Micro-CT评价β-磷酸三钙/α-半水硫酸钙复合人工骨在脊柱多节段椎板间融合中的应用

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.1731

中国组织工程研究 ›› 2019, Vol. 23 ›› Issue (18): 2800-2805.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.1731

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Micro-CT评价β-磷酸三钙/α-半水硫酸钙复合人工骨在脊柱多节段椎板间融合中的应用

梁茂华¹，毛克亚²，夏波¹，刘强¹，唐佩福²，王继芳²

¹泰安市中心医院创伤手足外科，山东省泰安市 271000；²解放军总医院骨科，北京市 100853

收稿日期:2019-02-19 出版日期:2019-06-28 发布日期:2019-06-28
作者简介:梁茂华，男，1976年生，山东省泰安市人，博士，主治医师，主要从事运动医学损伤及生物材料方面的研究。
基金资助:
国家自然科学基金面上项目(51772328)，项目负责人：毛克亚

Application of beta-tricalcium phosphate/alpha-calcium sulfate hemihydrate combined bone grafts in multi-segment arthrodesis of spine: micro-CT evaluation

Liang Maohua¹, Mao Keya², Xia Bo¹, Liu Qiang¹, Tang Peifu², Wang Jifang²

¹Department of Traumatic Hand and Foot Surgery, Taian City Central Hospital, Taian 271000, Shandong Province, China; ²Department of Orthopedics, General Hospital of PLA, Beijing 100853, China

Received:2019-02-19 Online:2019-06-28 Published:2019-06-28
About author:Liang Maohua, MD, Attending physician, Department of Traumatic Hand and Foot Surgery, Taian City Central Hospital, Taian 271000, Shandong Province, China
Supported by:
the National Natural Science Foundation of China (General Program), No. 51772328 (to MKY)

摘要/Abstract

摘要：

文章快速阅读：

文题释义：

复合人工骨：实验所使用的复合人工骨，是利用无水乙醇对人体无害、能够在常温下自行挥发且不能与α-半水硫酸钙发生水化反应的特点，将其与α-半水硫酸钙、由牛松质骨经2次煅烧，保留了天然骨孔隙的β-磷酸三钙颗粒制成混悬液，在体温条件下温育使无水乙醇挥发完全，α-半水硫酸钙粉末进入β-磷酸三钙内部的孔隙内，黏附在β-磷酸三钙孔隙内部和孔壁上，使2种材料充分复合形成新型复合材料。

Micro-CT评价：Micro-CT是专用于小动物的计算机体层成像系统，不仅能够反映出骨标本或活体小动物(比如鼠等)整块骨的真正三维数据，而且能够对骨的微观结构进行数据分析，测量特定区域内骨及及植骨材料的矿物质含量、矿物质密度、体积分数、骨小梁厚度、骨小梁数量、骨小梁的排列趋向及骨小梁联通情况等结构特点，并作出定量分析。实验正是利用Micro-CT上述优势，对脊柱融合阶段进行三维重建影像学及定量分析。

背景：因受到理化性质的局限，单一使用一种人工材料难以满足临床植骨融合手术的要求，因此使用2种以上材料制备的复合人工骨更符合临床应用要求，是近些年的研究热点。

目的：应用Micro-CT评价β-磷酸三钙/α-半水硫酸钙复合人工骨在兔胸椎多节段后外侧植骨融合模型中新骨的形成及材料降解。

方法：取36只新西兰大白兔(解放军总医院医学实验动物中心提供)，去除T_4-8椎体上、下关节突关节、双侧椎板和横突，将β-磷酸三钙/α-半水硫酸钙复合人工骨植于T_4-8椎体左侧椎板后外侧(实验组)，自体骨植于T_4-8椎体右侧椎板后外侧(对照组)。术后4，8，12周末取出整段胸椎，进行Micro-CT扫描，观察两侧融合块的形态学变化，分析实验组总骨矿物质含量、组织矿物质含量及材料体积分数。实验方案经解放军总医院实验动物伦理委员会批准(批准号：201511007)。

结果与结论：①术后4周末，双侧植骨区可见少量骨赘附着于椎板、模突及关节突关节，实验组人工骨结构形态清晰可见，仅在人工骨周围形成少量新生骨；术后8周末，双侧植骨区已形成大量骨赘，融合块成为贯通整个运动节段的整体，实验组新生骨已对植骨材料形成包绕；术后12周末，双侧植骨区所形成的融合块明显增粗增大，较8周末时强壮许多，融合块外形已呈柱状，上、下关节突关节已融入融合块，实验组可见大量新骨包绕人工植骨材料，人工骨支架的结构已见崩解，实验组所形成的融合块明显要比自体骨侧大；②随着时间的延长，实验组的骨矿物质含量、组织矿物质含量及骨体积分数均逐渐减少；③结果表明，在兔胸椎多节段后外侧植骨融合模型中，人工骨能够获得稳定融合，人工骨材料在植入体内后逐渐降解，降解速度与新骨长入速度匹配。

