银杏内酯B保护缺氧/复氧诱导心肌细胞损伤模型的作用及机制

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.1257

摘要/Abstract

摘要：

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文题释义：
ERK(extracellular signal-regulated kinase)：是一种丝裂原活化蛋白激酶，有许多亚族，其中ERK1、ERK2具有高度同源性，也是目前研究最多的两个亚族，研究发现磷酸化的ERK1/2可以显著降低心肌细胞凋亡，对心肌缺血再灌注损伤具有非常重要的保护作用。
银杏内酯B(Ginkgolide B，GB)：是银杏叶提取物银杏内酯中生理活性最强的成分，具有抑制细胞凋亡、抗炎、抗氧化、血管保护、抗血小板聚集、神经元保护等多种作用，被广泛用于急性缺血性脑卒中、心血管疾病、转移性癌症等疾病的治疗。

摘要
背景：银杏内酯B是银杏叶提取物，被认为具有抑制细胞凋亡、抗血小板聚集等多种作用，被广泛用于治疗心脑血管疾病，但其具体作用机制不明。
目的：探讨银杏内酯B对缺氧/复氧诱导心肌细胞损伤的保护作用及其可能机制。
方法：分别用普通培养基和含一定浓度银杏内酯B的培养基培养H9C2心肌细胞(各2份)，再分别向其中1份预先加入ERK抑制剂处理后再经过缺氧/复氧(H/R)干预，并以此分为对照组、银杏组、对照+ERK抑制组及银杏+ERK抑制组，检测各组的凋亡率、增殖率及p-ERK1/2蛋白表达。
结果与结论：①与对照组相比，银杏组的细胞凋亡率降低、增殖率增高，p-ERK1/2蛋白表达增加(P < 0.05)，②与银杏组相比，银杏+ERK抑制组的细胞凋亡率增加，增殖率降低，p-ERK1/2蛋白表达显著降低(P < 0.05)；③与对照+ERK抑制组相比，银杏+ERK抑制组的细胞凋亡率有所降低、增殖率增加(P < 0.05)，但p-ERK1/2蛋白表达无统计学差异；④结果说明，银杏内酯B能够降低缺氧/复氧引起的心肌细胞凋亡，提高存活，进而保护心肌，其机制可能通过银杏内酯增加心肌细胞中p-ERK1/2蛋白表达有关。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程
ORCID: 0000-0001-8844-7867(张旭)

关键词: 缺氧, 复氧, H9C2心肌细胞, 凋亡, ERK1/2

Abstract:

BACKGROUND: Ginkgolide B is extracted form ginkgo, which has been shown to inhibit cell apoptosis and platelet aggregation and has been extensively applied in the treatment of cardiovascular and cerebrovascular diseases. However, the underlying mechanism remains unclear.
OBJECTIVE: To observe the protective effect of ginkgolide B on hypoxia/reoxygenation-induced cardiomyocyte injury and its underlying mechanisms.
METHODS: H9C2 myocardial cells were divided into control group (common medium), ginkgolide B group (medium containing ginkgolide B), control plus ERK inhibitor group (common medium, ERK inhibitor prior to hypoxia/reoxygenation) and ginkgolide B plus ERK inhibitor group (medium containing ginkgolide B, ERK inhibitor prior to hypoxia/reoxygenation). The apoptosis rate, proliferation rate and p-ERK1/2 protein expression were detected.
RESULTS AND CONCLUSION: (1) Compared with the control group, the apoptosis rate was significantly decreased, and the proliferation rate and the p-ERK1/2 protein expression were significantly increased in the ginkgolide B group (P < 0.05). (2) Compared with the ginkgolide B group, the apoptosis rate was significantly increased, and the proliferation rate and the p-ERK1/2 protein expression were significantly decreased in the ginkgolide B plus ERK inhibitor group (P < 0.05). (3) Compared with the control plus ERK inhibitor group, the apoptosis rate was significantly decreased and the proliferation rate was significantly increased in the ginkgolide B plus ERK inhibitor group (P < 0.05), and the p-ERK1/2 protein expression showed no significant difference. (4) These results indicate that ginkgolide B can reduce the cell apoptosis of hypoxia/reoxygenation-induced cardiomyocyte injury, and improve cell survival, thereby protecting the myocardium, which is by increasing p-ERK1/2 protein expression.

