全内置式可膨胀型生物涂层脊柱前路内固定系统最大剂量的致敏实验

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.0977

中国组织工程研究 ›› 2018, Vol. 22 ›› Issue (30): 4769-4773.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.0977

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全内置式可膨胀型生物涂层脊柱前路内固定系统最大剂量的致敏实验

黄学良，朱双芳，林雨聪，周初松

南方医科大学珠江医院，广东省广州市 510282

收稿日期:2018-05-27 出版日期:2018-10-28 发布日期:2018-10-28
通讯作者: 周初松，主任医师，硕士生导师，南方医科大学珠江医院，广东省广州市 510282
作者简介:黄学良，男，1991年生，广东省惠州市人，汉族，硕士，主要从事脊柱外科研究。
基金资助:
广东省科技计划项目(2013B091500073)，名称：全内置式可膨胀型生物涂层脊柱前路内固定系统的研发；广州市科技计划项目(2014J4100131)，名称：全内置式可膨胀型生物涂层脊柱前路内固定系统的研发

A unique built-in expandable bio-coating anterior spinal fixation: a sensitization test at the maximum sensitization dosage

Huang Xue-liang, Zhu Shuang-fang, Lin Yu-cong, Zhou Chu-song

Zhujiang Hospital, Southern Medical University, Guangzhou 510282, Guangdong Province, China

Received:2018-05-27 Online:2018-10-28 Published:2018-10-28
Contact: Zhou Chu-song, Chief physician, Master’s supervisor, Zhujiang Hospital, Southern Medical University, Guangzhou 510282, Guangdong Province, China
About author:Huang Xue-liang, Master, Zhujiang Hospital, Southern Medical University, Guangzhou 510282, Guangdong Province, China
Supported by:
the Science and Technology Plan Project of Guangdong Province, No. 2013B091500073; the Science and Technology Plan Project of Guangzhou, No. 2014J4100131

摘要/Abstract

摘要：

文章快速阅读：

文题释义：
全内置式可膨胀型生物涂层脊柱前路内固定系统：由作者根据国人胸腰椎的解剖特点，自主研发的一种新型的胸腰椎前路内固定系统，由钛合金材料及其表面的羟基磷灰石涂层制造而成，术中需将脊柱螺钉及连接棒完全植入椎体及椎间隙中，对周围组织无干扰和压迫。
最大剂量的致敏实验：是将被测材料或其浸提液通过皮内注射诱导、局部诱导及激发3个阶段作用于实验动物，通过观察实验动物激发部位的皮肤反应或者在显微镜下观察炎症反应，来评价被测材料致敏性的动物实验。其原理为变异原引发T细胞介导产生的Ⅳ型迟发超敏反应，在皮内注射及局部贴敷致敏材料的两次诱导阶段中，致敏材料进入体内成为完全性抗原，并被提呈给有记忆功能的特异性T淋巴细胞，而在激发阶段，致敏材料再次进入实验动物体内，引发机体内被激活的T淋巴细胞释放炎性因子，从而引起周围组织损伤，出现红斑及水肿等致敏反应。

背景：前期实验证明全内置式可膨胀型生物涂层脊柱前路内固定系统具有良好的生物力学性能，可重建损伤胸腰椎的稳定性。
目的：进一步评价全内置式可膨胀型生物涂层脊柱前路内固定系统的致敏性。
方法：取全内置式可膨胀型生物涂层脊柱前路内固定系统浸提液(实验组)、生理盐水(阴性对照组)、体积分数5%甲醛溶液(阳性对照组)，按《GB/T 16886.10-2005 医疗器械生物学评价第10部分刺激与迟发型超敏反应试验》规定的最大剂量致敏实验方法，进行豚鼠皮内注射诱导、局部诱导和激发实验。激发后除去敷贴片24，48 h后，观察各组动物激发部位皮肤情况，并按Magnusson和Kligman等级分级；激发阶段结束除去敷贴片72 h后，取腹部皮肤组织，显微镜下观察炎症情况。
结果与结论：①去除敷贴物24，48 h时，实验组和阴性对照组豚鼠腹部激发部位皮肤均未发生红斑及水肿等致敏反应，Magnusson和Kligman等级为0 级；阳性对照组豚鼠腹部激发部位皮肤均形成中度融合性红斑或严重红斑及水肿反应，部分可见结痂，Magnusson和Kligman等级为2至3级；②实验组和阴性对照组豚鼠腹部激发部位皮肤组织均未见中性粒细胞、淋巴细胞等炎性细胞，未见明显充血、水肿，炎症分级为Ⅰ级；阳性对照组豚鼠腹部激发部位的皮肤组织均可见以中性粒细胞或淋巴细胞为主的炎性细胞浸润反应，炎症分级为Ⅱ-Ⅳ级；③结果表明，全内置式可膨胀型生物涂层脊柱前路内固定系统未引起致敏反应，符合作为植入物在迟发性超敏反应实验中的要求。

