创伤性深静脉血栓形成与血液中Hmox-1基因的表达

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2013.02.019

摘要/Abstract

摘要：

背景：目前深静脉血栓的诊断主要依赖于影像学和实验室检查，其最致命的不足是血栓已经形成方能明确诊断。因此有必要采用先进的分子技术对其进行研究，探索其发生发展的内在规律。
目的：观察Hmox-1在大鼠创伤性深静脉血栓形成过程中的变化，探讨其作为预测诊断深静脉血栓分子标记物的可行性。
方法：采用钳夹大鼠双侧股静脉和双后肢人字石膏固定的方法建立创伤性深静脉血栓形成模型。依据造模时间和血栓形成状态，将100只实验大鼠随机分为5组：正常对照组、创伤即刻组、血栓形成前期组、血栓形成高峰期血栓形成组、血栓形成高峰期血栓不形成组。Real time-PCR检测血液中Hmox-1基因表达，并切取双侧股静脉血管进行组织学观察血栓形成程度。
结果与结论：建立大鼠创伤性深静脉血栓形成模型后25 h，血栓形成率58%(38/65)；血栓形成前期组、血栓形成高峰期血栓形成组Hmox-1表达高于正常对照组(P < 0.05)，而血栓形成高峰期血栓不形成组与正常对照组比较差异无显著性意义。Hmox-1在血液中的表达变化趋势与血栓形成生物学过程相符，有可能作为预测大鼠深静脉血栓形成的标志物。

关键词: 组织构建, 组织构建细胞学实验, 深静脉血栓, Hmox-1, 预测诊断, 大鼠, 血栓形成, 动物模型, 组织构建图片文章

Abstract:

BACKGROUND: The diagnosis of deep vein thrombosis is mainly dependent on imaging and laboratory tests, and the most fatal lack is that thrombosis can be confirmed until it has been formed. Accordingly, it is necessary to explore inherent rules using molecular technology.
OBJECTIVE: To observe the Hmox-1 expression in the process of formation of traumatic deep vein thrombosis in rats and to discuss the feasibility of Hmox-1 as a molecular marker for predictive diagnosis of deep vein thrombosis.
METHODS: Bilateral femoral veins were clamped and both hind limbs were fixed in rats to prepare traumatic deep venous thrombosis models. According the modeling time and formation of thrombosis, 100 experimental rats were randomized into five groups: normal group, trauma group, pre-thrombosis group, group of thrombosis formation at peak stage, group of non-thrombosis formation at peak stage. Real time-PCR was used to detect blood Hmox-1 mRNA expression. Bilateral femoral veins were isolated for histological observation of thrombosis degree.
RESULTS AND CONCLUSION: At 25 hours after modeling, the thrombosis rate was 58.46% (38∕65). mRNA expression of Hmox-1 in the pre-thrombosis group and group of thrombosis formation at peak stage was higher than that of the normal group (P < 0.05). There was no significant difference in the Hmox-1 mRNA expression between the normal group and the group of non-thrombosis formation at peak stage. These findings indicate that the variation tendency of Hmox-1 in the blood is consistent with the biological process of thrombosis formation, and Hmox-1 may become a marker for predictive diagnosis of deep venous thrombosis.

Key words: tissue construction, cytological experiments of tissue construction, deep vein thrombosis, Hmox-1, predictive diagnosis, rats, thrombosis, animal models, tissue construction photographs- containing paper

中图分类号:

R318

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图/表（结果） 8

2.1 实验动物一般情况造模的90只SD大鼠死亡5只，1只在麻醉过程中死亡；2只在造模过程中因股血管破裂，出血、休克死亡；2只在造模后25 h内死亡。
2.2 大体及光镜观察结果创伤即刻组、血栓形成前期组双下肢肢体肿胀不明显，大体观察均无血栓形成。造模后25 h存活65只SD大鼠，其中46只大鼠双足肿胀明显、肢端皮肤颜色青紫、局部反应重，大体可见股静脉内有血栓形成大鼠38只，见图1。

