不同方法构建抗结核β-磷酸三钙药物缓释系统的载药和缓释性能

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.0983

中国组织工程研究 ›› 2018, Vol. 22 ›› Issue (30): 4824-4828.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.0983

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不同方法构建抗结核β-磷酸三钙药物缓释系统的载药和缓释性能

孙伟¹，薛骋¹，唐先业¹，袁峰¹，郭开今¹，张东²，袁君杰²，谢幼专³

¹徐州医科大学附属医院骨科，江苏省徐州市 221002；²上海市奉贤区中心医院，上海交通大学附属第六人民医院南院骨科，上海市 201499；³上海交通大学医学院附属第九人民医院骨科，上海市 200011

收稿日期:2018-07-06 出版日期:2018-10-28 发布日期:2018-10-28
通讯作者: 袁君杰，硕士，医师，上海市奉贤区中心医院，上海交通大学附属第六人民医院南院骨科，上海市 201499
作者简介:孙伟，男，1983年生，江苏省徐州市人，汉族，2014年上海交通大学毕业，博士，主治医师，主要从事脊柱疾患的基础与临床研究。
基金资助:
徐州市科技创新项目(KC16SY159)；江苏省重点研发项目(BE2016647)

The drug loading capacity and controlled drug release property of beta-tricalcium phosphate/rifampicin drug delivery systems constructed by different solution adsorption methods

Sun Wei1, Xue Cheng¹, Tang Xian-ye¹, Yuan Feng¹, Guo Kai-jin¹, Zhang Dong², Yuan Jun-jie², Xie You-zhuan³

¹Department of Orthopedics, Affiliated Hospital of Xuzhou Medical University, Xuzhou 221002, Jiangsu Province, China; ²Department of Orthopedics, Shanghai Fengxian District Central Hospital, Shanghai Jiao Tong University Affiliated Sixth People’s Hospital South Campus, Shanghai 201499, China; ³Department of Orthopedics, Shanghai Ninth People’s Hospital, Shanghai Jiao Tong University School of Medicine, Shanghai 200011, China

Received:2018-07-06 Online:2018-10-28 Published:2018-10-28
Contact: Yuan Jun-jie, Master, Physician, Department of Orthopedics, Shanghai Fengxian District Central Hospital, Shanghai Jiao Tong University Affiliated Sixth People’s Hospital South Campus, Shanghai 201499, China
About author:Sun Wei, MD, Attending physician, Department of Orthopedics, Affiliated Hospital of Xuzhou Medical University, Xuzhou 221002, Jiangsu Province, China
Supported by:
the Scientific Innovation Project of Xuzhou, No. KC16SY159; the Major Research and Development Project of Jiangsu Province, No. BE2016647

摘要/Abstract

摘要：

文章快速阅读：

文题释义：

药物缓释系统：是利用对人体无毒、具有较好生物相容性和可降解性的材料作为载体，与药物以物理或化学吸附的方式结合制成一定的剂型，在体内通过扩散或渗透等方式使药物分子以适宜的浓度和可控的速率持续缓慢释放，从而达到更有效治疗疾病的目的。

药物负载法：即将药物负载到载体上的方法，是决定药物缓释系统载药量和缓释效果的关键因素之一。目前常用的药物负载方法有溶液吸附法、搅拌混合法、相分离法、喷雾干燥法、自乳化溶剂扩散法、乳化溶剂挥发法、真空等离子喷涂法和化学结合法等。其中，溶液吸附法较为常用。

背景：构建药物缓释系统的常用方法静态溶液吸附法、动态溶液吸附法和真空溶液吸附法中，哪种方法可以使单纯多孔β-磷酸三钙载体负载更多的抗结核药物并维持更长的药物释放时间，目前尚不十分清楚。