ORCID: 0000-0001-5867-8533(梁茂华)
中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

关键词: β-磷酸三钙, α-半水硫酸钙, 自体骨, 植骨材料, 复合人工骨, 复合材料, 脊柱融合, 多节段, 兔, 胸椎, Micro-CT

Abstract:

BACKGROUND: Because of the limitation of physico-chemical properties, one kind of graft material alone in spinal arthrodesis cannot match the clinical demands, therefor combined bone grafts consisted of more than two kinds of materials are the issue of concern.

OBJECTIVE: To evaluate the new bone formation and the graft materials resorption of β-tricalcium phosphate/α-calcium sulphate hemihydrate combined bone grafts in rabbit model of multi-segments posterolateral arthrodesis of thoracic vertebrae by micro-CT.

METHODS: Thirty-six rabbits (provide by Experimental Animal Center of General Hospital of PLA) were selected, and their superior/inferior articular processes, bilateral vertebral plate and transverse processes of T_4-8 were removed. β-Tricalcium phosphate/α-calcium sulphate hemihydrate combined bone grafts were transplanted into the lateral posterior part of left vertebral plate of T_4-8 (control group), and autologous bone was transplanted into the another side (control group). The thoracic vertebrae were removed at postoperative 4, 8 and 12 weeks for micro-CT scanning. The morphologic changes of fusion masses were observed. The total bone mineral content, material mineral content, and material volume fraction in the experimental group were analyzed. The experimental protocol was approved by the Animal Ethics Committee of General Hospital of PLA, approval number: 201511007.

RESULTS and CONCLUSION: (1) At the end of 4^th week postoperatively, there were a few osteophytes attached to the laminae, transverse processes and zygapophysial joints at both sides of graft areas. In the experimental group, the morphology of bone graft was clear, and there were few newly born bones surrounding the graft. At the end of 8^th week postoperatively, there were large amount of osteophytes in the graft areas, fusion masses had involved in the complete motion segments, and the newly born bones being surrounded the graft in the experimental group. At the end of 12^th week postoperatively, the fusion masses were enlarged, appeared to be columnar, and the fusion masses were fused into the zygapophysial joints. There were abundant newly born bones surrounding the graft materials in the experimental group, and the scaffold degraded. The fusion mass in the experimental group was obviously larger than that in the control group. (2) The bone mineral content, material mineral content, and material volume fraction in the experimental group were decreased with time. (3) In summary, stable fusion effect of combined bone grafts can be achieved in rabbit models of multi-segments posterolateral thoracic arthrodesis, the combined bone grafts degrade with time, and the degrade speed matches with new bone formation.

Key words: β-tricalcium phosphate, α-calcium sulphate hemihydrate, autologous bone, graft materials, combined bone grafts, combined materials, spinal arthrodesis, multi-segments, rabbit, thoracic vertebrae, micro-CT

中图分类号:

梁茂华，毛克亚，夏波，刘强，唐佩福，王继芳. Micro-CT评价β-磷酸三钙/α-半水硫酸钙复合人工骨在脊柱多节段椎板间融合中的应用[J]. 中国组织工程研究, 2019, 23(18): 2800-2805.

Liang Maohua, Mao Keya, Xia Bo, Liu Qiang, Tang Peifu, Wang Jifang. Application of beta-tricalcium phosphate/alpha-calcium sulfate hemihydrate combined bone grafts in multi-segment arthrodesis of spine: micro-CT evaluation[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2019, 23(18): 2800-2805.

