5-氟尿嘧啶纳米微球复合材料填充骨缺损及抗肿瘤作用

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2013.12.006

摘要/Abstract

摘要：

背景：前期研究成功制备了纳米羟基磷灰石-聚羟基丁酸戊酯/聚乙二醇-5-氟尿嘧啶材料。
目的：观察纳米羟基磷灰石-聚羟基丁酸戊酯/聚乙二醇-5-氟尿嘧啶的填充骨缺损和抗肿瘤作用。
方法：取72只新西兰兔建立右膝关节VX2 骨肿瘤模型，切除部分胫骨形成骨缺损，且使骨缺损与肿瘤相邻，造模后随机分为实验组与对照组，分别于骨缺损处植入纳米羟基磷灰石-聚羟基丁酸戊酯/聚乙二醇-5-氟尿嘧啶与纳米羟基磷灰石-聚羟基丁酸戊酯/聚乙二醇人工骨。
结果与结论：①无机质含量：两组均随时间的延长逐渐降低，尤以实验组明显。②X射线检查：实验组术后24周材料体积较植入初期变小，肿瘤开始变小。对照植入材料体积始终无明显变化，肿瘤体积进行性增大。③生物力学检测：术后24周，实验组下肢标本最大扭转强度明显高于对照组(P < 0.01)。④骨密度检测：术后2-24周，两组均呈先减低后增加趋势，以实验组明显。⑤肿瘤体积变化：术后24周，实验组减小，对照组增加。表明纳米羟基磷灰石-聚羟基丁酸戊酯/聚乙二醇-5-氟尿嘧啶复合材料能很好填充骨缺损并有明显抑制肿瘤生长的作用。

关键词: 生物材料, 纳米生物材料, 纳米羟基磷灰石, 聚羟基丁酸戊酯/聚乙二醇, 5-氟尿嘧啶\骨肿瘤, 骨缺损, 无机质, 生物力学, 骨密度, 生物材料图片文章

Abstract:

BACKGROUND: Previous studies have successfully prepared nano-hydroxyapatite-poly(3-hydroxybutyrate- hydroxyvalerate)/polyethylene glycol-5-fluorouracil.
OBJECTIVE: To discuss the effect of nano-hydroxyapatite-poly(3-hydroxybutyrate-hydroxyvalerate)/polyethylene glycol-5-fluorouracil composite on bone defect repair and against bone tumor.
METHODS: Bone tumor models were induced by injection of VX2 carcinoma cell suspension into the medullary cavity of right tibias in 72 New Zealand white rabbits through the knee joints. Partial resection of the tibia was performed to form bone defects that were adjacent to bone tumors. After modeling, all the rabbits were randomized into experimental and control groups. Nano-hydroxyapatite-poly(3-hydroxybutyrate-hydroxyvalerate)/ polyethylene glycol-5-fluorouracil and nano-hydroxyapatite-poly(3-hydroxybutyrate-hydroxyvalerate)/ polyethylene glycol artificial bone were implanted into bone defects, respectively, in the experimental and control groups.
RESULTS AND CONCLUSION: (1) Inorganic content was decreased gradually in the two groups, especially in the experimental group. (2) X-ray examination: At 24 weeks after implantation, the implant became smaller than that in the early stage after implantation. However, there were no changes in the implant volume in the control group, and tumor volume in the control group was enlarged progressively. (3) Biomechanical detection: At 24 weeks after implantation, the maximal torque of the lower limbs in the experimental group was significantly higher than that in the control group (P < 0.01). (4) Bone mineral density in the two groups was firstly decreased and then increased at 2-24 weeks after implantation. The changes in the bone mineral density of the experimental group were significant. (6) Tumor volume was decreased in the experimental group and increased in the control group at 24 weeks after implantation. These findings indicate that nano-hydroxyapatite-poly(3-hydroxybutyrate- hydroxyvalerate)/polyethylene glycol-5-fluorouracil can perfectly repair bone defects and exert a remarkable effect against tumor growth.

