脐带间充质干细胞通过旁分泌机制维持原代小鼠肝细胞的体外生长

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.1785

中国组织工程研究 ›› 2019, Vol. 23 ›› Issue (25): 4031-4036.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.1785

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脐带间充质干细胞通过旁分泌机制维持原代小鼠肝细胞的体外生长

吴源泉，吴建华，王梁，林洋

喀什地区第一医院，新疆维吾尔自治区喀什市 844000

修回日期:2019-03-18 出版日期:2019-09-08 发布日期:2019-09-08
通讯作者: 林洋，主任医师，喀什地区第一医院，新疆维吾尔自治区喀什市 844000
作者简介:吴源泉，男，1973年生，重庆市云阳县人，汉族，主任医师，主要从事肝胆外科专业及医疗行政管理。
基金资助:
新疆维吾尔自治区自然科学基金(2016D01C025)，项目负责人：吴源泉

Umbilical cord mesenchymal stem cells support the in vitro growth of primary mouse hepatocytes by a paracrine mechanism

Wu Yuanquan, Wu Jianhua, Wang Liang, Lin Yang

Kashgar Region First Hospital, Kashgar 844000, Xinjiang Uygur Autonomous Region, China

Revised:2019-03-18 Online:2019-09-08 Published:2019-09-08
Contact: Lin Yang, Chief physician, Kashgar Region First Hospital, Kashgar 844000, Xinjiang Uygur Autonomous Region, China
About author:Wu Yuanquan, Chief physician, Kashgar Region First Hospital, Kashgar 844000, Xinjiang Uygur Autonomous Region, China
Supported by:
the Natural Science Foundation of Xinjiang Uygur Autonomous Region, No. 2016D01C025 (to WYQ)

摘要/Abstract

摘要：

文章快速阅读：

文题释义：
旁分泌：间充质干细胞能够合成多种生长因子和细胞因子，对局部细胞动力学发挥旁分泌作用。这些旁分泌效应包括刺激血运重建，增强内源性细胞增殖等。
肝细胞生长因子：是目前已知生物活性最广泛的生长因子之一，具有重要的生物学功能，可以促进有丝分裂、血管生成和抗凋亡，是肝细胞增殖的最强促有丝分裂原。

摘要
背景：肝细胞移植对于晚期肝功能衰竭患者是一种非常有效的替代治疗方法，体外条件下扩增培养肝细胞具有非常重要的临床意义。
目的：体外实验探讨人脐带间充质干细胞对原代小鼠肝细胞功能的调控作用。
方法：实验分3组：①人脐带间充质干细胞与原代小鼠肝细胞非接触共培养(非接触共培养组)；②人脐带间充质干细胞培养液上清与原代小鼠肝细胞共培养(上清组)；③原代小鼠肝细胞用含体积分数为10%胎牛血清的低糖DMEM培养(常规培养组)。培养48，72，96 h，采用MTT法检测3组肝细胞增殖情况，吲哚菁绿检测肝细胞相关功能，ELISA法检测白蛋白及尿素分泌情况，RT-PCR检测肝细胞相关基因表达。该研究的实施符合喀什地区第一人民医院的相关伦理要求(伦理批件号：01号)。
结果与结论：①与常规培养组相比，培养48，72，96 h时非接触共培养组和上清组都可以显著促进小鼠肝细胞增殖，差异有显著性意义(P < 0.05)；②与常规培养组相比，培养96 h时非接触共培养组和上清组都可以维持小鼠肝细胞的摄取功能活性，差异有显著性意义(P < 0.05)；③与常规培养组相比，在48 h和96 h时非接触共培养组和上清组小鼠肝细胞分泌白蛋白及尿素水平显著升高，差异有显著性意义(P < 0.05)；④与常规培养组相比，非接触共培养组和上清组HGF、bFGF以及ALB mRNA表达显著升高，差异有显著性意义(P < 0.05)；但细胞色素基因CYP2B9的表达在3组细胞内差异无显著性意义(P > 0.05)；⑤结果表明，脐带间充质干细胞可通过旁分泌机制在体外维持原代小鼠肝细胞功能，并促进其增殖，是体外条件下人工扩增肝细胞的一种新的应用策略。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程
ORCID: 0000-0002-0660-0416(吴源泉)