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

Key words: anoxia, reoxygenation, H9C2 myocardial cells, apoptosis, ERK1/2

中图分类号:

张旭，陈旺盛，冯健，张梦娇，蒋文捷，梁雪梅. 银杏内酯B保护缺氧/复氧诱导心肌细胞损伤模型的作用及机制[J]. 中国组织工程研究, 2019, 23(19): 3097-3101.

Zhang Xu1, Chen Wangsheng2, Feng Jian3, Zhang Mengjiao1, Jiang Wenjie1, Liang Xuemei1. Protective effect of Ginkgolide B against hypoxia/reoxygenation-induced cardiomyocyte injury and its underlying mechanisms [J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2019, 23(19): 3097-3101.

图/表（结果） 3

2.1 心肌细胞p-ERK1/2蛋白表达 ①与对照组相比，银杏组的p-ERK1/2蛋白表达增加(P < 0.05),说明银杏内酯B可以增加缺血缺氧/复血复氧损伤后的心肌细胞p-ERK1/2的蛋白表达；②与对照组和银杏组相比，对照+ERK抑制组和银杏+ ERK抑制组的p-ERK1/2蛋白表达均显著降低(P < 0.05)，说明ERK抑制剂能显著抑制p-ERK1/2蛋白表达；③与对照+ ERK抑制组相比，银杏+ERK抑制组的p-ERK1/2蛋白表达无统计学差异。见图1。

2.2 心肌细胞的增殖率 ①与对照组相比，银杏组的心肌细胞增殖率显著增加(P < 0.05),说明银杏内酯B可以提高心肌细胞受到缺血缺氧/复血复氧损伤后的增殖力；②与对照组和银杏组相比，对照+ERK抑制组和银杏+ERK抑制组的细胞增殖率显著降低(P < 0.01)，说明经过ERK抑制剂干预后，心肌细胞受到缺血缺氧/复血复氧损伤时，其细胞增殖能力进一步降低；③与对照+ERK抑制组相比，银杏+ ERK抑制组的细胞增殖力增加(P < 0.05)，说明心肌细胞在受到缺血缺氧/复血复氧损伤和经过ERK抑制剂干预后时，银杏内酯B仍可以一定程度上提高心肌细胞的增殖力。见图2。

2.3 心肌细胞凋亡率 ①与对照组相比，银杏组的心肌细胞凋亡率显著降低(P< 0.05),说明银杏内酯B可以降低心肌细胞在缺血缺氧/复血复氧损伤时的凋亡率；②与银杏组相比，对照+ERK抑制组和银杏+ERK抑制组的细胞凋亡率显著增加(P < 0.05或P < 0.01)，说明经过ERK抑制剂干预后，心肌细胞受到缺血缺氧/复血复氧损伤时，其细胞凋亡进一步增加；③与对照+ERK抑制组相比，银杏+ERK抑制组的细胞凋亡率有所下降(P< 0.05)，说明心肌细胞在受到缺血缺氧/复血复氧损伤和经过ERK抑制剂干预后时，银杏内酯B仍可以一定程度上降低心肌细胞的凋亡率。见图3。

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引言

材料方法

1.1 设计细胞学实验观察。

1.2 时间及地点实验于2016年7月至2018年10月在西南医科大学附属医院中心实验室完成。

1.3 材料大鼠H9C2心肌细胞株购自中国科学院上海生命科学研究院，银杏内酯B(批号：A606617)购自上海生工生物工程股份有限公司，胎牛血清、DMEM高糖培养基购自Gibco公司，小鼠抗大鼠β-Actin抗体(sc-47778) 、兔抗大鼠p-ERK1/2抗体(4370)购自Cell Signaling公司，细胞凋亡试剂盒(Annexin V-FITC、PI)购自江苏碧云天生物研究所，四甲基氮唑盐(MTT)购自Sigma公司。

1.4 实验方法

1.4.1 H9C2心肌细胞培养、实验分组及缺血缺氧/复血复氧细胞模型的建立取对数生长期的大鼠H9C2心肌细胞，细胞计数后，以相同数量分别接种于4个培养皿中(MTT法用96孔平板)，普通培养基正常培养(含体积分数10% 胎牛血清的DMEM培养基，培养条件为37 ℃，体积分数95%空气，5% CO₂)8 h后换液，其中2份加入50 μmol/L银杏内酯B，继续培养16 h(共24 h)后，取其中2份(1份普通培养基培养、1份银杏内酯B培养)加入ERK1/2抑制剂(PD98059 20 μmol/L)处理6 h，再将上述4份换成无血清DMEM培养基，进行缺血缺氧(培养条件为37 ℃，体积分数1%空气，94%N2，5%CO₂)3 h后，重新置换回上述普通培养基正常培养(复血复氧)，在正常培养条件下培养39 h(此时共72 h)，终止实验，实验分为对照组、银杏组、对照+ERK抑制组、银杏+ERK抑制组。实验重复3次，收取数据，最终数据取平均值。

