Ⅱ型胶原注射骨关节炎时C-反应蛋白及类风湿因子的表达

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2013.11.016

摘要/Abstract

摘要：

背景：Ⅱ型胶原和硫酸软骨素是关节软骨的重要组成成分，不仅具有保护软骨的作用，还能抑制关节炎的病变。
目的：通过检测类风湿因子和C-反应蛋白的表达评价Ⅱ型胶原及Ⅱ型胶原复合硫酸软骨素注射对骨性关节炎的疗效。
方法：采用改良Hulth法制作大鼠膝关节骨性关节炎模型，造模后模型组关节腔注射生理盐水、透明质酸钠组给予透明质酸钠凝胶注射、Ⅱ型胶原组给予单纯Ⅱ型胶原注射、Ⅱ型胶原复合硫酸软骨素组给予Ⅱ型胶原复合硫酸软骨素注射治疗。各组动物于术后进行日常观察、称质量、血清抗体及组织病理检查。
结果与结论：造模后模型组大鼠血类风湿因子和C-反应蛋白水平均有所升高，炎症加剧；而与模型组相比，各给药组大鼠类风湿因子和C-反应蛋白水平均有所下降，炎症有所减轻，其中Ⅱ型胶原复合硫酸软骨素组大鼠血清中类风湿因子水平显著下降(P < 0.01)。结果显示Ⅱ型胶原与透明质酸钠均具有预防和治疗骨关节炎的作用，能缓解骨关节炎病变，Ⅱ型胶原联合硫酸软骨素的疗效更明显。

关键词: 组织构建, 组织构建基础实验, Ⅱ型胶原, 硫酸软骨素, 骨性关节炎, 类风湿因子, C-反应蛋白, 透明质酸钠, 动物模型, 改良Hulth法, 炎症, 软骨病变, 省级基金, 组织构建图片文章

Abstract:

BACKGROUND: Type Ⅱ collagen and chondroitin sulfate are the major components of articular cartilage. They cannot only protect the cartilage, but also inhibit pathology of osteoarthritis.
OBJECTIVE: To evaluate the curative effect of type Ⅱ collagen injection and type Ⅱ collagen- chondroitin sulfate composite injection on osteoarthritis by detecting the expression of rheumatoid factor and C-reactive protein.
METHODS: A rat model of knee osteoarthritis was established by using improved Hulth’s method. The treatment was performed via injection into the articular cavity (treatment group A: type Ⅱ collagen injection; treatment group B: type Ⅱ collagen-chondroitin sulfate composite injection; positive control: sodium hyaluronate; model control: physiological saline). After operation, rats in each group were characterized with daily observation, weighing, serum antibody test and histological observation.
RESULTS AND CONCLUSION: After treatment, the content of rheumatoid factor and C-reactive protein in rats’ serum of model group was increased, and inflammation was aggravated; while compared with the model group, the content of rheumatoid factor and C-reactive protein in the other groups, especially in the treatment group B, were lower and the inflammation was eased (P < 0.01). The findings show that both type Ⅱ collagen and sodium hyaluronate can prevent and treat osteoarthritis effectively. The therapeutic effect of type Ⅱ collagen combined with chondroitin sulfate is better.

Key words: tissue construction, basic experiment in tissue construction, Ⅱ collagen, chondroitin sulfate, osteoarthritis, rheumatoid factor, C-reactive protein, sodium hyaluronate, animal models, improved Hulth’s method, inflammation, cartilage lesions, provincial grants-supported paper, tissue construction photographs- containing paper

中图分类号:

R318

雷静，钟翠红，陈淡嫦，黄雷. Ⅱ型胶原注射骨关节炎时C-反应蛋白及类风湿因子的表达[J]. 中国组织工程研究, 2013, 17(11): 2007-2012.

Lei Jing, Zhong Cui-hong, Chen Dan-chang, Huang Lei. Expression of rheumatoid factor and C-reactive protein during type Ⅱ collagen treatment of osteoarthritis[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2013, 17(11): 2007-2012.