关键词: 人脐带间充质干细胞, 肝细胞, 共培养, 旁分泌, 肝细胞生长因子, 肝功能, 新疆维吾尔自治区自然科学基金

Abstract:

BACKGROUND: Hepatocyte transplantation is a very effective alternative treatment for patients with advanced liver failure. It is of very important clinical significance to expand and culture hepatocytes in vitro.
OBJECTIVE: To explore the regulatory effect of human umbilical cord mesenchymal stem cells on the function of primary mouse hepatocytes under in vitro conditions.
METHODS: Umbilical cord mesenchymal stem cells were co-cultured with primary mouse hepatocytes in a non-contacted way (co-culture group). Umbilical cord mesenchymal stem cell supernatant was collected and co-cultured with primary mouse hepatocytes (conditioned medium). Primary mouse hepatocytes were cultured in conventional culture medium containiing low-dose DMEM+10% fetal bovine serum as control group. Cell counting kit-8 method was used to detect the proliferation of three groups of hepatocytes. RT-PCR was used to detect the expression of hepatocyte-related genes. Indocyanine green detection was used to detect the function of hepatocytes. ELISA method was used to detect the secretion of albumin and urea. The implementation of the study was in line with the relevant ethical requirements of Kashgar Region First Hospital (ethical approval No. 01).
RESULTS AND CONCLUSION: Compared with the control group, umbilical cord mesenchymal stem cells could significantly retain the uptake ability of mouse hepatocytes (96 hours of culture) and promote their proliferation (48, 72, and 96 hours of culture) by non-contact co-culture (P < 0.05) or supernatant culture (P < 0.05). Compared with the control group, the primary mouse hepatocytes in the co-culture group and the conditioned medium group had significantly stronger albumin and urea secretion ability (P < 0.05). RT-PCR detection of related genes revealed higher expression of hepatocyte growth factor, basic fibroblast growth factor and album mRNAs in the co-culture group and conditioned medium group than the control group (P < 0.05). However, we observed similar results in the expression of the cytochrome gene Cyp2b9 in the three groups (P > 0.05). Overall, umbilical cord mesenchymal stem cells can preserve the function of primary mouse hepatocytes in vitro by the paracrine mechanism and promote their proliferation. It is a new application strategy for artificially expanding hepatocytes in vitro.

Key words: human umbilical cord mesenchymal stem cells, hepatocytes, co-culture, paracrine, hepatocyte growth factor, liver function, Natural Science Foundation of Xinjiang Uygur Autonomous Region

中图分类号:

吴源泉，吴建华，王梁，林洋. 脐带间充质干细胞通过旁分泌机制维持原代小鼠肝细胞的体外生长[J]. 中国组织工程研究, 2019, 23(25): 4031-4036.

Wu Yuanquan, Wu Jianhua, Wang Liang, Lin Yang. Umbilical cord mesenchymal stem cells support the in vitro growth of primary mouse hepatocytes by a paracrine mechanism[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2019, 23(25): 4031-4036.

图/表（结果） 3

2.1 原代小鼠肝细胞的形态 胶原酶灌注后，将获取的细胞悬液贴壁培养，1 d后即可看见肝细胞贴壁生长，细胞呈圆形，胞浆透亮，呈现为成团、克隆样成长方式，见图1。锥虫蓝染色活细胞比例在75%以上。

2.2 脐带间充质干细胞的形态及鉴定结果 光镜下可见第3代脐带间充质干细胞呈现间充质干细胞特有的梭状细胞形态，呈漩涡状生长，见图2A。流式细胞仪检测脐带间充质干细胞表达CD29、CD44和CD90，不表达CD34、CD45。成骨、成脂实验证实脐带间充质干细胞具有多能分化潜能，见图2B，C。

2.3 ELISA法检测脐带间充质干细胞培养上清中肝细胞生长因子、血管内皮生长因子水平 与对照组皮肤成纤维细胞相比，脐带间充质干细胞可分泌出大量的肝细胞生长因子[(968.4±86.8) μg/L，(35.8±3.6) μg/L，P < 0.001]，血管内皮生长因子也是同样的结果[(440.8±35.5) μg/L，(45.4± 6.8) μg/L，P < 0.001]，见图3。

