纳米氧化锌体内抗肿瘤性能：机制、安全性还有待系统深入的评估

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.0991

摘要/Abstract

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文题释义：
纳米氧化锌的优点：纳米级生物分子在调节人体各种细胞周期和维持细胞内环境的稳定中起着重要作用，经适当的工程修饰后，纳米颗粒可定位在身体的任何系统，模仿生物分子的活性，在一定程度上满足人体的生理需求；具有高表面积体积比，拥有足够的表面积来封装药物和其他物质，提供更高的有效治疗；具有很好的靶向选择性，可将加载的物质在特定的场所释放，减少对正常细胞的毒副作用；纳米颗粒以内吞方式进入细胞，避开了传统药物进入细胞的方式，很大程度上避免了耐药的发生。
纳米氧化锌的细胞毒性机制：主要是纳米颗粒在细胞内溶解释放出锌离子，诱导活性氧产生，导致锌介导的蛋白活性失衡和氧化应激，最终杀死细胞。最近的研究表明，纳米氧化锌在细胞外释放锌离子，会形成难溶性的无定形磷酸沉淀碳酸锌，保护细胞免受毒性锌损害；另一方面，进入细胞内的纳米氧化锌能够激活Caspase通路，诱导细胞毒性。

背景：氧化锌纳米颗粒由于其高度选择性及自身有效肿瘤杀伤作用，在肿瘤治疗方面显示出很大的应用前景。纳米氧化锌以其选择性靶向能力和优良抗癌效果及良好的生物相容性、安全性及长效性，在医学应用尤其是抗肿瘤方面表现出巨大潜力。
目的：综述纳米氧化锌与肿瘤的关系及其抗肿瘤机制。
方法：应用计算机检索 2008年1月至2018年1月PubMed、Elsevier(ScienceDirect)及 Web of Science 期刊引文索引数据库相关文章，检索词为“zinc oxide nanoparticles或者ZnO NPs，tumor或者Cancer，并限定文章语言种类为English。同时计算机检索2008年1月至2018年2月CNKI学术总库及万方数据库相关文章，检索词为“纳米氧化锌，肿瘤”，并限定文章语言种类为中文。
结果与结论：大量研究表明，纳米氧化锌在很多肿瘤细胞系中显示出了很好的抗瘤性能，并且具有良好的生物相容性、安全性、长效性及靶向选择性杀伤肿瘤细胞等优点。纳米氧化锌的细胞毒性机制主要是纳米颗粒在细胞内溶解释放出锌离子，诱导活性氧产生，导致锌介导的蛋白活性失衡和氧化应激，导致细胞凋亡、自噬及基因损伤的发生，最终导致肿瘤细胞死亡。但目前对于纳米氧化锌的体内抗瘤性能和安全性研究还相对比较缺乏，有待系统深入评估。

ORCID: 0000-0002-8221-5616(何观平)

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

关键词: 纳米氧化锌, 肿瘤, 锌离子, 凋亡, 自噬, 活性氧, 选择性, 生物材料

Abstract:

BACKGROUND: Owing to the selective targeting ability and excellent tumor killing capacity, zinc oxide has shown great potential in the antitumor treatment. Zinc oxide nanoparticles also show huge potential in the medicine and especially in the antitumor treatment because of selective targeting ability, excellent anti-cancer effect as well as good biocompatibility, safety and long-term efficacy.

OBJECTIVE: To review the relationship between zinc oxide nanoparticles and tumors and the anti-tumor mechanism.

METHODS: A computer-based online search of related papers was performed in PubMed, Elsevier (ScienceDirect) and Web of Science databases (from January 2008 to January 2018) using the key words of “(zinc oxide nanoparticles OR ZnO NPs) AND (tumor OR cancer)” in English, and in CNKI and Wanfang databases (from January 2008 to February 2018) using the key words of “zinc oxide nanoparticles, tumor” in Chinese.