图/表（结果） 5

2.1 实验动物数量分析 36只新西兰大白兔均进入结果分析。

2.2 三维重建形态学结果

术后4周末：双侧植骨区均可见到少量骨赘附着于椎板、模突及关节突关节，各骨赘相对独立，未见相互融合，融合块未贯通整个运动节段，关节突关节间隙在部分节段清晰可见，复合人工骨材料植骨融合侧，人工骨结构形态清晰可见，仅在人工骨周围形成少量新生骨，新生骨未对材料形成包绕，见图1。

术后8周末：双侧植骨区已形成大量骨赘，融合块成为贯通整个运动节段的整体，上、下关节突关节间隙已融合不可见，在复合人工骨材料植骨融合侧，新生骨已对植骨材料形成包绕，人工骨结构仍较清晰，其支架内部已可见少量新生骨，人工骨与新生骨的边界相对清晰，见图2。

术后12周末：双侧植骨区所形成的融合块明显增粗增大，较8周时强壮许多，融合块外形已呈柱状，上、下关节突关节已融入融合块，复合人工骨植骨融合侧可见大量新骨包绕人工植骨材料，人工骨支架结构已崩解，人工骨与新生骨的边界不再清晰，新生骨大量长入人工骨支架内部，复合人工骨所形成的融合块明显大于自体骨侧，见图3。

2.3 人工骨降解情况及新生骨长入情况的Micro-CT分析用Micro-CT随机附带的ABA软件分析表明：术后4周末时，复合人工骨侧融合块标准测量区内的骨矿物质含量最高，为(16.33±3.34) mg，随着时间的推移逐渐减少，但各时间点之间的数值比较差异无显著性意义(P > 0.05)；术后4周末时，材料矿物质含量为(9.12±2.33) mg，同样随着时间的推移逐渐减少，各时间点间比较差异有非常显著性意义(P < 0.01)；术后4周末时，标准测量区内材料体积分数为0.48±0.07，同样随着时间的推移逐渐减少，各时间点间比较差异有非常显著性意义(P < 0.01)，见表2，图4。

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引言

材料方法

1.1 设计随机分组设计、对照动物实验。

1.2 时间及地点实验于2016年3至9月在解放军总医院骨科研究所完成。

1.3 材料健康雄性新西兰大白兔36只(解放军总医院医学实验动物中心提供)，体质量2.5-3.0 kg；速眠新Ⅱ号(解放军军事医学科学院军事兽医研究所产品，1.5 mL/支)；氯胺酮(福建古田药业有限公司产品，2 mL/支)；戊巴比妥钠(中国医药集团上海化学试剂有限公司产品，1 g/瓶)；Micro-CT(美国GE公司eXplore Locus SP型)及随机附带的ABA骨骼分析软件、三维重建Micview软件；β-磷酸三钙(中国科学院物理化学研究所提供，由市售牛松质骨经两步煅烧法制备)、α-半水硫酸钙(中国科学院物理化学研究所提供，由二水硫酸钙经高温高压法制备)，见表1。

1.4 实验方法

1.4.1 复合人工骨的制备将α-半水硫酸钙粉末按照固液比为1 g/2 mL放入无水乙醇中，搅拌均匀，制备成α-半水硫酸钙-无水乙醇混悬液，按照β-磷酸三钙脱有机质骨颗粒/α-半水硫酸钙粉末质量比7∶3称取β-磷酸三钙颗粒，将其倒入上述混悬液中再次搅拌均匀，将上述混悬液放入37 ℃电热通风干燥箱中，使无水乙醇自然挥发，干燥至恒质量。

1.4.2 模型制备取36只新西兰大白兔，将速眠新Ⅱ号1.5 mL、氯胺酮2 mL混合，为兔实施肌肉注射麻醉，每只兔注射0.2 mL/kg；兔取俯卧位，将四肢固定于专用手术台上，8%NaS₂溶液术区脱毛，消毒铺巾，取背部正中切口，逐层显露T_4-8椎体棘突，沿棘突、两侧椎板一直显露至横突末端，将T_4-8棘突用咬骨钳咬下作为自体局部骨备用，将上、下关节突关节、双侧椎板和横突用牙科磨钻打磨，以去除皮质；将复合人工骨按照每只动物3 g剂量植于右侧椎体横突及椎板间，作为实验组；将刚刚取下的等量自体局部骨植于同水平左侧横突及椎板间，作为对照组。实验方案经解放军总医院实验动物伦理委员会批准(批准号：201511007)，实验所有动物均在麻醉下实施手术，在取材时实施安乐死，按照动物实验伦理要求最大限度降低其痛苦及不适。

1.4.3 术后处理术后将动物分笼饲养，定期定量投放饮食。术后连续2 d肌注青霉素，2次/d，40×10⁴ U/次。每天定期观察动物手术切口有无红肿及渗液，愈合情况如何。同时注意观察动物活动、饮食、精神状况。

1.4.4 取材术后4，8，12周末，每个时间点各取兔12只，给予100 mg/kg戊巴比妥钠腹膜内注射，实施安乐死，整块取出融合节段胸椎并剔除附着之软组织。

1.5 主要观察指标将经过体积分数40%乙醇固定的融合节段胸椎标本，以旋转角度360°、旋转角度增量0.4°、扫描分辨率14 μm、帧平均数4、像素组合1×1、曝光时间 2 960 ms、电压80 kV、电流80 μA的扫描参数进行Micro-CT扫描(扫描协仪：largetube_14um_150min_ss)。

