自制移植肝低温保存液对氧自由基的影响

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2013.05.012

中国组织工程研究 ›› 2013, Vol. 17 ›› Issue (5): 837-842.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.2013.05.012

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自制移植肝低温保存液对氧自由基的影响

王露佳，孙雯，张金萍，王超，赵小瑜，朱玲颖，马静茹，唐雀美，郑丹燕

绍兴文理学院医学院临床医学系，浙江省绍兴市 312000

收稿日期:2012-06-12 修回日期:2012-07-20 出版日期:2013-01-29 发布日期:2013-01-29
通讯作者: 张金萍，教授，绍兴文理学院医学院临床医学系，浙江省绍兴市 312000 pjzxuan@126.com
作者简介:王露佳，男，1991年生，浙江省杭州市人，汉族，绍兴文理学院本科在读，主要从事临床医学专业。wangljsxwl@163.com
基金资助:
浙江省大学生科技创新活动计划暨新苗人才计划(2012R426025)；绍兴文理学院医学院学生科研项目(201106)；绍兴文理学院第一批校级优秀教学团队建设成果(200907)。

Effects of self-made cryopreservation solution on oxygen free radicals in cryopreserved rat liver

Wang Lu-jia, Sun Wen, Zhang Jin-ping, Wang Chao, Zhao Xiao-yu, Zhu Ling-ying, Ma Jing-ru, Tang Que-mei, Zheng Dan-yan

Department of Clinical Medicine, Medical College of Shaoxing Unviersity, Shaoxing 312000, Zhejiang Province, China

Received:2012-06-12 Revised:2012-07-20 Online:2013-01-29 Published:2013-01-29
Contact: 张金萍，教授，绍兴文理学院医学院临床医学系，浙江省绍兴市 312000 pjzxuan@126.com
About author:Wang Lu-jia, Department of Clinical Medicine, Medical College of Shaoxing Unviersity, Shaoxing 312000, Zhejiang Province, China wangljsxwl@163.com
Supported by:
Students’ Scientific Research Project of Medical College of Shaoxing University, No.201106; Construction Achievements of the First Group of School Outstanding Teaching Team in Shaoxing University, No.200907*; Science and Technology Innovation Planning of University Students in Zhejiang Province, Xinmiao Talent Planning, No.2012R420625

摘要/Abstract

摘要：

背景：在肝脏移植过程中，低温保存和缺血可导致肝脏产生氧自由基而损伤肝组织。
目的：研究自制器官保存液对低温保存大鼠肝脏氧自由基的影响，并与器官保存液的“金标准”UW液进行对比。
方法：16只9周龄SD大鼠随机分为实验组和对照组，每组8只。建立SD大鼠肝脏灌注模型，分别用自制器官保存液组和UW液组灌洗肝脏，取出肝脏置于4 ℃保存液中，于保存24，48，72 h后分别检测肝脏超氧化物歧化酶、一氧化氮合酶、总抗氧化能力和活性丙二醛水平。
结果与结论：自制器官保存液对大鼠肝脏低温保存各时点超氧化物歧化酶、一氧化氮合酶、总抗氧化能力活性及丙二醛含量与UW液组比较差异均无显著性意义(P > 0.05)，表明自制器官保存液能够减轻缺血再灌注后氧自由基对大鼠肝脏的损伤。自制器官保存液对低温保存大鼠肝脏在减轻氧自由基损伤方面有较好的效果，与UW液相当。

关键词: 器官移植, 肝移植, 器官保存液, 自制器官保存液, UW液, 低温保存, 肝脏, 移植, 氧自由基, 省级基金

Abstract:

BACKGROUND: During liver transplantation, cryopreservation and ischemia can lead to production of oxygen free radicals by the liver which damages liver tissue.
OBJECTIVE: To study the effects of self-made cryopreservation solution on oxygen free radicals in cryopreserved rat liver, and to compare with “gold standard” organ preservation solution-UW solution.
METHODS: Sixteen 9-week-old Sprague Dawley rats were randomly divided into two groups: experimental group and control group, 8 rats in each group. Sprague Dawley rat liver perfusion models were established, and the livers in each group were lavaged with self-made organ preservation solution and UW preservation solution, then removed the liver and placed into 4℃preservation solution. The superoxide dismutase, nitric oxide synthase, total antioxidant capacity activity and the malondialdehyde content were detected at 24, 48 and 72 hours after preservation.
RESULTS AND CONCLUSION: There were no significant differences in superoxide dismutase, nitric oxide synthase, total antioxidant capacity activity and the malondialdehyde content in rat liver tissue cryopreserved in the self-made organ preservation solution versus UW solution (P > 0.05). These findings suggest that self-made organ preservation solution can reduce the damage of oxygen free radical to the livers of rats after ischemia-reperfusion and the effect is equivalent to UW solution.