目的：研究不同溶液吸附法构建的抗结核多孔β-磷酸三钙药物缓释系统的载药性能和体外缓释规律。

方法：分别利用静态溶液吸附法、动态溶液吸附法和真空溶液吸附法将利福平负载于多孔β-磷酸三钙中，比较这3种方法构建的药物缓释系统的载体力学强度、载药性能和药物缓释特性。

结果与结论：①3种不同方法负载利福平后，载体间的力学强度无显著差异(P > 0.05)；载体负载利福平后的力学强度与负载前相比，差异均无显著性意义(P > 0.05)；②药物缓释系统体外载药实验表明，真空溶液吸附法构建的药物缓释系统单位质量载体的载药量(1.02±0.16) mg/g明显高于静态溶液吸附法(0.79±0.12) mg/g和动态溶液吸附法(0.89±0.13) mg/g(P < 0.05)；③体外释放实验表明，通过3种溶液吸附法构建的药物缓释系统其释药均存在突释现象。体外84 h，利福平在真空溶液吸附法、动态溶液吸附法和静态溶液吸附法构建的药物缓释系统中的累积释放百分比分别为(66.82±5.16)%，(79.49±3.50)%和(91.30±5.86)% (P < 0.05)，完全释药结束的时间分别为21.5，17.5和14.5 d(P < 0.05)；④结果提示，真空溶液吸附法构建的药物缓释系统可以负载更多的利福平并使其更持久的释放，因此，真空溶液吸附法可能更适合用来构建多孔β-磷酸三钙抗结核药物缓释系统。

ORCID: 0000-0002-6444-9523(孙伟)

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

关键词: 溶液吸附法, 药物缓释, 利福平, β-磷酸三钙, 抗结核药物, 脊柱结核, 力学强度, 载药量

Abstract:

BACKGROUND: The drug delivery systems are commonly constructed by vacuum adsorption (VA), dynamic adsorption (DA) and static adsorption. Up to now, there is still no published studies that systematically evaluate the drug loading capacity and controlled drug release property of porous β-tricalcium phosphate (β-TCP) scaffolds loading rifampicin (RFP) constructed by these three solution adsorption methods.

OBJECTIVE: To investigate the drug loading capacity and controlled drug release property of porous β-TCP scaffolds loading RFP constructed by these three solution adsorption methods.

METHODS: The β-TCP/RFP drug delivery systems were constructed by VA, DA and SA, respectively. The mechanical strength of β-TCP, drug loading capacity and controlled drug release property of the three different drug delivery systems were analyzed.

RESULTS AND CONCLUSION: (1) There were no differences in the mechanical strength of β-TCP from VA-DDS, DA-DDS and SA-DDS (P > 0.05). The mechanical strength of β-TCP in three DDS groups was not significantly different from that of unloading β-TCP (P > 0.05). (2) The in vitro drug loading testing indicated that the unit mass of RFP in VA-DDS [(1.02±0.16) mg/g] was significantly higher than that in SA-DDS [(0.79±0.12) mg/g] or DA-DDS [(0.89±0.13) mg/g] (P < 0.05). (3) The in vitro release study showed an initial burst release of RFP in the three different DDSs within the first 12 hours and after 84 hours. At 84 hours, the cumulative release of RFP from VA-DDS, DA-DDS and SA-DDS was up to (66.82±5.16)%, (79.49±3.50)% and (91.30±5.86%), respectively (P < 0.05). Complete RFP release was observed at 21.5, 17.5 and 14.5 days in VA-DDS, DA-DDS and SA-DDS, respectively (P < 0.05). As the VA-DDS shows highest RFP loading capacity and most sustained drug release, VA is recommended for the construction of porous β-TCP/RFP drug delivery systems.

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

Key words: Rifampin, Tuberculosis, Spinal, Drug Carriers, Tissue Engineering

中图分类号:

R318

孙伟，薛骋，唐先业，袁峰，郭开今，张东，袁君杰，谢幼专. 不同方法构建抗结核β-磷酸三钙药物缓释系统的载药和缓释性能[J]. 中国组织工程研究, 2018, 22(30): 4824-4828.