图1 大体观察SD大鼠下肢股静脉血栓形成情况
Figure 1 Gross observation of femoral vein thrombosis in the hind limbs of Sprague-Dawley rats

图2 光镜下观察SD大鼠下肢股静脉血栓形成情况
Figure 2 Light microscopy observation of femoral vein thrombosis in the hind limbs of Sprague-Dawley rats

经光镜观察结果显示：1级血栓大鼠16只，2级血栓大鼠22只；该时相点无血栓形成大鼠27只，见图2和表1。从38只有血栓形成SD大鼠中随机选10只纳入血栓形成高峰期血栓形成组，从27只无血栓形成SD大鼠中随机选10只纳入血栓形成高峰期血栓不形成组。

2.3 Real time-PCR检测Hmox-1的扩增和熔解曲线 Real Time PCR检测结果表明，各扩增曲线良好，呈明显的“s”型；各熔解曲线未见杂峰，也未出现主峰的异常增宽，说明Hmox-1序列扩增特异性较高，见图3-6。

图3 血栓形成高峰期血栓不形成组Hmox-1和GAPDH扩增曲线
Figure 3 Amplification curves of Hmox-1 and GAPDH in the group of non-thrombosis formation at peak stage

图4 血栓形成高峰期血栓不形成组Hmox-1和GAPDH熔解曲线
Figure 4 Melting curves of Hmox-1 and GAPDH in the group of non-thrombosis formation at peak stage

图5 血栓形成高峰期血栓形成组Hmox-1和GAPDH扩增曲线
Figure 5 Amplification curves of Hmox-1 and GAPDH in the group of thrombosis formation at peak stage

图6 血栓形成高峰期血栓形成组Hmox-1和GAPDH熔解曲线
Figure 6 Melting curves of Hmox-1 and GAPDH in the group of thrombosis formation at peak stage

2.4 Hmox-1在相应时间点变化趋势比较见图7。
Real time-PCR对样品进行检测，计算出ΔΔCt值进行比较，创伤即刻组、血栓形成高峰期血栓不形成组变化不明显，与正常对照组比较差异无显著性意义(P > 0.05)；血栓形成前期组、血栓形成高峰期血栓形成组表达增高，与正常对照组比较差异有显著性意义(P < 0.05)。

图7 Real time-PCR检测各组SD大鼠血液中Hmox 1-基因表达变化趋势
Figure 7 Real time-PCR detection showed the variation tendency of Hmox-1 in the blood of Sprague-Dawley rats

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引言

材料方法

设计：随机对照动物实验。

时间及地点：实验于2010年1至12月在昆明医学院动物实验中心实验室完成。

材料：100只成年SD大鼠，SPF级，体质量250-310 g，雌雄不限，购于昆明医学院动物实验中心，标准环境下饲养。实验前适应性喂养2周。

实验方法：

动物造模：采用钳夹大鼠双侧股静脉和双后肢人字石膏固定的方法建立创伤性深静脉血

栓形成模型。大鼠称质量后腹腔注射3%戊巴比妥钠溶液(1 mL/kg)，麻醉起效后仰卧于手术

台，消毒、铺巾、行腹股沟内侧纵行切开约1 cm皮肤，分离皮下组织，显露并游离股静脉血管，运用12号蚊式钳紧扣于股静脉血管不同的3个部位，力量为血管钳紧一扣持续3 s，钳夹造模后用一号丝线全层间断缝合切口，同法处理另一侧后行髋人字石膏固定。造模后大鼠正常饲养，不使用抗生素。