图/表（结果） 4

2.1 实验动物数量分析 实验选用大鼠80只，分为5组，无脱失，全部进入结果分析。

2.2 各组大鼠造模后日常观察结果 与正常对照组相比，其余各组大鼠精神状态未见异常，除右下肢运动稍有不顺畅、关节较僵硬外，右下肢膝关节未见肿胀、关节脱位和肌肉萎缩。与正常对照组比较，模型组大鼠在造模后第1周体质量显著降低(P < 0.05)，在其余检测时间点差异均无显著性意义。各给药组大鼠在各个测定时间点的体质量与模型组比较差异均无显著性意义 (P > 0.05)，Ⅱ型胶原组、Ⅱ型胶原复合硫酸软骨素组大鼠在各个测定时间点的体质量与模型组比较差异均无显著性意义。见表1。

2.3 各组大鼠类风湿因子水平 与正常对照组比，模型组大鼠造模后第7，13周的血清中类风湿因子显著性增加(P < 0.05)；而模型组中，与造模后第7周相比，造模后第13周的血清中类风湿因子水平差异无显著性意义(P > 0.05)，但有降低的趋势。与模型组相比，治疗第7，13周时Ⅱ型胶原组大鼠血清中类风湿因子差异均无显著性意义(P > 0.05)，但有降低趋势，而Ⅱ型胶原复合硫酸软骨素组、透明质酸钠组大鼠血清中类风湿因子水平显著下降(P < 0.01)，见表2。

2.4 各组大鼠C-反应蛋白水平 C-反应蛋白在第 7 周和第13周模型组大鼠血清中C-反应蛋白含量与正常对照组比较差异无显著性意义(P > 0.05)，但有升高的趋势；治疗后第7周和第13周各给药组大鼠血清中C-反应蛋白的含量与模型组比较差异均无显著性意义 (P > 0.05)，但有降低的趋势；治疗后第7周和第13周Ⅱ型胶原组和Ⅱ型胶原复合硫酸软骨素组组大鼠血清中C-反应蛋白的含量与透明质酸钠组组比较差异均无显著性意义(P > 0.05)，见表2。

本实验条件下，正常对照组大鼠关节软骨表面光滑，细胞排列规则，表层、移行层、放射层和钙化层层次清晰可见，软骨细胞巢及潮线明显，未见炎细胞浸润及纤维化，滑膜未见增生及炎细胞浸润。模型组大鼠关节软骨第7周时镜下见局部软骨面损伤，细胞排列紊乱，潮线不清，局部纤维化，滑膜组织增生、炎细胞浸润；第13周时镜下见局部软骨面损伤、部分脱落，细胞排列紊乱，潮线不清，局部纤维化，滑膜组织增生、炎细胞浸润，随着时间推移，关节炎炎症加剧，关节软骨进一步发生病变。而Ⅱ型胶原组、Ⅱ型胶原复合硫酸软骨素组和透明质酸钠组在第7周和第13周镜下见大鼠局部软骨面损伤，细胞排列紊乱、部分呈簇状，潮线不清，局部纤维化，滑膜组织增生、炎细胞浸润，炎症有所缓解，关节软骨病变得到缓解。说明Ⅱ型胶原组、Ⅱ型胶原复合硫酸软骨素组和透明质酸钠组中大鼠骨关节炎的病变得到缓解。

参考文献

[1] Hou DC, Liu YL, Tai DX, et al. Zhongyi Zhenggu.2006；18(07) : 73-74. 侯德才,刘元禄,邰东旭,等.骨性关节炎的病因与机制研究进展[J]. 中医正骨, 2006, 18(07): 73-74.

[2] Xin KH. Zhongguo Shequ Yishi: Yixue Zhuanye.2012;14: 101. 辛克弘.透明质酸钠治疗骨关节炎的疗效分析[J]. 中国社区医师: 医学专业, 2012, 14: 101.

[3] Wang DL, Geng CY, Jiang LP, et al. Zhongguo Zuzhi Gongcheng Yanjiu yu Linchuang Kangfu.2011;15(28): 5145-5148. 王大利,耿成燕,姜丽平,等.关节软骨及骨破坏模型大鼠经盐酸氨基葡萄糖干预的最佳剂量[J]. 中国组织工程研究与临床康复, 2011, 15(28): 5145-5148.

