提高细胞上清液中甲状旁腺激素水平对甲状旁腺细胞培养及分泌功能有优化作用

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.1780

摘要/Abstract

摘要：

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文题释义：
甲状旁腺：主细胞分泌甲状旁腺素，调节血钙的含量。动物实验证明，如将此腺完全切除，则致血钙含量急骤下降，肌肉强烈痉挛而导致死亡。甲状旁腺素调节钙和磷的代谢，它的分泌主要受血钙水平的调节，不受其它内分泌腺和神经的直接影响。血钙减少时刺激此腺分泌激素，激素作用于骨细胞和破骨细胞，促使吸收骨中的钙，将它释放入血。血钙增多时又抑制此激素的分泌。
甲状旁腺激素(parathyroid hormone，PTH)：是调节钙磷代谢，维持机体钙平衡的主要激素，其外周代谢主要在肾脏、骨及肝脏中进行，并直接作用于骨和肾，靶细胞为成骨细胞及肾小管细胞。成骨细胞膜上有甲状旁腺激素受体能结合PTH 1-84和PTH 1-34两片段，目前认为骨对PTH 1-34优先摄取并及时作出反应。

摘要
背景：端粒酶反转录酶是一种重要的调控细胞分化增殖的酶，其具有多种生物活性。研究表明，经过hTERT基因修饰后可能有利于提高甲状旁腺细胞增殖能力的存活能力和功能，能够起到对甲状旁腺细胞体外培养的优化作用。
目的：用负载hTERT目的基因的反转录病毒PLXSN 转染大鼠甲状旁腺细胞，观察细胞生物学特性及细胞分泌功能变化，以探讨甲状旁腺细胞培养更为优化的方法。
方法：28只雄性Wistar大鼠，由北京维通利华动物实验技术有限公司提供，经天津医科大学动物实验伦理委员会批准(批准号为2017-0652)。大鼠麻醉后切取甲状旁腺并通过病理学确认，用胶原酶 Ⅱ 消化获得甲状旁腺细胞，并经过Western blot检测钙敏感性受体、甲状旁腺激素和神经胶质细胞缺失转录因子(GCM-2)进行鉴定。将鉴定后细胞分为正常的甲状旁腺细胞组、空病毒组和hTERT转染组。hTERT转染后3 d，通过RT-PCR和Western blot检测各组细胞中hTERT基因和蛋白相对表达；应用细胞生长曲线和CCK-8法观察细胞生长情况；采用流式细胞术测定细胞周期分布；使用酶联免疫吸附测定法检测细胞的上清液中甲状旁腺激素的浓度变化。
结果与结论：①Western blot检测结果显示甲状旁腺细胞的特异性标志物钙敏感性受体、甲状旁腺激素及神经胶质细胞缺失转录因子(GCM-2)均呈现阳性结果，表明培养细胞为甲状旁腺细胞；②hTERT转染组中hTERT基因和蛋白的相对表达显著高于甲状旁腺细胞组和空病毒组(P < 0.05)；③hTERT转染组中细胞的生长速度明显地增快，细胞周期G₀/G₁期减少，而S期细胞数增多(P < 0.05)，培养细胞上清液中甲状旁腺激素水平显著升高(P < 0.05)；④结果说明，携带hTERT基因的反转录病毒PLXSN转染大鼠甲状旁腺细胞可促进大鼠甲状旁腺细胞增殖；明显地提高细胞上清液中甲状旁腺激素水平，对甲状旁腺细胞培养及分泌功能有优化作用。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程
ORCID: 0000-0001-6696-410X(王慧)

关键词: 甲状旁腺细胞, 细胞培养, 端粒酶反转录酶, 基因转染, 甲状旁腺激素, hTERT基因

Abstract:

BACKGROUND: Telomerase reverse transcriptase is an important enzyme that regulates cell differentiation and proliferation, and it has various biological activities. hTERT gene modification may improve the viability and proliferation of parathyroid cells, and can optimize the in vitro culture of parathyroid cells.
OBJECTIVE: To transfect rat parathyroid cells with retroviral PLXSN carrying hTERT gene, and to observe the biological characteristics and secretory function of transfected cells in order to optimize the culture of parathyroid cells.
METHODS: Twenty-eight male Wistar rats were purchased from Beijing Vital River Laboratory Animal Technology Co., Ltd., China. The study protocol was approved by the Animal Experiment Ethics Committee of Tianjin Medical University with the approval No. 2017-0652. Under anesthesia, the parathyroid glands of rats were surgically removed and pathologically confirmed. The parathyroid cells were digested by collagenase II. The protein expression level of calcium-sensing receptor, parathyroid hormone and glial cells missing-2 were detected by western blot. The parathyroid cells were divided into parathyroid cell group, empty virus group and hTERT transfection group. The expression levels of hTERT gene and protein in parathyroid cells were detected by RT-PCR and western blot after 3 days of transfection, respectively. Cell growth was observed by cell growth curve and cell counting kit-8. The cell cycle distribution was measured by flow cytometry. Enzyme-linked immunosorbent assay was used to detect the level of parathyroid hormone in the cell supernatant.
RESULTS AND CONCLUSION: Western blot results showed that the parathyroid cells were positive for calcium-sensing receptor, parathyroid hormone and glial cells missing-2, indicating the cultured cells were parathyroid cells. After transfection of hTERT, hTERT gene and protein levels were significantly increased in the hTERT transfection group as compared with parathyroid cell group and empty virus group (P < 0.05). The cell growth rate in the hTERT transfection group noticeably increased (P < 0.05). The cell number in G₀/G₁ phase was significantly decreased and the number of cells in the S phase was increased (P < 0.05). The level of parathyroid hormone in the culture supernatant was significantly increased (P < 0.05). To conclude, transfection of the PLXSN carrying the hTERT gene can promote the proliferation of rat parathyroid cells in vitro and increase the level of parathyroid hormone (PTH) in the supernatant of parathyroid cells.

Key words: parathyroid cells, cell culture, telomerase reverse transcriptase, gene transfection, parathyroid hormone, hTERT gene

中图分类号:

R446
R318

王慧. 提高细胞上清液中甲状旁腺激素水平对甲状旁腺细胞培养及分泌功能有优化作用[J]. 中国组织工程研究, 2019, 23(25): 4025-4030.

Wang Hui . Optimization of culture and secretion of parathyroid cells via increasing the parathyroid hormone level in cell supernatant[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2019, 23(25): 4025-4030.

图/表（结果） 6

2.1 甲状旁腺细胞的形态特点 通过锥虫蓝染测定观察提取的甲状旁腺细胞，细胞存活率超过了98%。显微镜下可见提取的细胞呈卵形半透明且散在分布在培养液中,见图1A；培养2 d后，既可以见到大部分细胞附着皿底并相互连接，部分细胞呈三角形或者梭形见图1B；培养3 d之后，细胞即长满培养皿底部，形态完整并且细胞的胞质透明见图1C(经过鉴定所培养细胞为甲状旁腺细胞的主细胞)；在培养4-16 d时，细胞形态变化不大。

2.2 甲状旁腺细胞标志分子表达水平 Western blot法检测显示甲状旁腺细胞特异性标记物钙敏感性受体、甲状旁腺激素及神经胶质细胞缺失转录因子(GCM2)的表达呈阳性，且表达量随着培养时间的延长而增高(P < 0.05)，见表1。据此可以鉴定实验所培养的细胞为甲状旁腺细胞的主细胞，见图2。

2.3 hTERT基因转染后细胞中hTERT基因表达 基因转染后3 d，通过RT-PCR测定3个实验组中甲状旁腺细胞中hTERT基因的相对表达水平。与正常对照组和空载病毒组中甲状旁腺细胞中hTERT基因的相对表达水平相比；hTERT基因转染组显著性升高(P < 0.05)。见图3，表2。

2.4 hTERT基因转染后细胞中hTERT蛋白表达 hTERT基因转染后3 d，通过Western blot测定每个实验组中甲状旁腺细胞中hTERT蛋白的相对表达水平。hTERT基因转染显著地提高了甲状旁腺细胞中的hTERT的蛋白相对表达水平，其水平显著高于正常对照组和空病毒组(P < 0.05)。见图4，表2。