ORCID: 0000-0002-5976-3227(黄学良)

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

关键词: 钛合金, 羟基磷灰石, 豚鼠, 生物相容性, 致敏反应, 生物材料

Abstract:

BACKGROUND: Previous experiments have proved that the unique built-in expandable bio-coating anterior spinal fixation system has good biomechanical properties, and it can reconstruct the stability of injured thoracolumbar spine.

OBJECTIVE: To evaluate the sensitization of the unique built-in expandable bio-coating anterior spinal fixation system.

METHODS: The extraction solution of the internal fixation system was taken as experimental group, the normal saline as negative control group, and 5% formaldehyde as positive control group. Intradermal injection induction, local induction and excitation test were carried out according to the sensitization test at the maximal dosage of GB/T16886.10-2005 Biological Evaluation of Medical Devices-Part 10: Tests for Irritation and Delayed-Type Hypersensitivity. Patch was removed after 24 hours and 48 hours, and the skin conditions of the animals in each group were observed and classified according to the Magnusson and Kligman levels. Skin tissues were performed with biopsy and inflammatory observation under microscope at 72 hours after patch removal.

RESULTS AND CONCLUSION: First of all, there was no erythema or edema in the experimental group and negative control group at 24 and 48 hours after removal of the patch. The Magnusson and Kligman levels were 0. However, there were moderate erythema or severe erythema and edema in the positive control group, and some scabs appeared. The Magnusson and Kligman levels were 2-3. Secondly, the experimental group and negative control group showed no stimulate neutrophils, lymphocytes and other inflammatory cells in the abdominal skin of guinea pigs, and there was no obvious hyperemia and edema. The inflammation grade was I. In the positive control group, however, inflammatory cells infiltrated by neutrophils or lymphocytes were seen in the skin tissues at the ventral part of guinea pigs, with an inflammatory grade of II-IV. All the findings reveal that the all built-in expansible bio-coating anterior spinal fixation system did not cause sensitization, which accorded with the requirement of implants in the delayed hypersensitivity test.

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

Key words: Internal Fixators, Hydroxyapatites, Guinea Pigs, Immunization, Tissue Engineering

中图分类号:

R318

黄学良，朱双芳，林雨聪，周初松. 全内置式可膨胀型生物涂层脊柱前路内固定系统最大剂量的致敏实验[J]. 中国组织工程研究, 2018, 22(30): 4769-4773.

Huang Xue-liang, Zhu Shuang-fang, Lin Yu-cong, Zhou Chu-song. A unique built-in expandable bio-coating anterior spinal fixation: a sensitization test at the maximum sensitization dosage[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2018, 22(30): 4769-4773.

图/表（结果） 3

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引言

胸、腰椎具有运动、支撑躯干、保护脏器和脊髓等重要功能，一旦受到创伤、肿瘤、感染等因素侵犯可导致疼痛、畸形、神经功能损害，甚至危及生命^[1]。因此常需外科手术治疗，其目的是切除病灶、解除脊髓神经压迫、重建脊椎稳定，恢复脊柱生理序列，给脊髓神经修复创造有利条件^[2-4]。目前治疗胸、腰椎疾病的常用手术方式有经前路、经后路及前后路联合手术。后路椎弓根钉内固定解剖简单、创伤小，具有巨大的优越性^[5-6]，已成为脊柱外科最常用的手术方法，但后路手术通常会切除棘突、椎板、关节突等脊柱后柱结构，进一步破坏脊柱的稳定性，且存在常不能直接暴露和彻底切除椎管前方病灶等缺点^[7-8]。前后路联合手术具有减压彻底等优势，但同时也存在手术时间长、创伤大、出血多等劣势。经前路手术邻近胸、腹腔大血管、脏器等重要结构，创伤大，风险高，手术操作相对复杂，但也具有后路手术难以比拟的优越性：①病灶暴露充分，直视下减压，可彻底切除椎管前方病灶^[9-10]；②不破坏脊柱后柱结构，保留其稳定性；植骨充分，融合率高，内固定牢固，可重建脊柱前中柱的稳定性，且较少发生内固定的松动和断裂^[11-12]。当然，应根据具体病例的特点，严格把握手术适应证及选择手术方式。