[4] Ma PQ. Shanghai Yiyao.2011;32(7): 344. 马培奇.美国FDA批准布洛芬-法莫替丁复合片剂Duexis治疗类风湿性关节炎和骨关节炎患者[J]. 上海医药, 2011, 32(7): 344.

[5] Zhang L, Wu LH, Li l, et al. Jianyan Yixue yu Linchuang.2012；9(6): 701-703. 张玲,吴丽华,李玲,等.5种指标在类风湿关节炎中的诊断价值[J]. 检验医学与临床, 2012, 9(6): 701-703.

[6] Li M, Wuli JBTE. Zhongguo Zhongyiyao Keji.2012;19(1): 1-2. 黎明,乌力吉巴特尔.类风湿关节炎蒙医证型与RF、ESR、CRP变化的相关性研究[J]. 中国中医药科技, 2012, 19(1): 1-2.

[7] Liang PH, Li SM, Ye CT, et al. Zhongguo Linchuang Kangfu. 2005;42(9): 88-89. 梁佩红,李斯明,叶春婷,等. Ⅱ型胶原预防和治疗骨关节炎的动物实验[J].中国临床康复, 2005, 42(9): 88-89.

[8] He ZX, Jin Y, Zhang TM. Zhongguo Yaoxue Zazhi.2012;47(5): 387-391. 何兆雄,金艳,张天民.硫酸软骨素的结构及其在骨关节炎治疗中的应用[J].中国药学杂志, 2012, 47(5): 387-391.

[9] Nagler AC. Suppression of type II collagen-induced arthritis by intragastric administration of soluble type II collagen. Proc Natl Acad Sci U S A.1986;83(19): 7443-7446.

[10] Vollenhoven RF. Tolerance induction by a poorly arthritogenic collagen II can prevent collagen-induced arthritis. Cell Immunol. 1988;115(1): 146-155.

[11] Ding CH, Li Q, Xiong ZY. Oral administration of type II collagen suppresses pro-inflammatory mediator production by synoviocytes in rats with adjuvant arthritis. Clin Exp Immunol. 2003;132(3): 416-423.

[12] Trentham DE. Effects of oral administration of type II collagen on rheumatoid arthritis. Science.1993;261(5129): 1727-1730.

[13] Trentham DE. New focus on treatment for rheumatoid arthritis. Curr Opin Rheumatol.1993;5(2): 178-183.

[14] Park KS, Park MJ, Cho ML, et al. Type II collagen oral tolerance; mechanism and role in collagen-induced arthritis and rheumatoid arthritis. Mod Rheumatol. 2009;19(6): 581-589.

[15] Stancikova M, Stancik R, Gubzova Z, et al. Collagen in the treatment of rheumatic diseases--oral tolerance. Bratisl Lek Listy.1999;100(10): 567-571.

[16] Yu Y, Zhang XN, Cheng XD, et al. Xiandai Shengwu Yixue Jinzhan.2009 ;16 : 114-116. 余妍,张小宁,程小东,等.抗RA33抗体、RF、CRP、ANA与ENA联合检测在类风湿性关节炎患者诊断、治疗及预后中的作用[J]. 现代生物医学进展, 2009, 16: 114-116.

[17] Ren DJ, Pu XZ, Yu W. Zhongwai Jiankang Wenzhai.2010; 7(27): 121-123. 任冬娟,朴学哲,于威.抗CCP抗体、RF、CRP及ANA在类风湿性关节炎诊断中的评价[J]. 中外健康文摘, 2010, 7(27):121-123.

[18] Legendre F, Bauge C, Roche R, et al. Chondroitin sulfate modulation of matrix and inflammatory gene expression in IL-1 beta-stimulated chondrocytes-study in hypoxic alginate bead cultures. Osteoarthritis Cartilage.2008;16(1): 105-114.

[19] Cao XJ. Shanxi Yixue Zazhi.2011;40(10): 1433-1434. 曹西军. 膝眼注射骨肽和硫酸软骨素治疗膝关节痛90例[J]. 陕西医学杂志, 2011, 40(10): 1433-1434.

