2.1 神经干细胞的鉴定结果 诱导分化的神经干细胞培养1 d后即可见到细胞聚集，3 d后可见小的神经球形成并逐渐长大，7 d神经球体积约为100 μm，神经球饱满，边缘细胞形成桑椹样颗粒；巢蛋白染色呈阳性表达，见图1。

2.2 IKVAV纳米纤维凝胶的组装及鉴定结果 透射电镜下IKVAV-PA溶液自组装成凝胶，纳米纤维交织成网状结构，直径为7.0-8.0 nm，长度可达100-1 500 nm，见图2。

2.3 CCK-8法检测各组细胞的增殖率结果 实验组各时间点的细胞增殖率在明显高于对照组(P < 0.05)。实验组中细胞增殖率在第7天左右达峰值0.58±0.02，对照组的细胞增殖率在第7天也到达峰值0.45±0.03，见表1，图3。

2.4 MTT检测自制装IKVAV纳米纤维凝胶对骨髓源性神经干细胞的毒性结果 3组未见细胞毒性，各组间A值比较差异无显著性意义(P=0.82)，见图4。

2.5 流式细胞仪分析各组神经干细胞向神经元分化的比例 实验组神经干细胞分化为神经元的细胞比例在个时间点均高于对照组(P < 0.05)。实验组在1，3，5，7，10，14 d分化为神经元的细胞比例各为2.1%，3.0%，4.6%，7.1%，5.8%，2.7%；对照组1，3，5，7，10，14 d分化为神经元的细胞比例分别为1.9%，2.3%，3.5%，4.7%，3.1%，1.6%。

设计：细胞学体外观察实验。
时间及地点：于2011年11月至2012年8月在新疆医科大学第一附属医院医学研究中心完成。
材料：
实验动物：新生1周龄SD大鼠，由新疆医科大学动物中心提供，用于骨髓源性神经干细胞的分离培养。
体外自组装纳米纤维凝胶与神经干细胞增殖及分化实验的主要试剂和仪器：
Main reagents and instruments for the proliferation and differentiation of neural stem cells controlled by self-assembling nanofiber gel:

实验方法：
实验分组：①对照组：将2代神经干细胞加入含 20 μg/L碱性成纤维细胞生长因子、20 μg/L表皮生长因子、体积分数2% B27的DMEM/F12(1:1)神经筛选培养液中培养。②实验组：取第2代神经干细胞，调整细胞浓度为1×10⁸ L^-1，以200 μL/孔种植于自组装多肽纳米纤维凝胶表面，置于含20 μg/L碱性成纤维细胞生长因子、20 μg/L 表皮生长因子、体积分数2%B27的DMEM/F12(1∶1)神经筛选培养液中培养。③空白对照组：只有自组装多肽纳米纤维凝胶，无神经干细胞及神经筛选培养液。
IKVAV纳米纤维凝胶自组装的构建^[7]：在10 mg IKVAV-PA中加入无菌的400 μL NaOH(0.11 mol/L)和400 μL双蒸水，放置在37 ℃ 30 min，搅拌后溶解成为澄清液体，测量pH值=9.0。加入双蒸水使总体积为 1 mL，质量浓度为10 g/L。将已经溶解的1% IKVAV-PA取200 μL，加入200 μL含有二价阳离子的DMEM/F12细胞培养基溶液引发自组装，终浓度为0.5%。
IKVAV纳米纤维凝胶的鉴定：取10 μL 0.1% IKVAV两亲性溶液滴加到电镜专用的小铜网上，加入10 μL DMEM/F12自组装成凝胶，晾干，磷钨酸染色3 min，于透射电镜下观察。
骨髓源性神经干细胞的分离培养：将新生1周龄SD大鼠引颈处死，体积分数75%乙醇皮肤消毒，无菌条件下取双侧下肢骨，置于紫外线下消毒30 min，PBS浸泡骨头约15 min，PBS清洗骨头3次剪去骨骺两端，用5 mL注射器将DMEM培养液反复冲洗骨髓腔，冲洗液收集于离心管，得到细胞悬液1 000 r/min，200×g离心3 min。弃去上清液。加入培养液直头滴管充分吹打至单细胞悬液，计数按(6-8)×10⁹ L^-1的浓度接种到培养皿中置 37 ℃、体积分数5%CO₂培养箱中常规培养。48 h后更换生长液。每日观察细胞生长情况，隔3 d换液。待贴壁细胞80%融合后，0.125%胰蛋白酶加0.02%EDTA消化传代，镜下见细胞回缩成球形且大部分脱落时用生长液终止消化，吸出放入离心管中，按1 200 r/min，200×g离心6 min，制成细胞悬液按(6-8)×10⁷ L^-1的浓度接种传代。在倒置显微镜下观察细胞形态及生长情况。将生长良好的第3代的骨髓间充质干细胞按5×10⁷ L^-1接种于培养瓶中悬浮培养，加入含20 μg/L碱性成纤维细胞生长因子、20 μg/L 表皮生长因子、体积分数2% B27的DMEM/F12(1∶1)神经筛选培养液进行诱导，当神经球直径为100-200 μm时传代，倒置相差显微镜下观察细胞生长状况及变化。
神经干细胞与IKVAV纳米纤维凝胶的共培养：取96孔培养板，实验组加入1%多肽溶液(由上海波泰IKVAV-PA序列配置)100 μL/孔，加入含20 μg/L碱性成纤维细胞生长因子、20 μg/L 表皮生长因子、体积分数2%B27的DMEM/F12(1∶1)神经干细胞培养基触发多肽溶液自组装，37 ℃孵育30 min，此时水凝胶已形成。取第2代神经干细胞，调整细胞浓度为1×10⁸ L^-1，以200 μL/孔种植于自组装多肽纳米纤维凝胶表面；对照组将第2代神经干细胞培养于含20 μg/L 碱性成纤维细胞生长因子、20 μg/L 表皮生长因子、体积分数2% B27的DMEM/F12(1∶1)神经筛选培养液中培养，放入37 ℃，体积分数5%CO₂饱和湿度培养箱中培养。培养基每二三天更换1次。空白对照组只有自组装多肽纳米纤维凝胶，无神经干细胞及神经筛选培养液。
神经干细胞的鉴定^[8]：各孔细胞诱导24 h后吸出培养基，以40 g/L多聚甲醛2 mL固定30 min，流水洗净，晾干，实验组中3孔及对照组3孔细胞按各抗体说明书采用SP法行Nestin免疫细胞化学染色；置于倒置荧光显微镜下观察。
CCK-8法检测细胞的增殖：各组培养1，3，5，7，10，14 d后，用CCK-8法检测神经干细胞的增殖能力，每组5个复孔(每孔2 000个细胞)。每孔中加入CCK-8溶液10 μL，避光放入37 ℃，体积分数5%CO₂培养箱中培养4 h，取出用酶标仪测450 nm处吸光度(A)值，绘制曲线。
MTT法检测IKVAV纳米凝胶纤维的细胞毒性：将第2代神经干细胞悬液接种于96孔培养板，每孔150 μL，细胞浓度5×10⁷ L^-1，每组4个复孔，接种于除平行孔外的各孔中，37 ℃、体积分数5%CO₂、100%湿度培养箱中培养24 h后，加入终浓度为0.5%纳米凝胶纤维于1，3，5，7，10，14 d后测定A值。方法：每孔加入MTT 20 μL，继续37 ℃、体积分数5%CO₂培养箱中孵育4 h，离心，吸出上清液，加入150 μL DMSO，振荡15 min，使结晶物充分溶解后，用酶标仪于490 nm波长下测A值。用SPSS 19.0统计软件对各组间的A值行t 检验，并制图。
流式细胞仪分析细胞周期：取各组培养1，3，5，7，10，14 d的1×10⁶个细胞接种于60 mm培养板，待80%汇合后转染。24 h后在新鲜培养液中加入适当的抗生素(真核表达载体上的抗性标记)进行培养。48-72 h后用胰酶消化收集细胞，PBS洗2遍，弃上清，加入1mL 体积分数70%预冷乙醇中，吹打均匀，4 ℃固定12 h以上。PBS洗涤去乙醇，1 000 r/min，200×g离心5 min，洗2遍。0.5 mL PBS重悬细胞，加入碘化丙啶(PI)和 RNaseA至终质量浓度50 mg/L，37 ℃ 温浴30 min。上机测定周期。
主要观察指标：各组细胞增殖与神经干细胞向神经元分化的比例；各组细胞毒性检测结果。
统计学分析：采用SPSS 19.0软件对数据进行统计学分析，计量资料采用x(_)±s表示，两组数据比较采用独立样本t 检验，P < 0.05认为差异有显著性意义。