脊柱前路内固定系统是在行前路脊柱结核病灶清除和颈前路内固定基础上逐渐发展起来的。1953年由Wenger首次采用螺钉-钢丝螺纹棒系统行脊柱侧弯的前路内固定，1964年Dwyer等将其改进为钉缆系统并行前路侧凸矫形，但因其稳定性较差，Dunn、Kaneda等逐步将其改良为目前常用的钉棒系统，包括Kaneda、Ventrofix系统等。钉棒系统具有固定牢固，可即刻重建脊柱前方的稳定性，但同时也存在器械切迹高、可干扰周围神经血管组织等不足，甚至发生迟发性主动脉破裂、肺栓塞等严重并发症^[13-16]。钉板系统最初在钉棒系统的基础上发展而来，不同学者对其做出改进以适应临床需要，目前常见的胸腰椎前路内固定系统包括Z-plate、Profile、ATLP系统等。钉板系统的优势在于切迹较低，对周围组织干扰少，操作简便，但在生物力学稳定性上较钉棒系统稍差，且钛板不能完全帖附于椎体侧面，可导致后期内固定松动或断裂^[17-19]。

作者自主研制的全内置式可膨胀型脊柱前路内固定系统为前路钉棒系统，螺钉和连接棒可完全植入于椎体和椎间隙，由钛合金制成，在前期研究中已证明具有良好的生物力学功能^[20]，为改进其与周围骨组织的结合能力，增强植入后期的稳定性，作者采用真空等离子喷涂法在钛合金螺钉螺纹表面制备羟基磷灰石涂层。研究表明，植入人体后的金属材料在磨损过程中可能释放微量毒性金属^[21-23]，对人体造成危害。为评价涂层后的全内置式可膨胀型生物涂层脊柱前路内固定系统致敏方面的生物安全性，此次实验根据医疗器械生物相容性评价的相关标准^[24-25]，以豚鼠为研究对象，采用最大剂量的致敏实验方法来评价。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

材料方法

1.1 设计随机对照动物实验。

1.2 时间及地点实验于2017年7至9月在南方医科大学中心实验室完成。

1.3 材料

实验动物：6月龄健康豚鼠30只，雌雄不拘，无任何皮肤疾病和损伤，毛发生长完好，体质量250-350 g，由南方医科大学动物实验中心提供，许可证号：SYXK(粤) 2016-0167。

实验用主要材料和试剂：全内置式可膨胀型脊柱前路内固定螺钉由北京富乐公司生产，并由北京航空航天大学采用真空等离子喷涂法进行螺钉螺纹表面羟基磷灰石涂层；完全弗氏佐剂购自美国sigma公司；100 g/L十二烷基硫酸钠溶液购自上海试剂一厂；体积分数5%甲醛溶液购自广州化学试剂厂。

1.4 实验方法

1.4.1 浸提液制备按2 g内固定材料每支分装于15 mL离心管中，高温灭菌后烘干，加入生理盐水，放入37 ℃培养箱静置24 h，配置成0.2 g/mL的浸提液，放入4 ℃冰箱中保存备用。

1.4.2 实验分组将30只豚鼠随机分为实验组、阴性对照组与阳性对照组3组，每组10只。实验组注射材料为 0.2 g/mL内固定材料浸提液，阴性对照组注射材料为生理盐水，阳性对照组注射材料为体积分数5%甲醛溶液。将各组注射材料与完全弗氏佐剂按1∶1混合，并搅拌均匀。