Micview软件对扫描图像进行三维重建后，分析复合人工骨侧及自体骨植骨侧融合块的形态学改变。ABA骨骼分析软件对复合人骨侧植骨融合块进行分析，每个标本在复合人工骨植骨区域内随机选取4个正方体标准测量区，每个标本测量区体积为3 mm×3 mm×3 mm。

共分析以下测试参数：①总骨矿物质含量：该数值代表标准测量区内总的骨矿物质含量；②组织矿物质含量：以2 800 Hu为目标分隔值区分自体骨与人工植骨材料，超过此分隔值的矿物质为人工植骨材料，组织矿物质含量代表标准测量区内人工植骨材料的矿物质含量；③材料体积分数：该数值代表标准测量区内CT值超过2 800 Hu人工植骨材料所占的体积百分比。

1.6 统计学分析将实验获得的数据录入SPSS 19.0软件包，采用单因素方差分析方法对结果进行统计分析。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

讨论

人工植骨替代材料可弥补自体骨量的不足、减少并发症，因此受到研究者重视^[7]。羟基磷灰石是脊椎动物骨的主要无机成分，体外研究表明其有促进间充质干细胞生长、分化的作用^[8]，并且间充质干细胞在羟基磷灰石表面有黏附与增殖的现象^[9]，用羟基磷灰石治疗动物临界尺寸骨缺损，能够促进骨的修复愈合^[10]。β-磷酸三钙是另一种磷酸钙类人工材料，Fathima等^[11]将成纤维细胞植入人工材料后对比发现，β-磷酸三钙中的碱性磷酸酶活性明显高于羟基磷灰石，这表明β-磷酸三钙的成骨效果优于羟基磷灰石。Dahabreh等^[12]将猪骨祖细胞接种入7种无机材料，对比发现β-磷酸三钙中细胞的活性及分化、增殖最优。Seebach等^[13]对比了间充质干细胞在6种植骨材料中的表现，发现其在β-磷酸三钙中的生长态势最佳。Barradas等^[14]研究发现，间充质干细胞在β-磷酸三钙内的黏附与扩散要显著优于羟基磷灰石，而且β-磷酸三钙能够激发G蛋白配对感受器(GPCR)5A和G蛋白信号肽2调节因子的表达，这说明β-磷酸三钙作为植骨材料明显优于羟基磷灰石。

近年来，逐渐将β-磷酸三钙作为植骨材料用于临床研究。Van Hoff等^[15]在1篇报道中回顾了29例良性及低度恶性骨肿瘤患者，行肿瘤刮除术后用β-磷酸三钙颗粒处理腔隙性骨缺损的病例，大多数患者6个月后骨缺损愈合或接近愈合。Hernigou等^[16]报道了1组54例患者的随机对照试验，其中34处为高位胫骨楔形截骨所致的骨缺损，20处为骨坏死经核心减压后所致的骨缺损，经随访1年发现，β-磷酸三钙组缺损愈合率与自体骨相似而不良反应少。

脊柱融合手术中，用β-磷酸三钙的研究尽管非常有限，但结果也通常是支持性的^[3]。Ofluoglu等^[17]进行了一项队列研究，对16例颈椎病患者行前路椎间盘切除，使用β-磷酸三钙作椎间植骨融合材料，术后1年随访融合率达95%。Lechner等^[18]将β-磷酸三钙作为植骨替代材料，用于腰椎前路椎体间植骨融合，术后1年随访融合率为85.48%，CT评估节段间骨桥形成比例为77.78%，与文献报道的自体骨融合率类似。Yamagata等^[19]报道的包含100例患者的回顾性对照研究中，经过2年随访β-磷酸三钙用于颈椎前路一二个节段的椎间盘切除及植骨融合，发现β-磷酸三钙组与自体骨植骨组比较融合率及cage沉降率方面无统计学差异。正是基于以上研究，此次实验采用β-磷酸三钙这一材料作为复合人工骨的主要组成部分，以期探讨在动物多阶段椎板间脊柱融合模型中的融合效果。