标本取材和处理：根据造模时间和深静脉血栓形成变化过程，在对应的时相点分别切取大鼠双侧4.0-5.0 cm股静脉血管。每条股静脉血管切取0.5-1.0 cm，用甲醛固定保存，进行苏木精-伊红染色组织切片病理学检测；用静脉采血针由大鼠心脏采集血液，每只大鼠取约2 mL的血液置于生化检查取血管中。采集的血液标本静置于室温中2 h后将采血管置于离心机，4 000 r/min离心 20 min，将离心后沉淀的细胞按分组加入到装有Trizol的1.5 mL离心管中充分混合、摇匀，室温静置5 min。采用Trizol一步法对沉淀的细胞进行总RNA提取，通过3%琼脂糖凝胶电泳测量其质量，初检合格(28S RNA和18S RNA条带整齐，两者带宽比值超过2倍)的RNA样品用-80 ℃冰箱保存备用。Real time-PCR检测Hmox-1在创伤性深静脉血栓形成中的表达。

主要观察指标：大鼠血液中Hmox-1在创伤性深静脉血栓形成中的表达及血管组织血栓形成情况。

统计学分析：应用统计分析软件SPSS 11.5进行统计分析，相关性分析采用Pearson相关分析，P < 0.05为差异有显著性意义。

讨论

骨折与创伤是骨科患者发生深静脉血栓最常见的重要因素。骨折、创伤可视为深静脉血栓发生的始动因素，它可引起肢体水肿而损伤或压迫静脉，造成静脉内血流速度减慢、血管内皮损伤，激活凝血系统，使血液处于高凝状态^[6]。

实验采用了股静脉血管直接创伤(血管钳夹)加髋人字石膏外固定的方式来建立创伤性深静脉血栓形成动物模型，以提高血栓的发生率。结果显示：造模后25 h，血栓形成率达58%(38/65)；形成的血栓以2、3级血栓为主，表现为混合型血栓，横切面上管腔内可见大量的纤维蛋白形成的支架，其间充满血小板和红细胞，与血管附着处部分内皮细胞脱落消失，血管壁不同程度损伤、炎症细胞浸润。实验中血栓形成的发生、发展及其血栓形态等均与这一临床情况相似，说明造模方法可行，具有一定的代表性，可较好地反映深静脉血栓形成的发生、发展变化规律。可适用于创伤或手术诱发的急性深静脉血栓形成病变发生机制的研究。

Hmox是血红素氧化的限速酶，在体内有3种同工酶：Hmox-1、Hmox-2 和Hmox-3。Hmox-1也称之为热休克蛋白32，是目前研究最多的一种同工酶。Hmox-1可以被许多不同种类的因素所诱导，诱导因素为创伤应激、缺氧、内毒素等，诱导性表达于血管平滑肌、血液、肝、脑等组织。Hmox-1在深静脉血栓形成调控网络中具有重要的作用，与深静脉血栓形成的发生、发展密切相关^[7-11]。Hmox-1及其产物一氧化碳通过减轻炎症反应，内皮细胞损伤，抑制血栓的形成，为机体提供重要保护作用。实验研究中，针对血栓形成不同关键时相点，对深静脉血栓形成大鼠血液中Hmox-1的表达变化进行动态检测，研究其作为预测诊断深静脉血栓分子标记物的可行性。实验结果显示：血栓形成前期组、血栓形成高峰期血栓形成组较正常对照组发生显著差异上调表达，而血栓形成高峰期血栓不形成组较正常对照组轻微上调表达。因此，通过检测血液中Hmox-1在血栓形成前的表达变化，有可能成为诊断创伤性深静脉血栓的一种新方法。

致谢：感谢昆明医学院第一附属医院骨科在实验过程给予的帮助。

作者贡献：实验设计为郑燕科、李宏坤，实验实施为郑燕科、李宏坤，实验评估为郑燕科、李宏坤，资料收集为郑燕科。郑燕科成文，李宏坤、陈荣剑、赵敏、汤善华、吕仁发审校，郑燕科、李宏坤对文章负责。

利益冲突：课题未涉及任何厂家及相关雇主或其他经济组织直接或间接的经济或利益的赞助。

伦理要求：实验过程中对动物的处置符合2009年《Ethical issues in animal experimentation》相关动物伦理学标准的条例。

作者声明：文章为原创作品，数据准确，内容不涉及泄密，无一稿两投，无抄袭，无内容剽窃，无作者署名争议，无与他人课题以及专利技术的争执，内容真实，文责自负。

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