Sun Wei, Xue Cheng, Tang Xian-ye, Yuan Feng, Guo Kai-jin, Zhang Dong, Yuan Jun-jie, Xie You-zhuan. The drug loading capacity and controlled drug release property of beta-tricalcium phosphate/rifampicin drug delivery systems constructed by different solution adsorption methods[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2018, 22(30): 4824-4828.

图/表（结果） 4

2.1 多孔β-TCP的结构表征 β-TCP载体多孔结构区的大孔[孔直径为(530±100) μm]之间通过孔内连接[孔连接径为(150±50) μm]相互连通，存在通向中央隧道的通道(见图1)。相邻多孔结构间存在致密结构，在高倍镜下，致密结构区表面是均匀致密的，可以观察到有一些微小的孔隙存在。

2.2 多孔β-TCP负载利福平前后的力学强度变化多孔β-TCP负载利福平前后的纵向压缩、横向压缩和弯曲强度如图2所示。β-TCP载体在未负载利福平前其弯曲、纵向压缩和横向压缩强度分别为(2.83±0.31)，(1.09±0.19)和(1.32± 0.22) MPa。采用真空溶液吸附法负载利福平后，β-TCP载体的弯曲、纵向压缩和横向压缩强度分别为(2.81± 0.39)，(1.11±0.28)和(1.30±0.19) MPa；采用动态溶液吸附法负载利福平后，载体的弯曲、纵向压缩和横向压缩强度分别为(2.79±0.39)，(1.10±0.16)和(1.39±0.39) MPa；采用静态溶液吸附法负载利福平后，载体的弯曲、纵向压缩和横向压缩强度分别为(2.80±0.29)，(1.08±0.18)和(1.29± 0.26) MPa。采用真空溶液吸附、动态溶液吸附和静态溶液吸附法3种方法构建的β-TCP/利福平药物缓释系统中，其载体的力学强度无显著差异(P > 0.05)。而且，负载利福平后3组载体的力学强度与负载前相比差异无显著性意义 (P > 0.05)。

2.3 β-TCP/利福平的载药量和载药率如表1所示，真空溶液吸附法构建的β-TCP/利福平药物缓释系统的单位质量载体的载药量和载药率均显著高于动态溶液吸附法和静态溶液吸附法(P < 0.05)。

2.4 β-TCP/利福平的体外药物释放特性利福平体外日释放量和累积释放百分比如图3所示。初始36 h，利福平在3种溶液吸附法构建的药物缓释系统中的体外释放均为快速释放。与动态溶液吸附法和静态溶液吸附法构建的药物缓释系统相比，利福平在真空溶液吸附法构建的药物缓释系统中的释放时间最长。首次换液是在洗脱12 h后，此时经检测利福平从真空溶液吸附法、动态溶液吸附法和静态溶液吸附法构建的药物缓释系统中的释放均有突释现象，其释药百分比分别为(24.95±3.95)%，(37.59±5.87)%和(45.63±6.41)%。利福平在最初的84 h时间段内(即前4次换液)，从真空溶液吸附法、动态溶液吸附法和静态溶液吸附法构建的药物缓释系统中体外释放的累积释药量分别为 (2 276.6±175.8)，(2 374.5±104.5)和(2 403.0± 154.3) mg，释药累积百分比分别为(66.82±5.16)%，(79.49±3.50)%和(91.30±5.86)% (P < 0.05)。随后，利福平的日释放量呈现逐渐降低的趋势，从真空溶液吸附法、动态溶液吸附法和静态溶液吸附法构建的药物缓释系统中达到完全释放的时间分别为21.5，17.5和14.5 d(P < 0.05)。