RESULTS AND CONCLUSION: A large number of studies have shown that zinc oxide nanoparticles have good anti-tumor properties in many tumor cell lines, and have good biocompatibility, safety, durability and selective targeting ability to kill tumor cells. The main antitumor mechanisms of zinc oxide nanoparticles are mediated through the release of zinc ions, which lead to imbalance of intracellular zinc-mediated protein, elevation of reactive oxygen species production, and result in cell apoptosis, autophagy and genetic damage, eventually contributing to tumor cell death. However, further investigations are needed on the antitumor property and safety of zinc oxide nanoparticles in vivo.

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

Key words: Zinc Oxide, Neoplasms, Nanostructures, Tissue Engineering

中图分类号:

R318

何观平，刘晓光. 纳米氧化锌体内抗肿瘤性能：机制、安全性还有待系统深入的评估[J]. 中国组织工程研究, 2018, 22(30): 4894-4899.

He Guan-ping, Liu Xiao-guang. Antitumor properties of zinc oxide nanoparticles: further investigations is needed on its mechanism and safety[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2018, 22(30): 4894-4899.

图/表（结果） 1

2.1 纳米氧化锌抗肿瘤治疗基础当前，纳米氧化锌的抗癌特性被广泛研究，主要与其具有以下几个优点有关，

2.1.1 生物相容性锌是细胞内代谢的重要辅助因子，在维持细胞内环境的稳定起着重要的作用^[38]。纳米氧化锌易降解，可参与人体的代谢过程，为其提供营养原料。

2.1.2 增强细胞毒性尽管细胞外氧化锌具有良好的生物相容性，然后当进入细胞内氧化锌水平过度升高，能够通过锌介导的蛋白活性失衡和氧化应激的影响，增强细胞毒性^[11^，^19-20^，^22-23^，²⁵^，³⁰^，^33]。纳米氧化锌诱导过量活性氧产生，导致氧化应激，当细胞抗氧化能力达到极限，细胞最终死亡^[39]。

2.1.3 选择性大量文献报道，与传统化疗药物相比，纳米氧化锌能够选择性杀伤肿瘤细胞，主要与其在酸性环境中快速水解，肿瘤细胞与正常细胞内活性氧水平差异，以及纳米材料肿瘤细胞内增强渗透与保留效应有关^[6-7^，^36-37]。

2.2 锌和肿瘤据报道，纳米氧化锌抗瘤作用与其在水溶液中释放的自由锌离子具有密切关系^[6^，²⁴^，^27-29^，^31-32]，因此在此总结锌与肿瘤的关系。

2.2.1 锌及其在人体中的作用锌元素是体内仅次于铁的最重要和丰富微量元素。锌在体液免疫和细胞免疫方面起着重要的作用，它能够稳定膜和细胞成分的组成，维持细胞和器官的完整性。锌具有调节体内大量酶的作用，参与碳水化合物的降解、合成脂类、蛋白质和核酸，以及其他微量元素的代谢，在维持内环境稳态方面起着至关重要的作用。同时，锌还能通过调节核酸转录，调节基因表达。锌的吸收主要发生在小肠，具有浓度依赖性，其主要是通过肾脏、皮肤和肠排出。

2.2.2 锌与肿瘤发生的关系锌是哺乳动物体内超过300多种酶的共同辅助因子，其在宿主防御癌症发生和发展中起着至关重要的作用^[40]。肿瘤抑制因子p53基因及Caspase酶帮助定期检查和防止细胞癌变。如果细胞一旦显示出恶变倾向，DNA修复机制会立马被激活，修复DNA。如果这种机制不能完成修复DNA，细胞会发生程序性死亡，称为细胞凋亡。研究表明，p53蛋白的一个特定DNA结合结构域通过锌来稳定。因此，锌在维持肿瘤抑制基因p53的活性方面起着重要作用^[41]。同样，锌在激活Caspase-6酶活性方面起着重要作用，该酶主要负责凋亡，是细胞凋亡相关分子靶点中对锌最敏感的酶，能够激活Caspase-3，导致细胞死亡^[42]。同时锌离子通道能够控制进入细胞内的锌离子量，在维持生命和细胞死亡之间的平衡中起着重要作用^[43]。文献表明，低浓度的锌可导致癌症的发生和发展，但高浓度的锌能够杀死细胞^[44]。当锌含量超过锌稳态系统的容量，导致锌转运系统故障，增加细胞内锌浓度，最终激活细胞凋亡，导致细胞死亡^[45]。然而，缺锌会打破细胞稳态，导致DNA损伤，引起DNA损伤应答机制障碍，损害DNA的完整性，增加癌症的潜在风险。研究报道，细胞内低锌能够诱导大鼠胶质瘤细胞系中DNA氧化损伤，破坏p53及DNA修复^[46]。同样，在肺癌、乳腺癌、胃肠道和妇科恶性肿瘤患者血液中血清铜/锌比值增加^[47]。此外，在食管癌中锌含量明显低于正常组织^[48]。同样，有证据表明，锌在前列腺癌的进展和发展中起着重要作用，其主要和下调锌离子转运蛋白ZIP1，导致细胞内锌含量降低有关^[49]。