然而，并不是所有临床研究均表现出β-磷酸三钙优于自体骨的结果。在一项包括42例退行性脊柱病变患者的前瞻性研究中，1年随访显示，使用自体局部骨行后外侧融合比β-磷酸三钙较早表现出植骨材料重吸收及节段间的稳定性^[20]。在一项46例患者进行的随机对照研究中，对比使用磷酸三钙与仅使用空聚醚醚酮cage用于椎体间植骨的融合率，24个月后2组融合率没有明显差别^[21]。此次实验Micro-CT影像显示，术后4周末时，复合人工骨植骨侧尚未形成联通上、下关节突关节的融合块，随着时间的推移，两侧椎板间融合块的体积逐渐增大，至术后12周末，融合块外形已呈现出类似柱状结构，上、下关节突关节已融入融合块，复合人工骨植骨侧融合块在形态学上明显较自体骨植骨侧融合块更加粗壮，这说明复合人工骨的植骨区域已形成了坚固可靠的融合，而复合人工骨相对于自体局部骨在融合率方面是否有差别，以及复合人工骨所形成融合块的力学特性是否能够达到与自体骨植骨融合块类似的效果，将是下一步需要研究的方向。

理想植骨材料降解速度应与新骨长入的速度相匹配，降解过慢，材料将无法被新生骨取代；降解过快，形成的空隙就会被软组织取代，影响新生骨长入^[22]。β-磷酸三钙的降解，是通过耐酒石酸磷酸酶阳性细胞及破骨细胞介导的途径，植入患者体内二三周时β-磷酸三钙的外围出现降解，继而朝中央降解^[23]。Kato等^[24]将β-磷酸三钙用于鼠类临界大小颅骨缺损模型修复，术后10周缺损愈合，组织学表明β-磷酸三钙材料大量降解，仅少量残留物为新骨包绕，说明β-磷酸三钙具有理想的骨传导特性与降解效能。Chen等^[25]将β-磷酸三钙用于5例枢椎齿突巨细胞瘤患者的病灶清除后植骨，术后1年影像学显示自体骨长入的同时，β-磷酸三钙逐渐降解。国内亦有将β-磷酸三钙用于跟骨骨折的植骨，经过4-6个月的随访，材料逐渐被自体骨替代^[26]。然而亦有β-磷酸三钙降解过慢的报道。Rolvien等^[27]用β-磷酸三钙治疗胫骨平台骨折骨缺损区，取内固定时植骨区活检标本，没有观察到植骨材料的吸收，说明β-磷酸三钙在人体后的降解率不像动物实验中的理想。Eder等^[28]对1例初次手术4年后脊柱侧弯内固定松动患者行翻修，取出4年前植入的β-磷酸三钙进行分析，材料孔隙没有组织长入，组织培养未见成骨细胞，表明既无材料降解也无新骨形成。

研究认为材料颗粒的理化性质及植骨床生物环境，对降解速度均有影响^[1，7，29]。研究表明，破骨细胞分泌酸性物质来降解骨矿物质，所以模仿酸性环境可增加β-磷酸三钙的降解^[30]。因此实验利用硫酸钙类植骨材料降解时形成的酸性环境，促进β-磷酸三钙的降解，同时硫酸钙较快的降解速度可在早期为新骨长入留出适当的空间，希望达到材料降解与新骨长入速度匹配的目的^[31]。在研究中，由于复合人工骨的CT值明显高于正常骨质成分，因此以CT值 2 800 Hu作为分隔值，可分别计算出复合人工骨与其他骨质成分在标准测量区内的体积占比及骨矿物质含量。Micro-CT对材料植入区的分析表明：在术后4周末时，复合人工骨在标准测量区内的体积分数为0.48，术后8周末为0.31，到术后12周末已逐渐下降到0.16，说明随着时间的推移，复合人工骨在标准测量区内的体积占比逐渐下降；材料矿物质含量，术后4周末时为(9.12±2.33) mg，术后8周末时为(7.28±1.27) mg，至术后12周末已降至(4.76± 0.98) mg，这显示复合人工骨的降解在术后一直持续进行，而相同区域内总矿物质的含量变化在各时间点并没有统计学差别，这一现象表明新生骨的长入能够弥补材料降解导致的矿物质含量丢失，复合人工骨降解的速度与新生骨长入的速度是相匹配的。复合人工骨的成果效能如何，硫酸钙降解所形成的微酸性环境是否会对新骨的生成及长入形成影响，能否通过调整复合人工骨组成成分的比例来调整材料的降解与新骨长入的匹配，是下一步实验研究的重点。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

Micro-CT评价β-磷酸三钙/α-半水硫酸钙复合人工骨在脊柱多节段椎板间融合中的应用

Application of beta-tricalcium phosphate/alpha-calcium sulfate hemihydrate combined bone grafts in multi-segment arthrodesis of spine: micro-CT evaluation

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