2.4 各组小鼠肝细胞增殖情况 与常规培养组相比，培养48，72，96 h时非接触共培养组和上清组都可以显著促进小鼠肝细胞增殖，差异有显著性意义(P < 0.05)，见图4。

2.5 各组小鼠肝细胞吲哚菁绿摄取功能 与常规培养组相比，非接触共培养组和上清组都可以维持小鼠肝细胞的摄取功能活性，差异有显著性意义(P < 0.05)，见图5。

2.6 各组小鼠肝细胞分泌白蛋白及尿素水平 在48 h和96 h时，与常规培养组相比，非接触共培养组和上清组小鼠肝细胞分泌白蛋白及尿素水平显著升高，差异有显著性意义(P < 0.05)，见图6。

2.7 RT-PCR检测各组小鼠肝细胞内HGF，bFGF，ALB及CYP2B9 mRNA表达 与常规培养组相比，非接触共培养组和上清组表达更高的HGF、bFGF以及ALB mRNA，差异有显著性意义(P < 0.05)；但细胞色素基因CYP2B9的表达在3组细胞内差异无显著性意义(P > 0.05)，见图7。

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引言

材料方法

1.1 设计 细胞学体外实验。

1.2 时间及地点 实验于2018年6至12月在喀什地区第一人民医院实验室完成。

1.3 材料

1.3.1 实验动物 雄性c57b小鼠10只，SPF级，6-8周龄，体质量60-80 g，由中山大学北校区动物实验中心提供，屏障环境饲养。

1.3.2 实验试剂和仪器 氯胺酮、HBSS溶液+EGTA、胎牛血清、DMEM培养基、胰蛋白酶、EDTA、鼠抗人CD29、CD34、CD44、CD45、CD90单克隆抗体工作液、PBS、BSA、小鼠抗人肝细胞生长因子、血管内皮生长因子单抗、肝细胞生长因子、血管内皮生长因子多抗、MTS、吲哚菁绿、流式细胞仪、体积分数5%CO₂饱和湿度培养箱、溶液浓缩器(millipore，爱尔兰)；ELISA检测试剂盒(R&D公司，美国)；小鼠尿素ELISA检测试剂盒(Sigma-Aldrich公司，德国)；实时PCR仪、PrimeScript^TM RT reagent Kit试剂盒、SYBR^® Premix Ex Taq kit试剂盒。

1.4 实验方法

1.4.1 胶原酶灌注法提取原代小鼠肝细胞 雄性c57b小鼠腹腔内注射氯胺酮(0.1 g/kg)麻醉。采用实验室引进的肝细胞灌注设备进行肝细胞分离：预热的HBSS溶液+EGTA经门静脉插管灌入小鼠肝脏组织内，同时胶原酶灌入肝脏组织消化6-8 min，随后将软化肝脏组织取出并置入预冷15 mL离心管内，通过300目筛网将肝细胞筛选出来，PBS清洗2次，2 000 r/min离心10 min，弃上清，将肝细胞重悬于含体积分数10%胎牛血清、100 U/mL青霉素、100 U/mL链霉素的低糖DMEM完全培养基中。取10 μL重悬后细胞混合液，锥虫蓝检测活细胞比例。

1.4.2 组织块贴壁法提取脐带间充质干细胞 无菌条件获取健康胎儿脐带并将其剪成2 cm小段组织，尽量剔净脐带外膜组织、脐动静脉等，将Wharton胶剥离并将其剪成1 mm×1 mm×1 mm的小块，接种于含体积分数10%胎牛血清、100 U/mL青霉素、100 U/mL链霉素的低糖DMEM培养基中，置于37 ℃，体积分数5%CO₂饱和湿度培养箱培养；5 d后首次全量换液，8-10 d后去除贴块，可得到贴壁生长的脐带间充质干细胞；细胞达80%融合后，用2.5 g/L胰蛋白酶和0.01%EDTA消化并按1∶2传代。取第3代培养细胞，制成单细胞悬液，加入鼠抗人CD29、CD34、CD44、CD45、CD90单克隆抗体工作液，4 ℃避光孵育30 min，PBS冲洗后进行固定，流式细胞仪检测细胞表型分子。结合成脂、成骨实验鉴定为脐带间充质干细胞，取第3代细胞用于实验。