[20] Chen L, Ling PX, Zhang TM. Zhongguo Shenghua Yaowu Zazhi.2008;29(2): 137-139. 陈磊,凌沛学,张天民.硫酸软骨素在骨关节炎防治中的作用[J]. 中国生化药物杂志, 2008, 29(2): 137-139.

引言

材料方法

设计：随机对照实验。
时间及地点：于2011年5至10月在广东省医学实验动物中心完成。
材料：
Ⅱ型胶原注射骨关节炎检测C-反应蛋白及类风湿因子的表达实验所需试剂：
Experimental reagents:

实验动物：SPF级雄性SD大鼠80只，体质量110-150 g，由广东省医学实验动物中心提供，合格证号：0083113。
实验方法：
大鼠膝关节骨关节炎模型的制作：取SD大鼠80只，采用改良的Hulth法^[7]制作大鼠膝关节骨关节炎模型，按 2 mL/kg腹腔注射30 g/L戊巴比妥钠麻醉大鼠，无菌条件下取右侧下肢皮消毒膝关节部位，取髌骨旁内侧切口显露膝关节，然后切断前后交叉韧带及内侧副韧带，切除2/3内侧半月板，保留关节面，逐层闭合关节腔，不固定患肢，分笼饲养，每笼4只，自由活动。造模后3 d每天每只大鼠肌肉注射青霉素20×10⁴U预防感染。
实验分组：将造模成功后大鼠按体质量随机分组为正常对照组、模型组、Ⅱ型胶原组(Ⅱ型胶原注射治疗)、Ⅱ型胶原复合硫酸软骨素组(Ⅱ型胶原复合硫酸软骨素注射治疗)、透明质酸钠组(透明质酸钠凝胶注射治疗做阳性对照)，16只/组。各组动物于术后第1，3，5，7，9，11周关节腔注射相应的受试药物，正常对照组和模型组注射等量的生理盐水。
常规观察及称质量：每天观察动物的临床症状，着重观察右膝关节有无肿胀、有无关节活动障碍及关节僵直、有无关节脱位和肌肉萎缩等并作相应记录，若有死亡动物应及时进行解剖，取双下肢膝关节。并在第1，4，7，10，13周各测量体质量1次。
类风湿因子和C-反应蛋白检测：于大鼠造模前及造模后7，13周处死前经眼眶静脉丛采血2 mL，3 000 r/min(离心半径20 cm)离心10 min，取上清，置于-20 ℃保存，ELISA检测类风湿因子、C-反应蛋白的质量浓度。
病理观察：动物经放血处死后，迅速剥去右后肢皮肤，不打开膝关节腔取下整个膝关节，40 g/L多聚甲醛固定，4%EDTA脱钙30 d，行石蜡包埋。以膝关节为中心矢状薄切7 μm，Safranin-O染色。
主要观察指标：①各组大鼠类风湿因子、C-反应蛋白水平。②各组大鼠膝关节病理观察结果。
统计学分析：采用SPSS 16.0软件进行统计分析。计量资料数据均采用x(_)±s表示，体质量数据采用重复测量资料模块进行分析，类风湿因子、C-反应蛋白第7周数据均采用单因素方差分析，类风湿因子第13周数据采用秩和检验分析，C-反应蛋白第13周数据经数据转换后采用单因素方差分析。

讨论

Ⅱ型胶原是软骨基质的主要组成成分，它对软骨的发生、分化、迁移具有重要的诱导作用，有利于关节软骨的再生，可作为软骨损伤修复材料，同时Ⅱ型胶原对关节炎的预防和治疗也有一定的作用。目前国内外已有不少Ⅱ型胶原防治关节炎的研究^[9-13]：Nagler- Anderson^[9-10]、Ding等^[11]先后报道了经胃肠道予以不同剂量的牛Ⅱ型胶原能明显推迟大鼠胶原诱导性关节炎(佐剂型关节炎)发生的时间，减轻关节炎的严重程度，发现牛Ⅱ型胶原对大鼠佐剂型关节炎有防治作用，同时报道了口服Ⅱ型胶原对滑膜细胞功能的影响，发现治疗和预防给药均能明显恢复滑膜细胞的功能，降低肿瘤坏死因子，白细胞介素1的水平。

