，亦无小鼠死亡。曹丹等^[23]临床

研究发现，使用20 000 U/d的大剂量重组人促红细胞生成素治疗肿瘤患者化疗后贫血，发现临床疗效安全有效，可提高血红蛋白水平，改善生活质量。由于促红细胞生成素药理作用与雄激素相关，同时小鼠又受手术打击，大量雄激素的释放可能在动员的同时刺激副交感神经和内分泌系统造成小鼠情绪的变化，相应带来前列腺增生等副反应。若需继续探讨安全性的问题，可进一步对小鼠血样、肝脏、前列腺等组织切片进行分析，观察是否影响小鼠血黏度及凝血功能，是否促进血管瘤的产生及前列腺增生等。同时，实验结果显示促红细胞生成素动员内皮祖细胞的作用虽然具有剂量依赖性，但内皮祖细胞的数量并非随促红细胞生成素的用量成倍增长，故临床应用时也不宜盲目增大剂量。

3.3 促红细胞生成素腹腔动员可以促进脱细胞猪皮移植区血管化 真皮支架是采用天然皮肤材料，包括异体或者异种皮肤，经过处理彻底去除所有活细胞成分后制成的一种组织工程化皮肤替代物。脱细胞猪皮则是其中一种产品。1995年Wainwright等将异体无细胞真皮基质应用于切痂创面，然后覆盖断层自体皮，均显示皮肤愈合后弹性好，光滑。但由于缺乏血管网结构，导致其缺血时间、再灌注时间和无营养支持的时间较长，屏障功能不完善，抗感染能力较弱，对创面的清洁度要求高，提示了尽快从基底获得营养支持的重要性。拉网打孔虽有利于血管再生和复合移植成活，但同时会暴露蛋白抗原位点，并增强宿主组织的包裹、分割和收缩作用^[24]，因此以其为支架在体外构建的复合皮肤也难以用于临床。目前促进移植物血管化的方法主要有重组促血管生成因子的直接应用，细胞预先种植于人工皮肤后移植，编码特定生长因子基因转染细胞等。其中生长因子的直接应用动员内皮祖细胞是较简便、安全，也是目前研究最广泛的一种方法。

在识别血管并进行微血管计数的标记物中，苏木精-伊红染色镜下毛细血管计数是一种经典的观察并计数大血管(肌层较厚及血管管腔面积大于8个红细胞直径的血管)的方法，但因缺乏特异性、较难识别闭合的毛细胞血管而干扰诊断结果。CD34表达的阳性率高、染色表达强，对比度明显，背景清晰，能显示微小的肿瘤新生血管，具有更高的敏感性和特异性，可以作为检测微血管数的首选标记物。有研究报道单核细胞或CD34⁺细胞可归巢到创伤区，选择性的整合入微血管，变为成熟的内皮细胞^[25]。说明血管发生现象也存在于成体同时与内皮祖细胞有着紧密的联系，故实验选择CD34标记脱细胞猪皮移植区的新生血管，观察小鼠背部创伤后脱细胞猪皮移植区血管化情况，进一步说明促红细胞生成素动员内皮祖细胞促进血管化的作用。

实验明确了促红细胞生成素可以有效，安全的动员出内皮祖细胞，在缺血、损伤等因素作用下，机体可产生各种趋化因子，如血管内皮生长因子、一氧化氮、基质细胞衍生因子1，将内皮祖细胞逐步募集在缺血或损伤部位，分化为成熟的内皮细胞，参与受损部位的血管发生和血管生成^[26]。实验中苏木精-伊红染色后发现在移植后的3周内脱细胞猪皮结构无明显变化，胶原结构致密，脱细胞猪皮周围组织见大量新生的微血管，而脱细胞猪皮仅有少许血管长入，这说明脱细胞猪皮作为创面覆盖物保护创面，具有较好的临床应用意义，但是作为真皮支架构建组织工程皮肤的临床应用仍存在困难。目前包括脱细胞猪皮在内的组织工程皮肤已经有多种商品化产品^[27]，但大多数产品均存在血管化速度慢的缺点，其原因之一是所用真皮支架的生物相容性及三维孔隙结构与正常真皮基质相比还相差甚远^[28-29]。近期研究对脱细胞猪皮进一步处理，利用表皮干细胞和同种脱细胞真皮基质构建的组织工程皮肤在组织学结构上已经具有皮肤的基本结构，可满足全层皮肤替代物的基本组织学要求^[30]。

总之，实验明确促红细胞生成素动员内皮祖细胞的动员高峰期及其剂量依赖性，发现了促红细胞生成素促进脱细胞猪皮移植区组织血管化，但由于脱细胞猪皮自身结构上的缺陷，未较好达到移植脱细胞猪皮血管化的效果。今后应进一步完善真皮支架的结构优选组织工程皮肤，再辅以促进其血管化的措施，方能改善其临床应用的困境。

动员血管内皮祖细胞促进真皮支架移植区的血管新生

Angiogenesis of dermal scaffold transplantation zone promoted by moboilizing endothelial progenitor cells

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