这些研究结果表明，细胞癌变与细胞内锌浓度的变化具有密切关系。缺乏锌可使细胞稳态发生改变，易于诱导癌症发生。同时，细胞内高浓度锌离子能够杀伤细胞。因此，锌介导的癌症化学预防可能应用于多种癌症的预防和治疗。

2.3 纳米氧化锌选择性杀伤肿瘤细胞近10年来的研究表明，纳米氧化锌对肿瘤细胞具有强且广泛的杀伤作用。自2008年首次发现纳米氧化性具有选择性杀伤白血病细胞之后^[37]，陆续报道其对神经胶质^[36]、头颈部鳞状细胞癌^[33]、肺癌^[32]、乳腺癌^[6]、宫颈癌等肿瘤细胞均能有效杀伤^[7]。综合文献可知对于不同的肿瘤细胞系，纳米氧化锌显出的抗瘤作用也不尽相同，比如：纳米氧化锌杀伤白血病细胞的IC₅₀为0.17 mmol/L^[37]，然后对于神经胶质瘤其IC₅₀达到1 mmol/L^[36]，其余报道的肿瘤细胞类型基本处于这个区间之内，主要集中在0.5 mmol/L左右。与此同时，相对于传统的化疗药物，纳米氧化锌显示出很好的选择性杀伤肿瘤细胞能力。Hanley等^[37]研究中指出，纳米氧化锌对白血病细胞的杀伤作用能达到正常血液淋巴细胞的28-35倍。Ostrovsky等^[36]将乳腺癌细胞与正常乳腺细胞及胰腺癌细胞与正常胰腺癌细胞同时暴露在10 mmol/L纳米氧化锌溶液中，结果两种癌细胞显著死亡，然后两种正常细胞未见明显影响。Sasidharan等^[6]研究也表明，纳米氧化锌对脐静脉内皮细胞的杀伤作用明显小于乳腺癌及口腔癌细胞。综合文献可知，纳米氧化锌具有明确选择性杀伤肿瘤细胞的作用。目前的研究主要集中于纳米氧化锌抗瘤的体外研究，体内研究还很缺乏。只有2017年Hassan等^[20]的研究明确了通过静脉注射纳米氧化锌能够很好地抑制肝癌细胞生长。因此，需要更多的纳米氧化锌体内抗瘤研究，为其应用于临床提供更加强有力的证据。

2.4 纳米氧化锌的抗瘤机制目前的研究表明，纳米氧化锌的细胞毒性机制主要是纳米颗粒在细胞内溶解释放出锌离子，诱导活性氧产生，导致锌介导的蛋白活性失衡和氧化应激，最终杀死细胞。最近的研究表明，纳米氧化锌在细胞外释放锌离子，会形成难溶性的无定形磷酸沉淀碳酸锌，保护细胞免受毒性锌损害；另一方面，进入细胞内的纳米氧化锌能够激活Caspase通路，诱导细胞毒性^[50]，可从3个主要方面论述。

