提高小鼠原代肝星状细胞获得率及纯度的分离方法

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.0903

中国组织工程研究 ›› 2018, Vol. 22 ›› Issue (21): 3376-3380.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.0903

• 干细胞培养与分化 stem cell culture and differentiation • 上一篇下一篇

提高小鼠原代肝星状细胞获得率及纯度的分离方法

徐莹¹，张定棋^1，2，慕永平¹，陈佳美¹，王清兰²，平键¹，刘伟¹，刘平^1，2

¹上海中医药大学，上海中医药大学附属曙光医院，上海市中医药研究院肝病研究所，肝肾疾病病证教育部重点实验室，上海中医临床重点实验室，上海市 201203；²上海中医药大学，上海高校中医内科学 E-研究院，上海市 201203

修回日期:2018-03-13 出版日期:2018-07-28 发布日期:2018-07-28
通讯作者: 刘平，博士，教授，上海中医药大学，上海中医药大学附属曙光医院，上海市中医药研究院肝病研究所，肝肾疾病病证教育部重点实验室，上海中医临床重点实验室，上海市 201203；上海中医药大学，上海高校中医内科学 E-研究院，上海市 201203；刘伟，博士，助理研究员，上海中医药大学，上海中医药大学附属曙光医院，上海市中医药研究院肝病研究所，肝肾疾病病证教育部重点实验室，上海中医临床重点实验室，上海市 201203
作者简介:徐莹，女，1989年生，宁夏回族自治区银川市人，汉族，上海中药大学在读博士，主要从事慢性肝病的研究。
基金资助:
国家自然科学基金重点项目(81530101)；国家自然科学基金项目(81703681)；上海市青年科技英才扬帆计划资助项目(17YF1419800)；中国博士后科学基金资助项目(2016M601643)

An improved method for isolation of mouse primary hepatic stellate cells with high yield and purity

Xu Ying¹, Zhang Ding-qi^{1, 2}, Mu Yong-ping¹, Chen Jia-mei¹, Wang Qing-lan², Ping Jian¹, Liu Wei¹, Liu Ping^{1, 2}

¹Institute of Liver Diseases, Shuguang Hospital affiliated to Shanghai University of Traditional Chinese Medicine, Key Laboratory of Liver and Kidney Disease (Ministry of Education), Shanghai Key Laboratory of Traditional Chinese Clinical Medicine, Shanghai 201203, China; ²E-Institute of Traditional Chinese Internal Medicine, Shanghai Municipal Education Commission, Shanghai University of Traditional Chinese Medicine, Shanghai 201203, China

Revised:2018-03-13 Online:2018-07-28 Published:2018-07-28
Contact: Liu Ping, M.D., Professor, Institute of Liver Diseases, Shuguang Hospital affiliated to Shanghai University of Traditional Chinese Medicine, Key Laboratory of Liver and Kidney Disease (Ministry of Education), Shanghai Key Laboratory of Traditional Chinese Clinical Medicine, Shanghai 201203, China; E-Institute of Traditional Chinese Internal Medicine, Shanghai Municipal Education Commission, Shanghai University of Traditional Chinese Medicine, Shanghai 201203, China； Liu Wei, M.D., Assistant researcher, Institute of Liver Diseases, Shuguang Hospital affiliated to Shanghai University of Traditional Chinese Medicine, Key Laboratory of Liver and Kidney Disease (Ministry of Education), Shanghai Key Laboratory of Traditional Chinese Clinical Medicine, Shanghai 201203, China
About author:Xu Ying, Doctorate candidate, Institute of Liver Diseases, Shuguang Hospital affiliated to Shanghai University of Traditional Chinese Medicine, Key Laboratory of Liver and Kidney Disease (Ministry of Education), Shanghai Key Laboratory of Traditional Chinese Clinical Medicine, Shanghai 201203, China
Supported by:
the Key Project of National Natural Science Foundation of China, No. 81530101; National Natural Science Foundation of China, No. 81703681; Shanghai Sailing Program, No. 17YF1419800; China Postdoctoral Science Foundation, No. 2016M601643

摘要/Abstract

摘要：

文章快速阅读：

文题释义：
肝星状细胞：又称贮脂细胞，是肝脏中的一种间质细胞，位于Disse间隙，胞体主要呈卵圆形或不规则形，胞质内富含类维生素A脂滴，正常肝脏中肝星状细胞的数目很少，与肝细胞数量之比为1∶20，其总体积占肝体积的1.4%。肝星状细胞主要具有以下功能：储存和代谢维生素A；合成和分泌少量的细胞外基质，主要有Ⅰ、Ⅲ、Ⅵ型胶原纤维；对内皮细胞起支撑作用，并有调节肝窦大小的作用；合成非胶原糖蛋白和蛋白多糖等功能。
小鼠原代肝星状细胞：从小鼠肝脏中可分离得到的一种可在体外增殖培养的原代间质细胞，广泛用于体外研究肝星状细胞的生物学特性，对肝纤维化及肝癌等肝脏疾病的研究有重要研究价值。