Key words: organ transplantation, liver transplantation, organ preservation solution, self-made organ preservation solution, UW solution, cryopreservation, liver, transplantation, oxygen free radicals, provincial grants-supported paper

中图分类号:

R318

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图/表（结果） 4

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引言

材料方法

设计：随机分组，对照实验观察。

时间及地点：于2009年6月至2012年6月在绍兴文理学院医学院实验中心完成。

材料：

实验动物：健康SD大鼠16只，体质量约350 g，购于浙江大学实验动物中心，合格证号：scxk(2007-0029)，随机数字表发法均分为实验组(自制器官保存液组)和对照组(UW保存液组)。

自制器官保存液主要成分：还原性谷胱甘肽、聚乙二醇20000、腺苷(购自上海源叶生物科

技有限公司)、ATP、别嘌呤醇、L-精氨酸、L-色氨酸(购自北京科尔迪生物技术有限公司)、川芎嗪(长春国奥药业有限公司)、苦碟子(沈阳双鼎制药有限公司)、磷酸氢二钠/磷酸二氢钾缓冲液，pH调至7.5-8.0，500- 1 000 mL聚乙烯塑料袋包装，采用高温高压(109 ℃，45 min)消毒。

UW保存液：美国威斯康星大学保存液，解放军第二军医大学长征医院药学部提供。

自制移植肝低温保存液对氧自由基影响实验的主要仪器及试剂：

Main reagents and instruments in the experiment to study the effect of self-made cryopreservation solution on oxygen free radicals:

方法：

大鼠肝脏灌注模型的建立：建模前大鼠禁食12 h，称质量记录。5%异戊巴比妥钠以100 mg/kg行大鼠腹腔注射麻醉，腹部剪毛，将四肢及牙齿固定于鼠板上，经尾静脉注射肝素稀释液3 mL(含肝素150 U)。按周智华等^[9]方法制备大鼠肝脏灌注模型。经门静脉置管原位灌注 4 ℃保存液，以5 mL/min的流速行肝脏原位灌注30 min至肝脏变为土黄色，然后取两组肝脏，分别置于4 ℃自制器官保存液和UW保存液中保存。

肝脏组织匀浆和组织标本的制备：肝脏标本分别保存24，48，72 h后从器官液和UW液中取出，冷生理盐水洗净后滤纸拭干、称质量。用子天平称取肝脏中叶组织500 mg，加入9倍冷生理盐水，制备匀浆，肝脏组织匀浆4 000 r/min离心15 min，离心半径13.5 cm，取上清液进行各项指标的测定。

超氧化物歧化酶、一氧化氮合酶、总抗氧化能力活性和丙二醛含量的检测：化学比色法测定肝脏组织中总抗氧化能力及一氧化氮合酶活性，羟胺法测定超氧化物歧化酶活性，TBA法测定丙二醛含量。严格按试剂盒说明书进行。

主要观察指标：肝脏组织总抗氧化能力、一氧化氮合酶活性、超氧化物歧化酶活性及丙二醛含量变化。

统计学分析：统计学处理由第一作者完成。结果以x(_)±s表示，用SPSS for Windows 12.0软件进行统计分析，采取t 检验，P < 0.05认为差异有显著性意义。

讨论

近年来，临床肝移植已在全世界范围内广泛开展，被作为终末期肝病、急性肝功能衰竭、先天性及代谢性肝病和部分肝肿瘤的最为有效的治疗手段^[9-10]。肝移植术可导致肝脏缺血再灌注损伤，使肝组织结构改变、肝细胞功能丧失，最终导致肝脏损伤及肝功能衰竭^[11]。肝脏缺血再灌注损伤是一个多因素参与、多通路共同发挥作用的复杂病理生理过程，目前研究认为其发生机制主要有以下几个方面：氧自由基过量生成、细胞内钙超载、微循环障碍及炎性细胞因子的参与等，其中氧自由基被认为是其中最重要的一个因素^[12]。