1  骨髓来源的神经干细胞避免了传统胚胎来源和脑来源神经干细胞的取材困难、伦理、来源有限的束缚，成为神经干细胞移植的一种新来源。

2  多肽纳米纤维凝胶材料具有黏弹性好，与脑及脊髓组织有相近的压缩模量，降解产物为氨基酸单体，无任何毒性且可作为生物体营养物质的来源，便于靶向运输，可以通过注射技术运送到靶位点等优点，成为一种极有前途的神经组织工程支架材料。

3  实验观察体外自组装IKVAV多肽纳米纤维凝胶对骨髓源性神经干细胞增殖及向神经元分化比例的影响，发现虽然自组装IKVAV多肽纳米纤维凝胶能促进神经干细胞向神经元分化的比例，但仍不满意，有待于进一步提高神经元分化比例。

神经组织工程包括两个方面的基本要素：支架材料和种子细胞。理想的支架材料应具有连接和支撑种子细胞的作用，还应具备良好的生物降解性和生物相容性，具备一定的生物力学强度，为种子细胞的黏附、生长及细胞外基质的沉积提供足够空间，具有对种子细胞的诱导剂调控作用，并且有利于营养物质的渗入和代谢产物的排除。目前经常使用的两类支架材料尚不能完全满足上述要求，因而限制了在神经组织工程领域的应用。而多肽纳米纤维凝胶材料是一种新型神经组织工程纳米支架，其除了具备上述特点外，尚具有黏弹性好，与脑及脊髓组织有相近的压缩模量；降解产物为氨基酸单体，无任何毒性且可以作为生物体营养物质的来源；便于靶向运输，可以通过注射技术运送到靶位点等优点，这些优点使多肽纳米纤维凝胶基质材料成为一种极有前途的神经组织工程支架材料。IKVAV多肽是细胞外基质成分层粘连蛋白a1链中所包含的核心功能片段^[13]，具有良好的生物学活性，并且能促进神经干细胞的增殖、分化，且利于血管发生^[14-15]。其作用机制可能是IKVAV与神经干胞表面的IKVAV受体与LBP110结合^[16]，通过信号传导上调细胞内c-fos 基因的表达，从而促进神经干细增殖、分化为神经元。这些优点使多肽纳米纤维凝胶基质材料成为一种极有前途的神经组织工程支架材料。实验采用的IKVAV-PA为两亲性分子，亲水的活性片段位于C端，而疏水的片段位于N端，当pH值≥7时溶液带负电荷，在疏水力和电荷排斥作用下，IKVAV两亲性分子分散在溶液中，实验在IKVAV两亲性溶液中加入DMEM/F12，通过其中二价阳离子的桥梁作用，分子发生自组装，亲水的IKVAV位于表面，疏水的基团位于内部。透射电镜检测显示自组装的IKVAV纳米纤维凝胶的纳米纤维直径7.0-8.0nm，长度100-1500nm，与文献^[17]报道一致，说明组装成功。Tysseling等^[18]通过向脊髓损伤处注射IKVAV-PA溶液，观察发现其可促进病变处运动和感觉轴突的再生。有学者研究证实，自组装水凝胶对神经祖细胞无细胞毒性，可提高神经祖细胞向神经元分化的比例^[19-20]。Cheng等^[21]研究表明自组装肽凝胶可以提高神经干细胞的生存率，减少星形胶质细胞的形成，高神经元分化比例。