Key words: biomaterials, nanobiomaterials, nano-hydroxyapatite, poly(3-hydroxybutyrate-hydroxyvalerate)/ polyethylene glycol, 5-fluorouracil, bone tumors, bone defects, inorganic, biomechanics, bone density, biomaterial photographs-containing paper

中图分类号:

R318

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图/表（结果） 7

2.1 实验动物大体观察结果 整个实验过程中，有3只动物死亡，其中实验组2只，对照组1只，1只为麻醉过深术后立即死亡，另2只分别系术后第39，45天时突然死亡，死因不明。与实验因素无关，均予以剔除并及时补充。大部分动物术肢在术后第1天即出现不同程度的肿胀，3-5 d后消失，伤口愈合良好，均于10 d拆线。术后2 d内活动减少，食欲降低，毛色灰暗，其后活动、进食情况逐渐恢复至基本正常，精神状态也随之好转。

2.2 术后不同时间点实验组与对照组植入物大体观察结果 取材后可见对照组术后2，4周材料与骨界面清晰，无明显成骨，上下端瘤体向两侧浸润；6-16周较多软组织覆盖植入材料，可见少量新骨形成，两端肿瘤进一步向远侧和近侧生长。实验组术后4周同对照组，瘤体进行性向两端侵袭；6周在植入材料与宿主骨之间可见到软骨组织，肿瘤侵袭的范围无明显增加；16周时材料与骨交界处有外骨痂出现，大体观察见肿瘤体积减小；24周时新骨明显增多，材料体积变小，骨缺损得到初步修复，肿瘤体积进一步减小，但仍有部分残存。标本固定后从正中剖开，塑料包埋，观察材料降解情况。两组材料在术后4周时材料体积与植入时基本相同，无明显降解迹象。至16周时，材料体积略变小，两端由部分新生骨痴替代，中间无新骨形成，材料外缘不规则，有大量小颗粒，新骨钙化程度较高，部分可见新骨连接，24周时新骨形成量进一步增加，骨断端骨性连接，骨缺损得到初步修复，但仍有部分植入材料残留，不能分辨出新骨与材料之间的边界，尚未见到髓腔再通。

2.3 实验组与对照组胫骨标本无机质含量测定 两组无机质含量随着时间的延长均有不同程度降低，无机成分均迅速减少，表1，图2，尤以实验组明显。

经检验，两组之间比较差异无显著性意义，但两组组内除16周和24周之间差异无显著性意义外(P=0.315和P=0.808)，其余各时间点差异均有显著性意义(P < 0.05)。

2.4 实验组与对照组胫骨缺损区X射线检查结果 见图3，4。

实验组术后2，4周材料与骨界面有清晰的界限，无明显成骨现象，近端和远端分别有密度减低区域，肿瘤不明显；6，8周材料密度基本同前，由于新骨形成和材料外周的溶解吸收使交界处模糊不清，但材料体积无明显变小迹象，肿瘤增大；16周植入材料与截骨端融合在一起，骨端新骨形成长入材料，材料体积较植入初期变化不明显，肿瘤较前稍有增大；24周植入材料与截骨端进一步融合，骨皮质部分连接，材料体积较植入初期变小，肿瘤开始变小。对照组材料植入后2-24周，材料体积无明显变化，两端界限较清晰，两端的密度减低区范围进行性扩大。

2.5 术后24周实验组与对照组胫骨标本生物力学测定结果 实验组胫腓骨最大扭转强度为0.726 N·m，对照最大扭转强度为0.259 N·m，两组间差异有非常显著性意义(P=0.000 1)；二者均较健侧正常胫腓骨标本最大扭转强度0.925 N·m低(P实验组=0.009 2，P对照组< 0.01)。

2.6 实验组与对照组胫骨标本骨密度测量结果 两组骨密度均呈先减低后增加的趋势，以实验组更为明显。统计学分析表明两组术后4周时骨密度差异无显著性意义 (P > 0.05)，而术后16，24周时，实验组骨密度明显高于对照组(P < 0.05)，见表2，图5。