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引言

骨与关节结核是最常见的肺外结核，其中，脊柱结核约占50%，而且绝大多数病例累及脊柱前方椎体，抗结核化疗基础上的结核病灶清除术是手术治疗脊柱结核的基本方法^[1]。然而结核病灶清除术后往往出现较大的骨缺损，虽然自体髂骨移植可以获得最佳的临床疗效，但自体骨的供给量有限，有时难以满足植骨量的需要，而且30%的患者会出现供骨区慢性疼痛、感染、骨折等并发症^[2]。另外，结核患者病灶清除术后还需要长期服用抗结核药物，这不仅容易造成肝肾功能损害，而且由于病灶处血供较差，局部的药物浓度较低，有时难以杀灭潜伏的结核杆菌导致结核复发。若将抗结核药物直接植入病灶，又存在药物吸收快、作用时间短等缺点^[3]。因此，学者们开始将目光转向构建具有骨填充作用的抗结核药物缓释系统^[4]。

良好的抗结核药物缓释系统不仅可以解决脊柱结核病灶清除术后的骨缺损问题，还可以使抗结核药物准确到达病灶局部并以一定的速率持续释放，使其在局部维持较高的药物浓度，从而有效解决传统给药方式所引起的局部药物浓度不足、药物利用率低、毒性作用大以及药物半衰期短等问题^[5-7]。β-磷酸三钙(β-tricalcium phosphate，β-TCP)是优良的自体骨移植替代材料，用于治疗骨缺损、促进骨愈合已取得了良好的疗效^[8-9]。β-TCP具有类似正常松质骨的多孔结构，不仅有利于新骨和新生血管的长入，而且还可以储存药物，因此已被用作药物缓释系统的载体^[10]。

如何将抗结核药物负载到多孔β-TCP上并达到较高的载药量是决定缓释效果的关键因素之一^[11]。目前，药物缓释载体负载药物的常用方法有：溶液吸附法、搅拌混合法、相分离法、喷雾干燥法、自乳化溶剂扩散法、乳化溶剂挥发法、真空等离子喷涂法和化学结合法等^[12-24]。其中，溶液吸附法简便易行，是在载体材料成型后再将药物吸附在载体表面或孔隙中，可以减少有机溶剂对某些药物的影响。溶液吸附法分为静态溶液吸附、动态溶液吸附和真空溶液吸附，先前的研究均是采用其中一种方法构建β-TCP药物缓释系统，由于缺少横向对比研究，究竟哪种溶液吸附法可以使单纯多孔β-TCP载体负载更多的抗结核药物并维持更长的药物释放时间，目前尚不十分清楚。在当前研究中，课题组应用利福平作为药物模型，分别采用这3种不同的溶液吸附方法来构建β-TCP/利福平药物缓释系统，通过观察载药性能和药物缓释特性来探讨构建多孔β-TCP/利福平药物缓释系统的合适方法。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

材料方法

1.1 设计对比观察实验。

1.2 时间及地点于2017年1月至2018年1月在徐州医科大学附属医院骨科实验室完成。

1.3 材料电子天平(HM-202，日本)；酶标仪(Synergy HT, Bio-Tek美国)；利福平药粉(Sigma-Aldrich，美国)；万能材料试验机(Instron，美国)；玻璃真空干燥器(上海达丰玻璃仪器厂，中国)；恒温摇床(天津市欧诺仪器仪表有限公司，中国)；真空冷冻干燥机(Labconco，美国）；离子溅射仪(Hitachi E-1045，日本)；扫描电镜(Hitachi S-4800，日本)。圆柱状多孔β-TCP载体购于上海贝奥路生物材料有限公司，载体平均质量为3.35 g，直径为14 mm，高30 mm，载体中心有一隧道，直径3.5 mm，长25 mm；孔隙率75%。