1.4.3 制备脐带间充质干细胞培养上清液 第3代脐带间充质干细胞培养至70%融合时，弃去培养液上清，PBS清洗2遍后，将含体积分数为0.1%胎牛血清的低糖DMEM培养液加入细胞培养瓶中，24 h后收集培养液上清，4 ℃条件下3 000 r/min离心10 min，将离心好的培养液上清加入3 kD、浓缩24倍的溶液浓缩器中，12 000 r/min离心30 min，获取培养液上清备用。

1.4.4 酶联免疫吸附法检测脐带间充质干细胞上清液中肝细胞生长因子、血管内皮生长因子水平 参照试剂盒说明书操作，96孔酶标板已被肝细胞生长因子、血管内皮生长因子多抗包被，将酶标板置于4 ℃冰箱内过夜，PBS洗3次；每孔加入1%BSA封闭，37 ℃ 1 h，PBS洗3次；每孔加入100 μL上述处理的脐带间充质干细胞上清液，4 ℃过夜，PBS冲洗3次；每孔加入100 μL小鼠抗人肝细胞生长因子、血管内皮生长因子单抗(用1%BSA的PBS稀释成4 mg/L)，37 ℃ 1 h，PBS洗3次；每孔加入OPD底物液100 μL，室温10-15 min；每孔加入1 mol/L H₂SO₄ 50 μL终止反应；在450 nm处测定吸光度值。根据标准曲线计算肝细胞生长因子、血管内皮生长因子水平，对照组选用人皮肤成纤维细胞(来源于门诊手术室包皮环切标本，患者签署知情同意书)。

1.4.5 实验分组 实验共分3组：①常规培养组：将1×10⁹L^-1小鼠肝细胞平铺于6孔板内，加入2 mL完全培养基(低糖DMEM+体积分数为10%胎牛血清)；②上清组：将1×10⁹ L^-1小鼠肝细胞平铺于6孔板内，加入2 mL脐带间充质干细胞培养液上清；③非接触共培养组：将1×10⁹ L^-1小鼠肝细胞平铺于Transwell板下室，5×10⁸ L^-1脐带间充质干细胞平铺于Transwell板上室，构建非接触共培养体系，培养液亦为2 mL完全培养基。

1.4.6 MTT实验检测各组肝细胞增殖情况 将5×10⁷ L^-1肝细胞按上述3组方法处理后转移至24孔板内，分别培养48，72，96 h后移除所有培养液，加入含40 μL MTS的完全培养基(总体积200 μL)，37 ℃培养箱孵育90 min，采用分光光度计检测490 nm波长下吸光度值。

1.4.7 吲哚菁绿摄取实验检测肝储备功能 30 μL吲哚菁绿(ICG)与320 μL完全培养基混合均匀后重悬上述3组方法处理后的肝细胞，调整细胞浓度为5×10⁷ L^-1，随后将其加入24孔板内，37 ℃培养箱孵育90 min，检测每孔内肝细胞摄取吲哚菁绿的能力，采用ImageJ软件量化肝细胞吸收率(Version 1.50 developedat NIH)。

1.4.8 ELISA法检测白蛋白、尿素分泌情况 上述3组细胞培养48，72，96 h，提取肝细胞完全培养基，2 000 r/min离心10 min，利用小鼠白蛋白ELISA检测试剂盒和小鼠尿素ELISA检测试剂盒检测白蛋白及尿素分泌情况。

1.4.9 RT-PCR检测肝细胞内HGF，bFGF，ALB及CYP2B9 mRNA表达 上述3组肝细胞分别培养48，96 h后，移除培养液，PBS清洗2次，利用Trizol提取细胞总RNA，紫外分光光度计测定RNA纯度与浓度，分别利用PrimeScript™ RT reagent Kit试剂盒与SYBR^® Premix Ex Taq kit试剂盒进行qPCR反应，GAPDH作为内参。反应条件为：95 ℃预变性5 min，95 ℃变性10 s，65 ℃退火10 s，72 ℃延伸90 s，循环30次，72 ℃后延伸5 min。相关待测基因引物见表1。