2.5 细胞生长曲线及细胞增殖活性 与正常的甲状旁腺细胞和含有空载病毒的细胞相比，hTERT基因转染显著提高了甲状旁腺细胞的增殖活性，差异有显著性意义(P < 0.05)，见表3。实验采用CCK-8法绘制了甲状旁腺细胞的生长曲线。hTERT基因转染组中甲状旁腺细胞的增殖活性在培养72 h后显著快于正常对照组和空载病毒组中的细胞增殖速度，差异有显著性意义(P < 0.05)，见图5。

2.6 细胞周期分布情况 转染后3dhTERT基因转染对甲状旁腺细胞细胞周期分布情况的影响见表4。与正常对照组和空载病毒组相比，基因转染组中细胞周期G₀/G₁期显著缩短(P < 0.05)，而细胞周期S期显著延长(P < 0.05)。

2.7 细胞中甲状旁腺激素表达水平 hTERT基因转染显著提高了甲状旁腺细胞分泌甲状旁腺激素的能力；基因转染组中甲状旁腺细胞上清液中甲状旁腺激素的水平显著地高于正常对照组和空载病毒组2个组[(76.63±4.61)，45.08±3.56)，(45.07±3.58) ng/L，P < 0.05]。见图6。

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引言

调查发现近年来甲状腺疾病如甲状腺癌等的发病率逐年升高，而手术切除是最常用的手段。然而颈部手术具有较大风险而引起甲状旁腺损伤或者被误切，从而导致患者术后出现甲状旁腺功能减退^[1-2]。甲状旁腺的损伤或者丧失会引起其分泌的甲状旁腺激素急剧减少，从而引起患者低血钙症^[3-4]。这主要是因为甲状旁腺激素是参与血钙调节的重要激素之一，它可以调节骨骼中的钙释放入血；降低尿中钙的排泄，并可以间接性促进消化道对钙磷的吸收^[5-6]。当患者甲状旁腺功能减退发生之后，患者血液中钙浓度会出现急剧的降低；从而引起患者手足麻木、烦躁易怒甚至四肢抽搐，严重可能威胁生命。故而此类患者常常需要静脉滴注钙，这严重降低了患者的生活质量和身体健康^[7]。临床上常用的治疗的手段是增加食入钙和维生素D及用丙磺舒增加尿磷酸盐排泄，噻嗪类利尿剂减少尿钙的排泄等，但治疗效果仍不理想，目前临床上探索的治疗的手段是给予患者甲状旁腺激素，但是激素价格高昂、半衰期较短且来源短缺。而甲状旁腺细胞的移植则可以避免这一问题的发生，该手段可能会成为解决患者永久性甲状旁腺功能减退的一条途径^[8-10]。近年来的动物实验和人体试验均证实了这是一条可行且有效的方法，但是移植的细胞存活时间有限，且其保持正常激素分泌功能的时间只能维持2个月以上^[11]。因此研究探讨促进甲状旁腺增殖活力和分泌特性的培养方法非常必要且极具意义。研究旨在通过hTERT基因转染研究其对甲状旁腺细胞生物学特性的影响，为甲状旁腺细胞移植提供借鉴。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

材料方法

1.1 设计 随机对照细胞实验。

1.2 时间及地点 实验于2017年7月至2018年4月在天津医科大学内分泌研究所内完成。

1.3 材料

1.3.1 实验动物 成年七八周龄雄性Wistar大鼠28只，体质量为180-210 g，由北京维通利华动物实验技术有限公司提供，生产许可证号：SCXK(京)2012-0001，实验动物使用许可证号：SYXK(京)2014-0002。所有Wistar大鼠均饲养在于室温25 ℃，湿度60%-70%的SPF环境下，同时给予大鼠以自由方便的饮水和采食。