在大量动物模型的实验基础上，许多学者在临床上探讨口服Ⅱ型胶原对风湿性关节炎的治疗作用。1993年Ttentham等^[12-13]首先报道了口服Ⅱ型胶原治疗风湿性关节炎患者的随机对照临床研究，患者经过3个月的治疗，其关节肿胀指数和压痛指数明显优于安慰组。上述研究表明Ⅱ型胶原能够防治关节炎，延缓关节炎的发病，其作用机制是口服Ⅱ型胶原使宿主机体产生免疫耐受^[14-15]，从而抑制关节炎的发病进程。本文通采用改良的Hulth法制作大鼠膝关节骨关节炎模型，在关节炎部位分别注射Ⅱ型胶原注射液、Ⅱ型胶原复合硫酸软骨素注射液、透明质酸钠、生理盐水，对比研究Ⅱ型胶原在骨关节炎治疗效果及炎症水平调节作用机制。

临床上常采用基因检测的手段来监控关节炎的治愈进程，这些因子主要是类风湿因子、C-反应蛋白等^[16-17]。类风湿因子和C-反应蛋白在一定程度上反映了炎症的大小。本文通过检测在大鼠骨性关节炎治愈过程中类风湿因子和C-反应蛋白的表达来研究Ⅱ型胶原对骨关节炎的疗效及炎症水平的调节作用。实验结果发现，在本实验条件下，模型组大鼠血清类风湿因子、C-反应蛋白含量均有升高的趋势，随着实验周期的推移，大鼠膝关节炎症有所增加，病理检查显示术部局部膝关节软骨面损伤，细胞排列紊乱，潮线不清，局部纤维化，滑膜组织增生、炎细胞浸润，结果提示改良的 Hulth 法制作大鼠膝关节骨性关节炎模型建模成功。而给药组大鼠血清类风湿因子、C-反应蛋白含量均有下降的趋势，大鼠膝关节炎症有所缓解，病理检查显示术部局部膝关节软骨面细胞排列絮乱，但部分呈簇状，结果显示Ⅱ型胶原注射液、Ⅱ型胶原复合硫酸软骨素注射液与透明质酸钠均能改善大鼠骨关节炎的损伤程度，缓解软骨病变程度。

硫酸软骨素是关节软骨的重要组成部分，具有保护软骨、促进软骨基质的形成、缓解关节疼痛等多种药理作用与生理功能。体外及体内实验中显示硫酸软骨素具有保护关节软骨的特性^[18]，临床应用中能够减轻骨性关节炎的症状^[19]，其作用机制在于其能促进软骨细胞的合成代谢功能，促进细胞外基质结构组分的合成、更新；同时抑制分解代谢功能，抑制酶对细胞外基质的降解作用^[20]。与单纯给予Ⅱ型胶原注射治疗相比，复合硫酸软骨素的Ⅱ型胶原注射液组大鼠血清类风湿因子含量显著下降(P < 0.01)，大鼠膝关节炎症更轻，疗效更明显，说明Ⅱ型胶原复合硫酸软骨素能更有效地改善大鼠膝关节炎的损伤程度。进一步地，可以从调控炎症水平、胶原-相关受体途径、细胞因子水平、C-反应蛋白、类风湿因子等因子水平调控通路以及材料在动物体内的代谢、吸收和分布情况深入探讨Ⅱ型胶原注射型材料对骨关节炎、软骨损伤修复的机制。

致谢：感谢广东省医学实验动物中心钟志勇老师和严家荣老师等的技术性指导和帮助。
基金资助：广东省科技计划项目-社会发展专项(2009B030803060)。
作者贡献：试验设计者为第一作者，文献资料收集、成文为第二作者，审校为第一作者。
利益冲突：课题未涉及任何厂家及相关雇主或其他经济组织直接或间接的经济或利益的赞助。
伦理要求：实验过程中对动物的处置符合2009年《Ethical issues in animal experimentation》相关动物伦理学标准的条例。
作者声明：文章为原创作品，数据准确，内容不涉及泄密，无一稿两投，无抄袭，无内容剽窃，无作者署名争议，无与他人课题以及专利技术的争执，内容真实，文责自负。