肝脏是人体内最大的代谢器官，对缺血缺氧较为敏感，肝移植过程中肝脏的移植、器官保存液的灌注和低温保存都会伴有一定程度肝脏缺血再灌注损伤。肝脏发生缺血后，黄嘌呤氧化酶和来自AMP的次黄嘌呤(HX)在组织中堆积，再灌注后大量分子氧进入缺血组织，自由基的产生也急剧增加；同时再灌注过程中产生的超氧化物和过氧化物可继续反应生成羟基自由基和单线态氧，继而转化为有机过氧化物自由基(RO-、ROO-)和氢过氧化物(ROOH)。这些自由基攻击生物膜结构的磷脂不饱和脂肪酸，引起膜系统的结构和功能改变^[13-15]，造成肝脏功能损伤，影响肝脏移植的成功。

早期机体器官发生缺血再灌注损伤时，通过氧自由基(OFR)清除系统清除氧自由基，保护肝脏细胞。丙二醛为脂质过氧化代谢产物之一，丙二醛含量的高低能反映组织或细胞的损伤，它的升高提示脂质过氧化的形成增多，组织或细胞损伤明显^[16]，肝脏缺血再灌注后丙二醛含量会因此增加。总抗氧化能力是综合反映组织抗活性氧对机体损伤能力的敏感指标^[17]，其大小可代表和反映机体的抗氧化酶系统和非酶系统对外来刺激的代偿能力以及机体自由及代谢状态^[18]。超氧化物歧化酶为内源性氧自由基清除剂，哺乳类动物细胞中的超氧化物歧化酶可歧化超氧阴离子生成过氧化氢，保护细胞不受强毒性氧自由基损伤，正常情况下与体内其它内源性氧自由基清除剂一同清除体内代谢产生的氧自由基，其活性高低基本代表了组织清除氧自由基的能力^[19]。多数学者认为，病理状态下器官在低温保存过程中受损后其NO降低^[20]。

自制器官保存液中含有L-精氨酸、聚乙二醇、L-色氨酸、川芎嗪、苦碟子等成分。L-精氨酸是一氧化氮(NO)的前体，L-精氨酸可通过降低体内氧自由基水平，提高NO水平，改善缺血再灌注损伤时肝脏的能量代谢^[26]。聚乙二醇在器官保存液中可发挥保护细胞膜、维持细胞骨架完整性、防止细胞水肿、抗脂质过氧化和免疫调节的作用^[27]。L-色氨酸有细胞膜稳定作用。研究表明，川芎嗪具有钙拮抗作用；可以抑制黄嘌呤氧化酶生成，具有很强的清除氧自由基的作用^[28]；能抑制肝脏组织中性粒细胞的浸润，保护肝窦内皮并逆转其功能紊乱^[29]，抑制肝细胞凋亡，使肝细胞的再灌注损伤得以减轻^[30]。苦碟子总黄酮成分可以增强机体自由基的清除能力，减少脂质过氧化反应，抑制脂质过氧化反应，对组织缺血再灌注损伤有明显的保护作用^[31]。课题组前期研究证实，自制器官保存液能明显减轻低温保存大鼠睾丸氧自由基损伤^[32]。

实验结果显示，随着低温保存肝脏时间的延长，实验组和对照组肝组织丙二醛、一氧化氮合酶、TAO-C均逐渐下降，实验组下降幅度较对照组缓慢；实验组同时间点丙二醛含量均高于对照组；实验组对低温保存大鼠肝脏同时点超氧化物歧化酶、一氧化氮合酶和总抗氧化能力活性及丙二醛含量与对照组比较，差异均无显著性意义(P > 0.05) ，上述指标均表明自制器官保存液的川芎嗪和苦碟子能够协同作用，共同发挥对抗氧自由基的作用减轻肝脏缺血再灌注的损伤^[33-34]，对低温保存大鼠肝脏具有较好的保护作用，与UW液相当。

综上所述，自制器官保存液成分简单，价格低廉，对低温保存离体大鼠肝脏在对抗氧自由基损伤时有较好的效果，与UW液相当，其成分具有潜在的研究价值，但仍需进一步改进与研究。

自制移植肝低温保存液对氧自由基的影响

Effects of self-made cryopreservation solution on oxygen free radicals in cryopreserved rat liver

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