1.4.2 Western Blot检测各组心肌细胞蛋白表达分别提取各组细胞总蛋白(经BCA法测定蛋白浓度)，每组各取50 μg蛋白上样至10% SDS聚丙烯胺分离凝胶上，经电泳分离后再将蛋白电转至PVDF膜，5%牛奶(含5%BSA的TBST溶液) 37 ℃封闭2 h，加一抗(β-action、p-ERK1/2稀释至1∶1 000)孵育过夜，TBST液洗膜，孵育二抗(1∶2 000)，再洗膜，用ECL发光试剂盒显影成像，进行吸光度值定量分析。p-ERK1吸光度值/β-Actin吸光度值表示p-ERK1 蛋白的相对表达量，p-ERK2吸光度值/β-Actin吸光度值表示p-ERK2 蛋白的相对表达量，p-ERK1/2表示p-ERK1/β-Actin + p-ERK2/ β-Actin的表达量。

细胞的培养及鉴定
细胞来源：	大鼠H9C2心肌细胞株购自中国科学院上海生命科学研究院
培养基介绍：	①普通培养基：含体积分数10% 胎牛血清的DMEM培养基，培养条件为37 ℃，体积分数95%空气，5% CO₂；②无血清DMEM培养基
添加材料：	①对照组：普通培养基培养 ②银杏组：普通培养基+银杏内酯B培养 ③对照+ERK抑制组：普通培养基培养+ERK1/2抑制剂培养 ④银杏+ERK抑制组：普通培养基+银杏内酯B+ERK抑制剂培养
培养时间：	普通培养基培养8 h换液，加入银杏内酯B，继续培养16 h(共24 h)，加入ERK1/2抑制剂处理6 h，换成无血清DMEM培养基，进行缺血缺氧处理3 h，再进行普通培养基培养(复血复氧)39 h(此时共72 h)，终止实验
伦理学批准：	实验方案经西南医科大学附属医院动物实验伦理委员会批准

1.4.3 MTT法检测细胞增殖率分别将各组细胞于上述培养的24 h和72 h时分别按说明加入MTT液20 μL(5 g/L) ，培养4 h后弃液，加入二甲基亚砜200 μL/孔，避光低速摇床培养30 min，用酶标仪(570 nm波长)测定各孔吸光度值，每组重复设5组复孔，实验重复3次，最终结果取平均值。

细胞增殖率(%)=(72 h吸光度值-24 h吸光度值)/24 h 吸光度值×100%。

1.4.4 流式细胞术检测细胞凋亡率收集细胞，将其悬浮后按细胞凋亡试剂盒说明书先后加入Annexin V-FITC、PI标记后进行流式细胞仪检测细胞凋亡。实验重复3次，最终结果取平均值。Annexin V-FITC标记凋亡与坏死的细胞，PI标记坏死的细胞，Annexin V-FITC染色阳性，PI染色阴性的细胞为凋亡细胞。

细胞凋亡率=凋亡细胞数/总细胞数。

1.5 主要观察指标 ①心肌细胞p-ERK1/2蛋白表达；②心肌细胞的增殖率；③心肌细胞凋亡率。

1.6 统计学处理应用SPSS20.0软件分析，各组数据以 x(_)表示，多组间采用单因素方差分析，两组间比较采用Tukey检验，P < 0.05为差异有显著性意义，P < 0.01为差异有非常显著性意义。±s

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讨论

目前，急性心肌梗死已成为威胁人类健康和导致死亡的重要疾病之一，对心肌梗死的治疗包括溶栓、经皮冠状动脉介入、冠脉搭桥等旨在改善心脏血供的方法是临床非常常用和成熟的治疗手段^[8]。然而，在这些治疗后，心肌细胞缺血情况常常并没有因为冠脉再通得到改善，相反，再灌注后心肌细胞损伤反而可能加重，甚至出现梗死面积的扩大、再灌注后的心律失常、心肌抑顿等情况^[3^，^9-10]，将不可逆地导致心肌缺血再灌注损伤，因此，如何有效减轻心肌缺血再灌注损伤对于提高心肌梗死患者的临床疗效和改善其预后起着非常重要的作用，也是近数十年来的研究热点。