1.5 主要观察指标 ①各组肝细胞增殖情况；②各组肝细胞吲哚菁绿摄入率；③各组肝细胞白蛋白、尿素分泌情况；④各组肝细胞内HGF，bFGF，ALB及CYP2B9 mRNA表达。

1.6 统计学分析 应用SPSS 20.0软件统计分析，计量资料以x(_)±s表示。3组间均数比较用单因素方差分析，P < 0.05为差异有显著性意义。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

讨论

肝细胞移植被证明是治疗终末期肝病最有利的手段之一^[9-11]。但体外条件下，肝细胞容易凋亡、损伤，细胞功能不能保存^[12]，一直制约着临床上大范围应用肝细胞移植治疗。因此，如何保持体外条件下肝细胞功能成为肝细胞移植治疗的关键技术，该研究通过脐带间充质干细胞的旁分泌功能，来调控体外培养肝细胞的相关功能，并初步探讨相关机制。

脐带间充质干细胞是一类成体干细胞，具有自我更新能力和多向分化潜能，尤其是其具有旁分泌能力，可以有效调控其他效应细胞的生物学活性^[13-15]。研究表明，直接输注的间充质干细胞大部分沉积于肺脏，直接转入肝脏并分化成为肝细胞的数目极其稀少^[16]。大量研究证实，间充质干细胞可分泌大量的活性成分，其中包含肝细胞生长因子、血管内皮生长因子、神经生长因子、角质细胞生长因子等细胞因子，可有效调节相关靶细胞功能^[17-19]，另有研究也发现，在特殊条件下间充质干细胞能显著上调抗炎因子如白细胞介素1、白细胞介素6和白细胞介素10的表达^[20]，而一些研究也发现间充质干细胞可以通过旁分泌机制有效改善肝功能，减轻肝损害并促进肝再生^[21-24]。

肝细胞体外培养时无法长时间保持肝细胞相关功能，细胞会迅速发生形态变化并丢失相关功能^[25]。白蛋白是肝细胞合成分泌功能的最主要表现，相关研究表明间充质干细胞能促进肝细胞分泌白蛋白并改善肝功能^[26]；间充质干细胞可有效促进肝细胞合成尿素，其在体外条件下维持小鼠肝细胞的功能^[27]。该研究证实脐带间质干细胞在体外条件下可通过非接触作用，调控肝细胞分泌白蛋白，合成尿素，具有维持肝细胞功能的作用。

肝细胞生长因子是目前已知生物活性最广泛的生长因子之一，具有重要的生物学功能，可以促进有丝分裂、血管生成和抗凋亡，是肝细胞增殖的最强促有丝分裂原。Li等^[28]发现通过超声介导的方法在骨髓间充质干细胞内过表达肝细胞生长因子，有利于骨髓间充质干细胞向肝细胞方向分化；而Teshima等^[29]则在犬肝损害模型中发现，同种异体输注的脂肪来源间充质干细胞可通过调控肝细胞生长因子改善肝损害，修复肝功能；而过表达碱性成纤维细胞生长因子亦同样可促进间充质干细胞改善肝损害，修复肝功能^[30]。该研究则证实，脐带间充质干细胞本身可通过调控肝细胞内肝细胞生长因子及碱性成纤维细胞生长因子的表达，促进体外条件下肝细胞的功能维持。

结论：通过建立人脐带间充质干细胞与小鼠肝细胞的共培养体系，揭示了脐带间充质干细胞通过旁分泌机制调控肝细胞功能的重要作用。该研究为将来应用大规模肝细胞扩增技术提供理论依据。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

脐带间充质干细胞通过旁分泌机制维持原代小鼠肝细胞的体外生长

Umbilical cord mesenchymal stem cells support the in vitro growth of primary mouse hepatocytes by a paracrine mechanism

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