1.4.3 实验过程 ①先让各组豚鼠适应实验环境1周，实验前1 d，剔除豚鼠背部约4 cm×6 cm大小的区域毛发；②皮内注射诱导阶段：在每只豚鼠已备皮的背部皮肤区域两侧对称性皮内注射0.1 mL溶液，各点相距2 cm。A点皮肤区域注射生理盐水与完全弗氏佐剂的等比例混合溶液，B点皮肤区域注射内固定材料浸提液(阴性或阳性对照液)，C点皮肤区域注射内固定材料浸提液(阴性或阳性对照液)与完全弗氏佐剂的等比例混合溶液(图1)；③局部诱导阶段：皮内注射诱导阶段结束7 d后，将各组豚鼠背部剃毛区域再次剃毛，在各注射区域涂抹100 g/L的十二烷基硫酸钠溶液 0.5 mL，并通过按摩导入皮肤。24 h后将浸透内固定材料浸提液、阴性和阳性对照液的滤纸片贴敷于各个注射区域，用医用胶布缠绕固定，48 h后去除胶布及滤纸片；④激发阶段：局部诱导14 d后，将各组豚鼠单侧腹部毛发剃除，形成4 cm×6 cm区域，分别将浸透内固定材料浸提液、阴性和阳性对照液的滤纸片贴敷于各组豚鼠的腹部剃毛区域，并用医用胶布缠绕固定，24 h后去除胶布及滤纸片。

1.5 主要观察指标

1.5.1 腹部激发部位皮肤情况激发阶段结束，在除去贴敷物24，48 h记录3组豚鼠腹部激发部位皮肤发生致敏反应情况，并按Magnusson和Kligman等级记进行分级^[26-27]：无明显改变，为0级；散在性或斑点状红斑，为1级；中度融合性红斑，为2级；重度红斑和水肿，为3级。

根据Magnusson和Kligman分级标准，当阴性对照组动物等级< 1，而实验组等级≥1时，提示实验组具有致敏性；当阴性对照组动物等级≥1时，而实验组动物反应超过对照组中最严重的反应也可认为实验组具有致敏性。如为疑似反应，则需再次行激发实验。

致敏率=各组等级≥1的动物数/该组动物数

平均反应记分=各组等级记分之和/该组动物数

1.5.2 切片显微镜下观察激发阶段结束，在除去贴敷物72 h时取各组豚鼠腹部激发部位全层皮肤组织制片，进行苏木精-伊红染色，在光学显微镜下观察炎症细胞种类并按炎症分级标准进行反应分级(表1)。

1.6 统计学分析采用SPSS 20.0软件进行统计分析，组间Magnusson和Kligman等级比较采用方差分析，显著性差异水平设为0.05。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

讨论

胸腰椎前路手术具有椎管前方减压、病灶切除、植骨融合等优势而得到广泛开展，而在各类型前路内固定系统快速发展地推动下，胸腰椎前路减压内固定术已成为当前治疗胸腰椎骨折、肿瘤、结核等疾病的常用手术方式之一。但无论是以Kaneda系统为代表的钉棒系统或者以Z-Plate系统为代表的钉板系统都有自身的优缺点，无法完全满足临床的需要^[28-29]。作者自主研制的全内置式可膨胀型脊柱前路内固定系统，是在研究各类型的胸腰椎前路内固定系统的基础上，通过测量50具正常成人干燥尸体T₁-L₅椎体标本设计而成的新型胸腰椎前路内固定系统。该内固定系统由空心椎体钉、内栓和固定棒组成，根据测量所得的国人胸、腰椎体相关数据，初步设计成5个型号，在形态学上符合国人胸、腰椎的解剖特点^[30]。在前期的生物力学实验中，通过与Kaneda系统、Z-Plate系统在拔出力、最大扭矩、三维运动等方面的比较，证明：①该内固定系统拥有更大的抗拔出力，膨胀后把持力和旋转力矩均较前明显增加；②该内固定系统在前屈、后伸和右侧弯方向上的稳定效果和Kaneda系统、Z-Plate系统相似，在左侧弯和左右旋转的稳定性上较Kaneda系统稍差，而与Z-Plate系统相似。3种内固定系统都可重建受损胸腰椎的即刻稳定性，具有良好的生物力学性能^[20]。为增加其固定后期的稳定性，让螺钉与椎体更好地融合成一个整体，作者采用真空等离子喷涂法将羟基磷灰石涂层喷涂于螺钉螺纹表面，制成全新的全内置式可膨胀型生物涂层脊柱前路内固定系统。其具有以下特点：①全内置：脊柱螺钉及连接棒完全植入椎体和椎体间，减少了对周围神经、血管等重要结构的干扰，且植入后的内固定器更接近脊柱的力学传导中心，不容易出现内固定松动或断裂；②可膨胀性：螺钉前端可膨胀，增加了螺钉的把持力和防旋功能；③永久固定：螺钉中空，前端可植骨并通过孔道与椎体相通，骨质连接螺钉内外，有利于椎体钉与椎体更好地融合为一个整体，进一步增强其稳定性^[30]；④生物涂层：螺钉表面的羟基磷灰石涂层含有人体骨组织新陈代谢所需的钙、磷等元素，是人体骨骼组织的主要无机成分，植入胸、腰椎体后可与骨组织在短期内形成稳定的化学连接，进一步促进内固定系统与骨组织的融合。此外，有研究表明，羟基磷灰石涂层有抑制植入材料有毒离子释放的作用，具有良好的生物相容性^[31-33]。