目前，对心肌缺血再灌注损伤的分子机制并不明确。多项研究表明，心肌缺血再灌注后的心肌细胞凋亡是启动和促进心肌缺血再灌注损伤的重要原因^[3^，⁸^，^11]。近年来研究发现，胞外信号调节激酶ERK(extracellular signal-regulated kinase)在心肌缺血再灌注过程对心肌细胞具有非常重要的保护作用^[12-14]。ERK是一种丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPK)，研究发现，MAPK信号通路参与调控心脏多项重要的生理病理过程如心肌细胞肥大与纤维化^[5^，^{14- 15]}、心脏衰竭等^[16]。ERK有许多亚族，其中 ERK1 、ERK2具有高度同源性，也是目前研究最多的两个亚族，2004年Hausenloy等首次提出将ERK1/2称为再灌注损伤挽救激酶(reperfusion injury salvage kinase, RISK)^[17]，之后的多研究证实，激活ERK1/2 通路可以显著降低心肌细胞凋亡^[18-19]，磷酸化的ERK(p-ERK1/2)参与调控心肌细胞凋亡、增殖等过程，并可能在心肌缺血再灌注损伤早期具有非常重要的保护作用^[16^，^20]。

银杏内酯B作为银杏叶提取物银杏内酯中生理活性最强的成分，具有抗炎、抗氧化、血管保护、神经元保护等作用，临床应用广泛，用于急性缺血性脑卒中、心血管疾病、转移性癌症等疾病的治疗^[7^，^21-22]。以往对银杏内酯B的研究主要是在急性缺血性脑卒中方面，研究表明，银杏内酯B能透过大鼠血脑屏障，可降低缺血再灌注后大鼠脑梗死体积和脑水肿，对大鼠脑缺血再灌注损伤具有显著的保护作用^[23]；银杏内酯B通过抑制NF-κB炎症因子从而具有抗炎、降低细胞凋亡的脑神经保护作用^[24]。近年来研究发现，银杏内酯B对缺血再灌注心肌梗死大鼠模型具有显著的心肌保护作用^[6^，^25-26]，可能通过不同的作用靶点调节心肌细胞功能，比如可减少膜磷脂的降减保护大鼠心肌缺血再灌注损伤^[6]；通过作用于一氧化氮/环磷鸟苷通道，完全阻止胶原刺激的血小板聚集，进而保护心脏血管^[27]，尽管银杏内酯B临床作用显著，但其具体作用机制目前仍不明。因此，进一步探讨银杏内酯B对心肌缺血再灌注损伤的作用机制,特别是与ERK1/2的作用关系对于深入探讨银杏内酯B对心肌缺血再灌注损伤的作用机制起到重要作用。

此次实验研究发现, 银杏内酯B可以显著减轻H9C2心肌细胞因缺血缺氧/复氧损伤后的凋亡，增加其增殖能力，并发现银杏内酯B显著增加了心肌细胞缺血缺氧/复氧干预后的p-ERK1/2蛋白表达；而经过ERK1/2特异性阻断剂PD98059处理后，p-ERK1/2蛋白表达被显著抑制，并且发现随着p-ERK1/2蛋白表达显著被抑制，对照组的凋亡率进一步升高，细胞增殖力显著下降，综上，推测银杏内酯B通过激活ERK1/2 信号分子、上调p-ERK1/2蛋白表达而对心肌缺血缺氧/复氧损伤发挥保护作用；研究还发现，即使在受到缺血缺氧/复氧和ERK1/2特异性阻断剂双重干预处理后，银杏内酯B组的凋亡较对照组仍有所减轻，细胞增殖力有所提高。由此可以肯定，银杏内酯B对心肌缺血再灌注损伤损伤具有显著的保护作用，显著降低其受到损伤后的凋亡，增加增殖力，并推测银杏内酯B是通过激活ERK1/2 信号分子、上调p-ERK1/2蛋白表达实现的。这一推测有望对心肌缺血再灌注损伤保护机制及缺血性心肌病的防治提出新的思路，并为进一步探讨银杏内酯B的其他信号分子机制奠定基础。中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程