2.4.1 锌介导的蛋白活性失衡锌是存在于人体内的一种主要微量元素，在细胞内维持一定浓度^[51]。细胞内锌浓度的改变可能会造成严重后果，因为锌是哺乳动物体内超过300种酶的辅助因子^[40]。随着锌离子在细胞内的释放，细胞内锌浓度超过正常水平，导致锌介导的蛋白活性失衡。这将广泛影响细胞重要的生理过程，包括DNA复制、DNA损伤修复、细胞凋亡、氧化应激、电子传递链、细胞稳态、细胞毒性等，减弱细胞对毒性的耐受能力。如图1所示，纳米氧化锌通过内吞进入细胞，其中一些纳米粒子直接进入细胞，而一些颗粒通过胞饮或吞噬作用进入细胞，同时和内体及溶酶体融合^[29]。随着pH值的减小，纳米氧化锌颗粒的溶解速率迅速增加，导致溶酶体不稳定^[52]。早期内体的pH值较低(大概6.3)，有利于可溶性锌离子的释放。晚期在内体(pH值5.5)和溶酶体内(pH值4.7)进一步降低，能检测到纳米氧化锌快速降解。这表明较低的pH值对锌离子的释放是必要的，因此在血液和细胞外液中其pH接近中性，不利于锌离子的释放^[14]。因此，这个过程会导致细胞内锌离子释放增加，导致锌介导的蛋白活性失衡，导致细胞损伤。此外，细胞内锌离子浓度增强，也会导致活性氧增加，通过氧化应激导致细胞损伤。

2.4.2 活性氧的产生和氧化应激活性氧产生于细胞内的各种过程，包括线粒体呼吸、炎症反应、过氧化物酶活性等。活性氧作为一个生物分子，在维持细胞信号平衡中起着重要的作用。外源性活性氧来源于各种刺激的反应，包括纳米材料的诱导^[18^，²¹^，²⁶^，^53]。纳米氧化锌诱导活性氧的方式有2种，一是细胞对纳米颗粒的炎症反应产物；另一方面是激活细胞内氧化还原反应系统，从而产生活性氧^[39^，^54]。同时有研究进一步证明，细胞内纳米氧化锌释放的高浓度锌离子能够聚集至线粒体内，导致线粒体损伤，释放大量活性氧，诱导过度氧化应激，诱导细胞凋亡及坏死发生^[14-15^，^55-56]。

2.4.3 DNA损伤和凋亡文献表明，细胞内过高的活性氧水平能够导致DNA损伤^[13^，^44]。DNA损伤形式主要是DNA链断裂和DNA蛋白质交联^[57-58]。活性氧可与DNA反应元件反应，改变DNA成分的组成，使DNA发生突变。比如，OH自由基是细胞内的一种高活性的活性氧，能够通过形成8-羟基脱氧鸟苷(8-OHdG)导致DNA单链断裂^[59]。这些DNA的断裂和交联能够破坏DNA，导致线粒体凋亡途径的激活，诱导凋亡发生，最终导致细胞死亡^[31]。同时也有研究证明，纳米氧化锌释放的锌离子能够直接损伤DNA，这种损伤并不受活性氧控制^[60]，然而锌离子直接损伤DNA机制并不清楚，还需要深入研究。

2.4.4 自噬诱导及自噬性死亡一直以来，对于纳米氧化锌的细胞毒性机制研究主要集中在通过诱导细胞凋亡发生方面^[21^，²⁷^，^31-32^，^35]。近年来有研究发现，在纳米氧化锌诱导的细胞死亡中并没有检测到凋亡的发生，然而纳米氧化锌处理后的细胞自噬水平明显升高，并且与细胞死亡密切相关^[16-17^，⁵⁶^，^61]。通过自噬抑制剂处理后，细胞死亡几乎都得到了逆转，说明纳米氧化锌诱导的自噬促进细胞死亡。然而，细胞发生自噬并不等于发生自噬性死亡，判断细胞发生自噬行死亡需要满足以下3点：确定在没有凋亡发生的情况下；通过自噬抑制剂能够阻止细胞死亡；明确有自噬流增加。但综述所有与纳米氧化锌杀伤肿瘤相关的文献，皆没有从这3个方面系统的研究和论证。目前，在纳米氧化锌杀伤肿瘤细胞的研究中，对于自噬是直接还是辅助作用亦或只是细胞企图拯救细胞死亡无果的过程，还不明确。因此，自噬在纳米氧化锌导致细胞死亡中的角色还需要深入研究。