1.4 方法

1.4.1 多孔β-TCP载体的结构表征多孔β-TCP载体碎片通过离子溅射仪喷金形成导电膜，应用扫描电镜观察多孔β-TCP的表面形貌。

1.4.2 β-TCP/利福平药物缓释系统的制备称取1.0 g利福平粉末，溶于1 L pH 7.4磷酸盐缓冲液内，获得质量浓度为1 000 mg/L的利福平溶液。将45个多孔β-TCP载体称质量后，随机分为3组(A组、B组和C组)，分别浸入含有10 mL利福平溶液的50 mL离心管内。A组采用真空溶液吸附法进行利福平负载：将离心管内的利福平溶液和β-TCP载体置入不含干燥剂的真空玻璃干燥器内，在常温避光条件下进行抽真空处理，使其维持负压(-90 kPa)72 h，以便β-TCP 载体载药；B组采用动态溶液吸附法进行利福平负载：在常温避光条件下，将上述装有利福平溶液和β-TCP载体的离心管置入摇床内，以120 r/min的摇速保持震动72 h；C组采用静态溶液吸附法进行利福平负载：将装有利福平溶液和β-TCP载体的离心管在常温避光条件下静置存放72 h。

1.4.3 指标的检测

载药量和载药率测定：经上述方法载药72 h后，将β-TCP载体取出，放入真空冷冻干燥机内处理72 h，使载体中的液体成分完全升华。冻干处理后的负载有利福平的β-TCP载体再次用电子天平称质量。

单位质量β-TCP载体的载药量以负载的利福平质量(mg)/β-TCP载体质量(g)表示；并计算载药率，载药率=载药量/初始溶液药物含量×100%。

多孔β-TCP载药前后的力学强度测定：使用万能材料试验机测定未载药之前多孔β-TCP的纵向压缩、横向压缩和弯曲强度，并分别测定采用3种方法构建的β-TCP/利福平的纵向压缩、横向压缩和弯曲强度。

压缩试验：将圆柱形的β-TCP载体纵向或横向放置于力学试验机的盘状载物平台上，以2 mm/min的恒定速度对其加载力，直至β-TCP载体破裂。

弯曲试验：将圆柱形的β-TCP载体横向放置于四点弯曲实验台上，弯曲试验的楔形尖头以2 mm/min的速率，从零开始在β-TCP中央加载力，直至其断裂。

利福平体外释放实验：将负载有利福平的多孔β-TCP浸入含有10 mL pH 7.4磷酸盐缓冲液的50 mL离心管中，静置于37 ℃的隔水式电热恒温培养箱内。浸泡12 h之后，首次全换液，将β-TCP取出，置入含有10 mL新鲜磷酸盐缓冲液的离心管中。之后每隔24 h全换液1次。收集每次的洗脱液，使用酶标仪在波长474 nm处测定待测溶液的吸光度值^[27]。根据利福平溶液的标准曲线，使用Excel 2016软件计算出待测溶液的利福平浓度，并得出释药量、累积释药量和累积释药百分比。

释药量=利福平溶液浓度×溶液体积

累积释药量为各阶段释药量代数和

累积释药百分比=累积释药量/载药量×100%

1.5 主要观察指标 ①多孔β-TCP的结构表征；②多孔β-TCP负载利福平前后的力学强度变化；③β-TCP/利福平的载药量和载药率；④β-TCP/利福平的体外药物释放特性。

1.6 统计学分析采用SPSS 16.0进行统计处理。计量资料均采用x(_)±s表示，数据采用t 检验和单因素方差分析进行检验。P < 0.05表示差异有显著性意义。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

讨论

由于药物缓释系统具有药物释放持久、作用时间长、药物浓度波动小、给药途径多、给药次数少等优点，在医学领域引起了广泛的关注。β-TCP是良好的骨移植替代材料，因其具有良好的安全性、生物相容性和可降解性，已被应用于药物缓释载体领域中。应用β-TCP构建抗结核药物缓释系统既可以填充脊柱结核病灶清除术后骨缺损，同时可以将抗结核药物递送到病灶局部，使其以较高的浓度持续释放，从而解决传统给药方式局部抗结核药物浓度低、毒副作用大、疗效不确切等问题。