1.3.2 实验用主要试剂 RPMI 1640培养基、胎牛血清和PBS(Hyclone)；Trizol试剂盒(Invitrogen)；钙敏感性受体(calcium-sensing receptor，CaSR)、甲状旁腺激素(parathyroid hormone，PTH)和神经胶质细胞缺失转录因子(glial cells missing-2，GCM-2)、hTERT兔IgG多克隆抗体(Santa anta Gruz公司)；兔抗大鼠多克隆抗体、辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔IgG(英国Abcam公司)；胰蛋白酶、RT-PCR试剂盒(大连宝生物工程有限公司)，实验中所用引物均由Invitrogen公司合成提供。

1.4 实验方法

1.4.1 甲状旁腺的切取和病理学证实 将选取的28只健康雄性Wistar大鼠分别通过腹腔给予注射1%戊巴比妥钠进行大鼠术前麻醉。大鼠完全麻醉之后将之固定于操作手术台上，使之处于仰卧体位并小心剪去颈部胸部的毛发。使用碘伏于大鼠的颈部和胸部皮肤进行常规性的消毒后，沿着大鼠颈部正中线纵向将皮肤切开；小心分离颈部的组织和肌肉，牵拉开大鼠颈部前部的肌肉群使大鼠的气管和2个甲状腺分别暴露出来。在10倍解剖显微镜下认真观察可见，大鼠的甲状腺为蝴蝶状暗红色，且位于大鼠的气管环和甲状软骨两侧；进一步分离甲状腺周围肌肉及甲状腺组织，可以见到灰白色或者呈乳白色的甲状旁腺组织；用显微剪将甲状旁腺取下来，随后送至病理学实验室进行病理学检验证实。

1.4.2 甲状旁腺细胞的提取 切取大鼠的甲状旁腺组织后进行病理学检验证实，结果表明切取的组织的确是大鼠的甲状旁腺组织。将所收集所有的甲状旁腺组织(来源于28只大鼠)用4 ℃的含有青霉素和链霉素双抗的1640培养基漂洗3次，去除结缔组织和血液并吸弃培养基。在细胞超净台上将甲状旁腺组织小心剪成糊状并将之转移含有10 mL培养基的离心管中，向其中加入2 mL的胶原酶Ⅱ后恒温水浴进行消化20 min。随后加入2 mL含有胎牛血清的1640培养液使消化反应终止后，用灭菌后的不锈钢网过滤消化液。之后离心洗涤3次，将离心的沉淀物加入完全的1640培养基中，调节细胞浓度到1×10⁸L^-1。锥虫蓝计数并检测存活率，将培养皿放于细胞培养箱中进行培养处理并观察并记录细胞的形态变化情况。

1.4.3 甲状旁腺细胞的鉴定 同时鉴定提取的是否是甲状旁腺细胞，主要鉴定此细胞分泌的具有特异性的标志分子水平。提取并定量测定细胞的总蛋白的水平，将变性后的蛋白进行电泳，电泳后对其进行转膜，转膜所采用的方法为湿转法，转膜所需时长为40 min，转膜后用TBST缓冲液进行反复冲洗，然后置于4 ℃条件下进行封闭，封闭过夜后向其中加入钙敏感性受体及甲状旁腺激素、GCM-2一抗，一抗是事先经TBST缓冲液稀释过的，加入一抗后进行震荡使其充分接触，震荡时间为1 h，1 h后用上诉同样的冲洗方法再次进行反复冲洗；然后加入二抗后再次进行震荡使其充分接触，震荡时间仍然为1 h；并再次冲洗1 h。最后，使用ECL发光试剂盒显色，拍摄Ｘ射线胶片并分析每个条带的灰度变化。

1.4.4 实验分组和基因转染 经过鉴定所提取的细胞确实为甲状旁腺细胞，取第3代细胞转染。将这些细胞随机分为3个实验组，分别是正常对照组、空载病毒组和hTERT基因转染组。取生长状态良好的出于生长对数期的甲状旁腺细胞进行基因转染，实验中所用的PLXSN hTERT表达载体和空载载体由天津医科大学王东老师赠送。取出hTERT基因转染组的细胞，用4 ℃的PBS洗涤3次并小心吸弃培养皿中残留的培养液；根据感染倍数MOI=10⁵将备好的PLXSN hTERT表达载体加入到细胞培养皿中，保证稀释液可以完全覆盖所有细胞；将细胞重新放回细胞培养箱中继续孵化2 h，随后向其中加入含有胎牛血清的1640培养基终止反应后，继续培养3 d后进行以下的实验操作。在以上所述相同的操作条件下对空载病毒组和正常对照组进行相同的操作。