2.7 实验组与对照组胫骨标本肿瘤体积的测量结果 实验组植入材料后肿瘤体积较对照组增加明显变慢，且在第24周时，肿瘤体积比16周时的小；对照组肿瘤体积呈进行性增大，无减小趋势。经统计学检验，实验组术后24周时肿瘤体积较术后16周时减小，但差异无显著性意义(P =0.424)，对照组术后24周时肿瘤体积较术后16周增加，但差异均无显著性意义(P=0.522)。在第8，16，24周时，两组之间肿瘤体积差异有显著性意义(P < 0.05)，见表3。

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引言

材料方法

设计：随机对照动物实验。
时间及地点: 于2009年6月至2010年6月在南方医科大学珠江医院中心实验室及生物力学实验室完成。
材料：
实验动物：新西兰大白兔117只，体质量2.5-3.0 kg，购于南方医科大学实验动物中心，机构许可证号SYXK(粤)2009-0083。选择其中72只新西兰大白兔，雌雄各半，随机数字表法分成实验组和对照组，二组均予以建立VX2骨肿瘤模型，并切除部分胫骨形成骨缺损，且使骨缺损与肿瘤相邻，每组36只。其余45只用于制备肿瘤细胞悬液的制备。
人工骨材料：Nano-HA由华南理工大学生物工程与材料学院提供，PHBV(相对分子质量为23.5×10³)购自英国ICI公司，PEG(相对分子质量为19 000)购自上海润洁公司。
实验方法：
Nano-HA-PHBV/PEG-5-FU缓释药粒的制备：将白色冻干粉Nano-HA-5-FU分散于PHBV/PEG(PEG20000与PHBV的质量比为2∶1)的二氯甲烷溶液中，冻干粉与PHBV/PEG的质量比为1∶4。然后迅速倒入到外水相中，其中含0.4%的甲基纤维素。油相与水相的体积比为1∶10，剧烈搅拌直到二氯甲烷挥发完全。然后离心，过滤，水洗，收集固体冷冻干燥，制备出白色粉末状Nano-HA-PHBV/PEG-5-FU缓释微球，在ELISA板孔模具中制成形状为圆柱形的复合物，见图1。同法制得无药Nano-HA-PHBV/PEG微球。环氧乙烷消毒灭菌备用。

肿瘤细胞悬液的制备：将冻存的 VX2 肿瘤组织块(由南方医科大学中心实验室提供)在-20-4 ℃条件下复苏，在无菌条件下将复苏的肿瘤组织块剪成 1 mm³碎组织，置入生理盐水制成肿瘤组织悬液。常规将兔后肢大腿脱毛，消毒，严格按无菌操作技术将肿瘤组织悬液注射于兔后肢股外侧肌内制成荷瘤兔。3周后，兔股外侧肌可触的肿块即为生长的肿瘤，其边界清楚，质韧，剔除3只肿瘤不明显的大白兔。其余42只均经耳缘静脉注射3%戊巴比妥钠(1 mL/kg)麻醉后，于兔大腿外侧脱毛、消毒、铺巾，无菌手术切除兔后肢肌肉内肿瘤。去除肿瘤中心坏死组织及周围的纤维组织，取新鲜的鱼肉样肿瘤组织剪成约1 mm³碎组织块，放入200-400目的细胞筛内，加少许Hanks液挤压过滤，并用Hanks液冲洗。收集 Hanks 液中的细胞悬液，以 1 500 r/min 离心3 min，离心半径13.5 cm，形成的沉淀小球再次悬浮于 Hanks 液中。进行细胞计数，并用锥虫蓝排除法计算细胞成活率，制成细胞浓度为1×10⁹ L^-1的肿瘤细胞悬液。
动物实验及标本收集：无菌条件下麻醉实验组与对照组动物，常规消毒、铺巾后，于右膝关节髌骨下方纵行切开皮肤长约1 cm，触及胫骨平台，用18G骨穿针经胫骨近端关节面穿刺，穿刺针与胫骨骨干平行，转动穿刺针，当产生落空感时穿刺针头即进入骨髓腔内，将穿刺针分别送入10 mm和13 mm处，针尖位于胫骨骨髓腔中上段，各注入0.3 mL肿瘤细胞悬液，拔针，缝合皮肤。于肿瘤细胞悬液植入后，称量动物体质量，右前肢脱毛，将动物仰卧位固定于实验手术台上，按前述方法耳缘静脉注射麻醉，右胫骨前外侧纵行切口，依次切开，以胫骨平台下12.5 cm处为中心，用电动裂钻截断带骨膜的胫骨干，并保留两端部分瘤体，以确保肿瘤未被完全切除。模拟肿瘤摘除后形成的伴部分肿瘤未完全切除节段性骨缺损模型，于缺损处植入复合物，实验组植入Nano-HA- PHBV/PEG-5-FU人工骨材料，对照组植入单纯Nano-HA-PHBV/PEG人工骨材料。待材料成型后间断缝合筋膜和皮肤。术肢不固定，术后分笼饲养，肌注庆大霉素2×10⁴ U，1次/d，连续3 d，以防感染。术后2，4，6，8，16，24周两组各处死6只动物，取整个胫骨全段备用。
主要观察指标：①大体观察：术后观察动物一般情况，以及伤口局部情况。取材后观察标本中成骨及病灶变化情况。②X射线检查：术后不同时间取材后，X射线机摄DR片，观察标本骨缺损区的新生骨生长情况及肿瘤变化情况。③骨密度测量：术后不同时间点两组各取6份标本，测量连同肿瘤和骨缺损在内的新骨密度，用骨密度测量仪测定新骨密度，取平均值，并与对侧比较。④生物力学测试：术后24周，取实验标本，去除软组织，测量双下肢标本的最大扭转强度，并与对侧比较。⑤无机质含量测定：取出标本，准确称质量，测定 800℃烧灼前后样本中无机质成分的含量。⑥肿瘤体积变化：将获得的骨肿瘤用游标卡尺测量5处直径值并计算出肿瘤体积。肿瘤体积按公式V=(4/3)π•(D/2)³计算，其中V为肿瘤体积，D为肿瘤平均直径。
统计学分析：所有数据用SPSS 13.0软件处理，并进行统计分析。数据以均值表示，组内比较采用方差分析，组间比较采用t 检验，P < 0.05为差异有显著性意义。