要构建具有良好缓释效果的β-TCP/利福平药物缓释系统，需要根据TCP载体结构和药物特性选择合适的药物负载方法^[25]。溶液吸附法的机制主要是通过表面吸收以及离子交换，简便易行，可以减少有机溶剂对某些药物的影响，药物可以通过简便的浸泡过程负载到材料的表面或者孔隙内。在当前研究中，应用3种不同的溶液吸附法将利福平负载到多孔β-TCP载体，结果显示，真空溶液吸附法构建的药物缓释系统，其单位质量载体的载药量明显高于静态溶液吸附法和动态溶液吸附法。这可能是由于经过抽真空处理，多孔β-TCP载体内的气体被完全排空，在载药过程中其内部空间会被利福平溶液完全填充，这样使得利福平可以充分负载到多孔β-TCP载体的孔隙内，甚至负载到多孔结构间致密结构的微孔或者微小裂隙内。因此，真空溶液吸附法可以使多孔β-TCP载体负载更多的利福平。

利福平药物负载到多孔β-TCP载体可能存在3种状态，这些状态决定了其释放特性^[25]。首先，部分利福平药物分子只是简单的吸附在多孔β-TCP载体的表面，这部分药物可以快速释放到磷酸盐缓冲液中。在最初的12 h，真空溶液吸附法、动态溶液吸附法和静态溶液吸附法构建的药物缓释系统均存在突释现象。先前的研究也证实溶液吸附法负载药物存在一定的缺陷，如突释现象等^[27]。而这种突释现象可能是由于吸附在多孔β-TCP载体表面的利福平分子快速释放到磷酸盐缓冲液中所致。其次，部分利福平药物分子聚积在β-TCP多孔结构区内部的孔隙通道内，这些利福平药物分子主要是以物理结合的方式与孔隙通道表面相连，其扩散遵循Fickian通道扩散机制^[26]。最后，还有部分利福平药物分子吸附在多孔结构间的致密结构的微孔或微小裂隙内，这部分负载的利福平能有效维持其长久的释放。负载在β-TCP多孔结构中央部分孔隙内的利福平在释放过程中，孔连接径的大小以及释放时所经过的孔的结构和数量均会对药物产生一定的缓释作用。对于采用真空溶液吸附法构建的药物缓释系统来说，利福平可以充分负载到多孔β-TCP载体的孔隙内，甚至负载到多孔结构间的致密结构的微孔或者微小裂隙内。因此，通过真空溶液吸附法构建的药物缓释系统具有更长的药物释放时间。实验结果还表明，通过真空溶液吸附法、动态溶液吸附法和静态溶液吸附法构建的利福平药物缓释系统均不会破坏多孔β-TCP载体的结构和力学性能。

由此可见，真空溶液吸附法可能较动态溶液吸附法和静态溶液吸附法更适合用来构建多孔β-磷酸三钙抗结核药物缓释系统。研究表明，保持利福平浓度在0.005-0.5 mg/L可以杀灭结核分枝杆菌^[28]。在当前研究中，尽管21 d时真空溶液吸附法构建的药物缓释系统释放的利福平药物浓度仍在治疗浓度之上，但是其体内的释药浓度仍需进一步研究证实。通过真空溶液吸附法构建的药物缓释系统其释放周期最长达21.5 d，但与结核患者至少需要持续6个月的抗结核药物治疗周期相比仍然较短。尽管如此，随着药物缓释系统研究的逐步深入，缓释载体和药物负载方法也会不断改进和完善，从而研发出更加理想的抗结核药物缓释系统。

综上，真空溶液吸附法可以使单位质量的β-TCP载体负载更多的利福平，并维持更持久的释放。因此，真空溶液吸附法可能较动态溶液吸附法和静态溶液吸附法更适合用来构建多孔β-TCP抗结核药物缓释系统。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

不同方法构建抗结核β-磷酸三钙药物缓释系统的载药和缓释性能

The drug loading capacity and controlled drug release property of beta-tricalcium phosphate/rifampicin drug delivery systems constructed by different solution adsorption methods

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