1.4.5 甲状旁腺细胞中hTERT基因表达水平测定 在基因转染3 d之后采用RT-PCR法测定每个实验组中甲状旁腺细胞中hTERT基因的表达水平。在取出细胞之后需要迅速加入TRIzol试剂以裂解细胞，并提取甲状旁腺细胞的总RNA。根据反转录说明书合成相应的cDNA并进行扩增。反应总体系15 μL(SYBR Green 3 μL、DEPC水10 μL、上下引物各0.5 μL、cDNA 200 mg/L 1 μL)。扩增条件均为94 ℃预变性1 min，94 ℃变性30 s，59 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，共33个循环。hTERT上游引物：5'-CTG AAG TGT CAC AGC CTG TTT-3'，下游引物：5'-CAC ACA TGC GTG AAA CCT GTA-3'，引物长度为111 bp；内参β-actin上游引物：5'-TATCGGACGCCTGGTTAC -3'，下游引物：5'-CTC AGC CTT GAC TGT GCC-3'，引物长度为151 bp。使用β-肌动蛋白基因作为内部参考，通过2^-ΔΔCt测定法测定每个实验组的细胞中hTERT mRNA的相对表达水平。

1.4.6 甲状旁腺细胞中hTERT蛋白表达水平的测定 在hTERT基因转染3 d之后采用Western-blot法以测定甲状旁腺细胞中hTERT蛋白的相对表达水平。具体操作同上所述，取各个实验组的细胞提取并测定总蛋白的含量，随后进行电泳转膜封闭操作；封闭过夜后向其中依次加入hTERT的一抗和二抗进行反应，反应后用ECL发光试剂盒进行显色，将X射线胶片照相并分析各条带灰度变化。

1.4.7 CCK-8测定细胞生长曲线和细胞增殖 转染3 d后，将3组细胞取出以测定每个组甲状旁腺细胞的生长曲线和细胞增殖活力。在将细胞进行PBS洗涤3次后，采用完全培养液重悬细胞直至细胞浓度达到1×10⁸L^-1。将3组细胞分别接种在96孔细胞培养板上，每个孔分别含有2×10³个细胞；随后向其中加入10 μL的CCK-8试剂继续培养2h后酶标仪上测定A₄₅₀。随后每12 h测定一块96孔细胞培养板上细胞的增值活力，分别检测24，48，72，96，120等5个时间点的A₄₅₀值，绘制细胞生长曲线。

1.4.8 流式细胞仪测定细胞周期分布 hTERT基因转染后3 d采用流式细胞仪测定每个实验组中甲状旁腺细胞的细胞周期分布情况。取细胞离心弃上清并且分别洗涤细胞3次后，向细胞加入预冷的乙醇溶液1 mL固定细胞过夜；之后用PBS再次洗涤3次，然后向其中分别加入PI染色液避光孵化30 min；将孵化完成的样品加入到流式细胞仪上，并采用Multicycle软件分析每个实验组中细胞的细胞周期分布变化情况。

1.4.9 甲状旁腺激素的表达水平测定 各个实验组中甲状旁腺细胞分泌的甲状旁腺激素水平采用酶联免疫吸附剂法进行测定。将3个实验组的甲状旁腺细胞取出离心后取上清液进行ELISA测定；先将抗原与固相载体结合并保留其免疫活性，后加入一种抗体(抗原)与酶偶联结合成标记物，当偶联物与固相载体上的抗原(抗体)反应结合后，再加上酶的相应底物进行显色反应，其所生成的颜色深浅与欲测的抗原含量成正比，用分光光度计(酶标仪)加以测定。