讨论

长期以来，研制理想的人工生物材料替代自体骨移植用于修复骨缺损是医学和生物材料学领域的重要课题。研究发现纳米生物材料是一种较好的人工生物学材料。实验发现纳米级人工骨替代材料较普通人工骨材料有良好的成骨能力和生物相容性^[1]。如何将纳米材料应用于组织工程支架和药物载体也成为当今研究的热点。课题组旨在将纳米微球、支架和药物制成一种复合物修复骨缺损并形成缓释系统达到抗肿瘤的作用。

羟基磷灰石(分子式[Ca₁₀(PO₄)₆(OH)₂])是骨无机相的主要成分。单纯羟基磷灰石制成的人工骨替代材料存在着脆性大，不能承重等缺点。研究显示纳米级的羟基磷灰石与人体内骨组织成分更为相似，具有更佳的生物性能，被认为是具有良好发展前景的生物活性材料^[2]。

纳米羟基磷灰石作为抗肿瘤药物的载体而产生抗肿瘤作用。Hideki等^[3]研究显示羟基磷灰石微晶体能作为载体吸附阿霉素等抗肿瘤药物。吸附阿霉素的羟基磷灰石对癌细胞抑制作用明显优于单纯阿霉素。Itokazu等^[4]报道阿霉素-羟基磷灰石作用骨肉瘤细胞效果较好，纳米羟基磷灰石晶粒中获得了具有缓释功能的药物释放体系，药物释放速率由羟基磷灰石的溶解过程控制。且纳米羟基磷灰石具有较大的表面积，可吸附大量化疗药物，作为载体与化疗药物结合进行靶向治疗将明显增加局部药物浓度及作用时间，减少化疗药对全身器官的损害。研究也显示纳米羟基磷灰石本身也具有抗肿瘤作用，羟基磷灰石纳米粒子对多种癌细胞的生长均有抑制作用，而对正常细胞无影响，在肿瘤治疗中可能具有较好的选择性^[5-9]。