2.5 选择性杀伤肿瘤细胞机制纳米氧化锌选择性杀伤癌细胞的特性，为其应用于体内靶向杀伤肿瘤细胞提供了良好的前期基础。综述文献，纳米氧化锌选择性可能与下列因素有关。

2.5.1 通过增强渗透和保留效应及静电相互作用选择性定位纳米颗粒由于其小尺寸和表面性质，在肿瘤细胞内显示出增强渗透和保留效应。由于肿瘤细胞生长快速，导致其血管和淋巴管及细胞之间的紧密连接发育不完全。肿瘤内在血管间隙大小介于100 nm到1 μm之间，纳米颗粒很容易通过血管向肿瘤细胞扩散，从而显示出选择性增强渗透入肿瘤细胞。这种纳米材料从血液运输到肿瘤内部的过程称为外渗。外渗液和颗粒能够被健康组织中的淋巴迅速带走。然而，由于肿瘤细胞淋巴系统发育不完全，致使流入其内的纳米颗粒阻滞，增加纳米颗粒在肿瘤组织内的存留时间，提高纳米颗粒在肿瘤细胞内的扩散。因此，增强渗透和保留效应能使纳米颗粒专门定位在肿瘤细胞内，从而显示出更强的杀伤能力^[62]。

2.5.2 通过静电特性选择性杀伤肿瘤细胞纳米氧化锌的静电特性也有利于其选择性的靶向杀伤肿瘤。纳米氧化锌表面有中性羟基附着，在其表面电荷行为中扮演着重要角色。一方面，纳米氧化锌颗粒的等电点为9.0-10.0，导致其在生理环境下带正电荷。另一方面，癌细胞外膜上通常有高浓度的阴离子磷脂^[63]。这导致纳米氧化锌和癌细胞存在静电吸引力，促进肿瘤细胞对选择性定位，摄取和吞噬。

2.5.3 通过活性氧水平差异选择性杀伤细胞内活性氧水平的差异，为纳米氧化锌选择性杀伤癌细胞提供了另外一种合理解释。研究表明，癌细胞内产生的活性氧水平相对大于正常细胞内水平^[6^，^36]。活性氧及各种信号分子大量存在于快速增殖的细胞，如癌细胞，主要是由于与正常细胞相比，其新陈代谢率相对更快^[64]。当纳米氧化锌处理后，癌细胞内激活的化学物质和信号分子，使细胞产生更多的活性氧，造成严重的氧化应激，导致细胞死亡。相比之下，纳米氧化锌处理后，正常细胞产生活性氧的生成量相对是比较低，所产生的氧化应激不足以杀死细胞，具有较低的细胞毒性反应。因此，这可能是纳米氧化锌选择性杀伤过度增殖细胞，包括癌细胞的潜在机制。

2.5.4 肿瘤酸性环境前述总结，锌离子在纳米氧化锌抗瘤作用中起着决定性作用。相对于正常细胞，肿瘤细胞酸性环境有利于锌离子从纳米氧化锌表面快速释放，能够在肿瘤细胞内及细胞微环境中快速集聚高浓度锌离子，导致肿瘤细胞死亡^[6^，^29]。

2.6 纳米氧化锌颗粒的主要性质与细胞生物学关系

2.6.1 尺寸尺寸是纳米粒子的一个关键性质。10- 100 nm尺寸范围被认为生物应用最佳。这个范围内的较低尺寸是基于对肾小球毛细血管壁-外筛分系数的测量，因肾脏第一次消除的阈值约为10 nm。一些研究表明，纳米颗粒直径小于10 nm的积累可更有效和深入地渗透在肿瘤，然而大量研究表明，小于10 nm的颗粒对机体正常细胞毒性较大。纳米尺寸的粒子不容易被细胞膜阻挡，易进入细胞，进入细胞的纳米粒子可与生物分子相互作用，通过调控细胞周期诱导细胞凋亡，破坏细胞内在的动态平衡，进而产生细胞毒性。肝脏和脾脏内在的巨噬细胞会迅速清除大部分进入血管的纳米颗粒。被称为“调理素”的血液蛋白，能吸附任何进入血液的异物，最终被组织巨噬细胞靶向摄取。