生物医用材料作为植入物必须与人体具有良好的生物相容性和安全性，不能对周围组织及全身各个系统造成毒害作用。全内置式可膨胀型生物涂层脊柱前路内固定系统由钛合金及表面羟基磷灰石涂层组成，而钛合金材料在植入生物体后具有不耐磨性质，可释放微量毒性金属，对生物体造成毒害作用^[34-35]，此次部分实验以豚鼠为研究对象，根据《GB/T 16886.10-2005医疗器械生物学评价第10部分：刺激与迟发型超敏反应试验》标准中的最大剂量致敏实验来评价全内置式可膨胀型生物涂层脊柱前路内固定系统作为植入物在致敏方面的安全性^[24]。

最大剂量致敏实验是将被测材料或其浸提液通过皮内注射诱导、局部诱导及激发3个阶段作用于实验动物，通过观察实验动物激发部位的皮肤反应或者在显微镜下观察炎症反应来评价被测材料致敏性的动物实验。其原理为变异原引发T细胞介导产生的Ⅳ型迟发超敏反应，在皮内注射及局部贴敷致敏材料的两次诱导阶段中，致敏材料进入体内成为完全性抗原，并被提呈给有记忆功能的特异性T淋巴细胞，而在激发阶段，致敏材料再次进入实验动物体内，引发机体内被激活的T淋巴细胞释放炎性因子，从而引起周围组织损伤，出现红斑及水肿等致敏反应。完全弗氏佐剂与实验材料混合在一起可增加抗原的表面积，且可延长抗原在体内的停留时间，进而起到提高致敏实验成功率的作用^[36-37]。

此次实验中，实验组和阴性对照组豚鼠在激发阶段结束后的24 h和48 h两个时间点，腹部激发部位皮肤均未发生红斑或水肿反应，毛发生长良好，Magnusson和Kligman等级为0级；阳性对照组豚鼠在这两个时间点腹部激发部位皮肤均发生致敏反应，出现中度融合性红斑或严重红斑及水肿现象，部分皮肤甚至出现结痂，Magnusson和Kligman等级为2至3级。经过统计学分析，实验组和阴性对照组在Magnusson和Kligman分级比较中无明显差异(P > 0.05)，而与阳性对照组比较差异明显(P < 0.05)。这显示由钛合金和羟基磷灰石涂层制成的全内置式可膨胀型生物涂层脊柱前路内固定系统浸提液无致敏性。此外，在激发阶段结束72 h时，取3组豚鼠腹部激发部位全层皮肤组织制片并显微镜下观察可知：阳性对照组可见中性粒细胞和淋巴细胞浸润的炎性反应，皮肤组织出现充血、水肿反应，炎症分级为Ⅱ-Ⅳ级；实验组和阴性对照组在这个时间点均未见明显炎性细胞浸润，组织无明显充血、水肿形成，炎症分级为Ⅰ级，这再次说明此该内固定材料不引起致敏反应^[38]。

综上所述，全内置式可膨胀型生物涂层脊柱前路内固定系统植入生物体后不引发致敏反应，符合作为植入性的医用生物材料在迟发型超敏反应实验中的相关要求，在致敏方面的生物相容性良好。但仍需通过体外细胞毒性实验、植入后局部反应实验、遗传毒性实验等相关实验来评价其安全性。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

全内置式可膨胀型生物涂层脊柱前路内固定系统最大剂量的致敏实验

A unique built-in expandable bio-coating anterior spinal fixation: a sensitization test at the maximum sensitization dosage

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