PHBV是聚羟基丁酸与羟基戊酸的共聚物，聚羟基丁酸是原核微生物在碳、氮营养失衡的情况下，作为碳源和能量储存而合成的热塑性聚酯。与其他天然高分子比较，聚羟基丁酸具有良好的机械性能，与合成可降解聚酯相比，又有较好的组织相容性，而且它由生物合成，不带有化工原料合成可能产生的对人体有害的一些副产品，还具有质轻、耐腐蚀、可塑性强、生物可降解等优良特性，不仅可用于手术缝线、药物释放包囊、疮口贴膜，而且可以制成各种模型在体内或体外培养血管、肝脏、角膜、骨骼等组织和脏器供器官移植。但是聚羟基丁酸为典型结晶态较脆，抗冲击力差，引入羟基戊酸链段合成PHBV后，这一问题得以改善。而且通过与羟基戊酸形成共聚物PHBV，随着羟基戊酸比例的增高，PHBV的强度和韧性得以提高^[10]，此外该材料是原核微生物在碳、氧营养失衡的情况下，作为碳源和能源储存而合成的一类聚羟基链烷酸，在生物体内可以完全降解，最终产物为二氧化碳和水^[11]。以PHBV为载体制得的微球表面为少孔结构，释药最慢^[12]。Yagmurlu等^[13]将舒巴坦-头孢哌酮包入以PHBV为载体的小柱中，植入金黄色葡萄球菌诱导患骨髓炎兔的胫骨。15 d后病情明显减弱，30 d后炎症完全消失，而直接以舒巴坦-头孢哌酮治疗的对照组病情却更加恶化。

研究表明表面活性剂聚乙二醇的加入能有效降低微粒的表面张力，改善制品的团聚性^[14-15]。由于聚乙二醇具有良好的亲水性、生物降解性和生物相容性，是目前在嵌段共聚物中应用最为广泛的亲水链端。Kwon^[16]通过将聚乙二醇及L-天冬酰胺化合物的共聚物制成两性霉素B胶束，聚乙二醇端为亲水性外壳，氨基酸为内核，通过微调共聚物的组成，控制最终产物胶束的结构直径在30-50 nm之间；研究其在艾滋病中的使用，可降低毒性增强抗毒效果。杨卓理等^[17]研究发现，mPEG-PLA嵌段共聚物可以形成具有核-壳结构的胶束，其临界缔合浓度较低对疏水药物具有良好的装载和缓控释能力。在亲水链段聚乙二醇长度一定的条件下，可通过改变疏水链段PLA的长度来调节聚合物胶束的物理化学性质,并控制药物的释放动力学等。还有实验证明含5-FU的聚乙二醇-聚谷氨酸纳米微球介导双自杀基因治疗金黄地鼠颊癌具有良好疗效^[18]。

综上所述，羟基磷灰石、PHBV和聚乙二醇分别具有良好的承力和抗肿瘤、载药，促进降解等性能，且三者之间存在广泛的交互作用。实验结果也表明所研制的Nano-HA-PHBV/PEG-5-FU兼有对肿瘤术后形成骨缺损的填充和残留肿瘤杀伤的作用。因此，可以考虑在手术的同时植入复合材料治疗，避免长期化疗给患者带来的经济、身体和心理上的沉重负担。但该研究过程中显示实验组在植入材料后肿瘤增大速度减缓，但其趋势仍然是增大的，其于16周后体积减小，但因无统计学意义，不排除为实验误差所致，同时由于肿瘤仍然是增大的，是否能很好防止肿瘤复发则仍不明确，有待进一步实验研究。

致谢：实验是在南方医科大学珠江医院中心实验室及华南理工大学生物工程与材料学院大力支持下完成的，在此一同表示感谢。
作者贡献：实验设计、实验实施、资料收集、成文均为第一作者，实验评估为第二作者，审校为第三作者，第一作者对文章负责。
利益冲突：课题未涉及任何厂家及相关雇主或其他经济组织直接或间接的经济或利益的赞助。
伦理要求：实验过程中对动物的处置符合2009年《Ethical issues in animal experimentation》相关动物伦理学标准的条例。
作者声明：文章为原创作品，数据准确，内容不涉及泄密，无一稿两投，无抄袭，无内容剽窃，无作者署名争议，无与他人课题以及专利技术的争执，内容真实，文责自负。