2.6.2 高表面积/体积比纳米颗粒具有很高的表面积/体积比。这种特性能够增加其与物质的表面接触，增加其反应活性和溶解度等。因此，各种配体和靶向分子可结合在颗粒表面，介导纳米药物输送。

2.6.3 其他纳米颗粒的表面电荷对其生物活性也有重要影响。高表面电荷能够增加巨噬细胞的清除活性，快速清除纳米粒子。纳米粒子的其他特性还包括高纯度、结晶度和化学成分、量子效应等影响其化学活性的因素等。

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引言

癌症已成为仅次于心血管死亡的第二大死亡原因，占所有死亡的25%左右。世界卫生组织的最新预测表明，至2030年癌症总病例还将增加1倍以上。尽管人们对于肿瘤分子水平的研究已经有了很大提高，但对于肿瘤的治疗策略依然滞后。在过去的几十年里，常用的治疗方法主要是药物化疗、放射和手术^[1]。尽管这些方法在一定程度上能够有效杀伤癌细胞，但同时也面临着如易耐药、选择性差等缺点。因此，开发一种能够选择性杀伤肿瘤细胞，同时能够避免耐药发生的药物，已成为一个研究热点^[2]。

近年来，大量研究表明纳米药物在多种耐药肿瘤中显示出良好的抗癌效果，为耐药肿瘤的临床化疗提供了一条新的思路^[3-5]。相对于传统化疗药物，纳米氧化锌主要具有以下优点：纳米级生物分子在调节人体各种细胞周期和维持细胞内环境的稳定起着重要作用。经适当的工程修饰后，纳米颗粒可定位在身体的任何系统，模仿生物分子的活性，能在一定程度上满足人体的生理需求；具有高表面积体积比，拥有足够的表面积来封装药物和其他物质，提供更高的有效治疗；具有很好的靶向选择性，并且可将加载的物质在特定的场所释放，减少对正常细胞的毒副作用^[6-7]；纳米颗粒以内吞方式进入细胞，避开了传统药物进入细胞的方式，很大程度上避免了耐药的发生。

无机纳米药物是纳米药物的主要组成部分。许多联接抗癌药物或生物活性分子(多肽、蛋白质、DNA等)的无机纳米粒子已被美国食品和药物管理局(FDA)批准和欧洲市场批准使用，如菲立磁、阿霉素等^[8]。无机纳米粒子，如氧化铁纳米粒子、二氧化钛纳米粒子、氧化铈纳米粒子、纳米氧化铜纳米粒子、纳米氧化锌等，因具有自身独特的特征，使得他们成为一种新的抗肿瘤治疗有效工具。比如携带抗癌药物的氧化铁纳米粒子，可利用磁场来选择性靶向治疗癌症，纳米二氧化钛可利用光动力疗法来治疗癌症，被用来作为一种光敏剂的替代物，通过辐射来激发诱导活性氧，导致凋亡^[9]。氧化铈纳米粒子用于癌症放疗具有很好的选择性能^[10]。氧化锌纳米颗粒也用于选择性地杀伤癌症细胞，主要是由于锌依赖的蛋白活性失衡和产生活性氧诱导的细胞毒作用^[11]。氧化铜纳米粒子合成方法简单且无毒、环保^[12]。二氧化硅纳米粒子拥有可控孔隙，使其成为抗癌治疗药物的良好载体。此外，金、银和铂纳米颗粒被称为贵金属纳米粒子，也被用于治疗癌症或传递药物^[13]。这些具有低活性性能的贵重金属元素有利于药物递送。

由于氧化锌纳米颗粒的高度选择性及自身有效肿瘤杀伤作用，在肿瘤治疗方面显示出很大的应用前景。文章旨在综述纳米氧化锌的抗肿瘤性能及机制。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程