1.5 主要观察指标 ①甲状旁腺细胞的形态特点；②甲状旁腺细胞标志分子表达水平；③hTERT基因转染后细胞中hTERT基因表达水平；④甲状旁腺细胞的增殖活性；⑤甲状旁腺细胞细胞周期分布；⑥甲状旁腺细胞分泌甲状旁腺激素的能力。

1.6 统计学分析 将所有结果数据输入Excel 2010表格中，之后用生物统计学软件SPSS 16.0进行统计分析；所有数据资料的组间比较采用单因素方差程序分析，结果以 x(_)±s表示，并规定P < 0.05为差异有显著性意义。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

讨论

近年来甲状旁腺功能减退的发病率逐年上升，由于甲状旁腺激素缺乏而引起患者出现了诸多低血钙的症状，严重困扰着患者的身体健康和生活质量。临床上常用的激素疗法效果并不理想，专家学者开始将目光转移到甲状旁腺细胞移植，然而由于移植细胞存活率和分泌功能并不十分令人满意，该治疗方法也颇受限制。

端粒酶反转录酶是一种重要的调控细胞分化增殖的酶，其具有多种生物活性^[12-13]。一般在正常细胞中，hTERT表达受到抑制而呈现出低表达状态，端粒酶在端粒的延长过程中其重要的催化作用，故将hTERT转染至目的细胞中，可以诱使其端粒酶活性，能够使端粒的长度保持稳定，在增殖的调控和向何方向分化方面有促进作用^[14-15]，与其他生长因子基因转染等促细胞生长方法相比，更有效直接。于宏建等^[16]采用基因沉默抑制乳腺癌细胞中hTERT基因的表达显著降低了乳腺癌细胞的活性以及其侵袭迁移的能力。而正面的实验显示，秦玲等^[17]通过hTERT基因修饰神经干细胞显著提高了细胞的存活能力，并明显改善了脊髓损伤小鼠的运动能力。由此可知经过hTERT基因修饰后可能有利于提高甲状旁腺细胞增殖能力、存活能力和功能，能够起到对甲状旁腺细胞体外培养的优化作用。此次研究目的在于通过基因修饰拟研究其对大鼠甲状旁腺细胞生物学特性的影响，为甲状旁腺功能减退治疗提供新的思路和方法。

此次研究从小鼠颈部分离切取甲状旁腺之后，病理学实验室诊断确认其为甲状旁腺；而后的细胞鉴定进一步证明了这一点。钙敏感性受体、甲状旁腺激素及神经胶质细胞缺失转录因子(GCM2)这3个分子是甲状旁腺细胞特征性的标志物，Western blot阳性的检测结果表明提取的细胞确系甲状旁腺细胞^[18-22]。实验转染hTERT后，基因转染组中细胞中的hTERT的基因和蛋白相对表达水平均显著升高，由此可知此次研究中的基因转染操作成功，这与多项研究较为一致^[23-28]，可以证明操作成功。细胞生长曲线显示在基因转染3 d后甲状旁腺细胞的增殖活性显著高于其他2个实验组，其增殖生长速度明显增快，由此可知hTERT基因转染可以显著改善甲状旁腺细胞的增殖活性，这与Mo等^[29-30]研究较为一致。流式细胞仪分析结果显示hTERT基因修饰可以提高S期细胞数目而减少G₀/G₁期细胞数目，据此结果可判断基因转染降低G₁期的阻滞而促进细胞的增殖活化。由甲状旁腺细胞分泌的甲状旁腺激素缺乏是导致患者发生甲状旁腺功能减退的主要原因之一。此次研究结果表明hTERT基因转染明显地提高了甲状旁腺细胞分泌甲状旁腺激素的能力。

在研究中，hTERT基因转染明显地改善了甲状旁腺细胞的增殖能力和激素分泌的生物学活性，说明hTERT基因转染可以提高甲状旁腺细胞移植的有效性，有利于移植后细胞在患者机体内的存活和激素分泌。可以看出，该技术可以改善甲状旁腺功能减退症患者的治疗效果，但需要进一步的动物试验来验证。

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