摘要
背景：由于小鼠肝脏小、血管较细，其原代肝星状细胞分离的难度相对较大，且得率有限，难以满足体外实验需求。
目的：建立小鼠原代肝星状细胞高效稳定的分离方法，提高小鼠原代肝星状细胞的得率与纯度，为研究肝纤维化的机制奠定实验基础。
方法：取成年雄性C57BL/6小鼠，以无钙镁离子的前灌流液经门静脉充分灌注肝脏，再先后以1 g/L链霉蛋白酶和0.7 g/L Ⅳ型胶原酶灌注，使用Nycodenz进行梯度密度离心，获取中间层原代肝星状细胞，锥虫蓝染法观察肝星状细胞活力，流式细胞法检测细胞纯度，免疫荧光法检测Desmin表达，并于倒置显微镜下观察细胞培养3，5，7 d后的形态变化，PCR法检测培养3，5，7 d后α-平滑肌肌动蛋白及Ⅰ型胶原蛋白基因表达情况。
结果与结论：①每只小鼠肝脏可获得肝星状细胞(5.5±0.4)×10⁶个，锥虫蓝检测细胞活力均大于95%，流式细胞法检测细胞纯度为94%，免疫荧光检测细胞高表达Desmin；②随着体外培养时间的延长，可见原代肝星状细胞逐渐由圆形向星型发展；③随培养天数增长，α-平滑肌肌动蛋白及Ⅰ型胶原蛋白表达逐渐升高；④结果提示，实验成功建立了高效分离小鼠肝星状细胞的方法，可为获得高纯度、高细胞活力的小鼠原代肝星状细胞提供技术方案，也为肝纤维化的机制研究提供技术保障。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程
ORCID: 0000-0003-2633-3295(徐莹)

关键词: 肝星状细胞, 细胞分离技术, 原代细胞, 细胞外基质, 荧光鉴定, 肝纤维化, 细胞得率, 国家自然科学基金

Abstract:

BACKGROUND: Due to the small liver and fine blood vessels in the mice, it is difficult to isolate primary hepatic stellate cells, resulting in a limited yield which cannot meet the needs of in vitro experiments.
OBJECTIVE: To explore the high-performance and stable method for isolation of mouse primary hepatic stellate cells, with high yield and purity, thereby laying an experimental foundation for studying the mechanism of hepatic fibrosis.
METHODS: Adult male C57BL/6 mice undertook liver infusion with prefusion solution with no calcium and magnesium ions via the portal vein, followed by digestion using 1 g/L pronase and 0.7 g/L collagenase. Then, the liver samples were centrifuged with Nycodenz density gradient solution to obtain primary hepatic stellate cells from the middle layer. Trypan blue staining method was used to calculate cell viability, and flow cytometry method was used to measure cell purity. Immunofluorescence method was used to detect the expression of Desmin in cells. Cell morphology was observed under inverted microscope at 3, 5, 7 days of primary culture, and the expression of α-smooth muscle actin was detected by PCR.
RESULTS AND CONCLUSION: The yield of cells per mouse was (5.5±0.4)×10⁶ cells. Trypan blue assay showed that the viability of isolated cells was over 95%, and the purity of isolated cells was 94% as measured by the flow cytometry. The cells highly expressed Desmin by immunofluorescence. With the prolongation of culture time in vitro, round cells were gradually changed into star-shaped cells, and the expression of α-smooth muscle actin and type I collagen gradually increased. This study successfully established the high-performance and stable method for isolation of mouse primary hepatic stellate cells, providing a technical scheme for obtaining high-purity and high-viability mouse primary hepatic stellate cells, and also providing a technical support for research on the mechanism of liver fibrosis.

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

Key words: Hepatocytes, Cell Separation, Tissue Engineering

中图分类号:

R394.2

徐莹，张定棋，慕永平，陈佳美，王清兰，平键，刘伟，刘平. 提高小鼠原代肝星状细胞获得率及纯度的分离方法[J]. 中国组织工程研究, 2018, 22(21): 3376-3380.

Xu Ying, Zhang Ding-qi, Mu Yong-ping, Chen Jia-mei, Wang Qing-lan, Ping Jian, Liu Wei, Liu Ping. An improved method for isolation of mouse primary hepatic stellate cells with high yield and purity[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2018, 22(21): 3376-3380.

图/表（结果） 1

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引言

材料方法

1.1 设计 细胞分离实验。

1.2 时间及地点 于2017年6月至12月在上海中医药大学附属曙光医院肝病研究所完成。

1.3 材料

实验动物：雄性C57BL/6小鼠10只，体质量(27.0±2.1) g，由上海斯莱克实验动物有限责任公司提供，普通饲料喂养，进行实验前禁食24 h。

实验主要试剂及仪器：Ⅳ型胶原酶DNA 酶Ⅰ、链霉蛋白酶购于RD公司；DMEM 培养液、胎牛血清购于Gibco公司；Nycodenz分离购于Sigma公司；小鼠Desmin单克隆抗体购于Sigma公司；荧光标记的二抗购于Invitrogen公司；RNA抽提试剂盒：Total RNA Purification Kit MagExtractor(Cat：NPK-201F)、RNA酶去除试剂盒：RNase Destroyer(Lot：BE0724)、反转录试剂盒：Rever Tra Ace qPCR RT Master Mixwith gDNA Remover(Cat：FSQ-301)、qRT-PCR试剂盒：SYBR Green Real Time PCR Master Mix(Cat：QPK-20)均购于TOYOBO公司；Olympus荧光倒置相差显微镜、Beckman离心机、NanoDrop分光光度计、流式细胞检测仪。

1.4 方法

1.4.1 试剂的制备

前灌流液配制(1 L)：称取8 g 氯化钠、0.4 g氯化钾、0.078 g磷酸二氢钠、0.151 g磷酸氢二钠、2.38 g 4-羟乙基哌嗪乙磺酸、0.19 g乙二醇双(2-氨基乙基醚)四乙酸、0.35 g碳酸氢钠、0.9 g葡萄糖使用细胞用水定容至1 L即得前灌流液。

酶缓冲液配制(1 L)：称取8 g氯化钠、0.4 g氯化钾、0.078 g磷酸二氢钠、0.151 g磷酸氢二钠、2.38 g 4-羟乙基哌嗪乙磺酸、0.19 g乙二醇双(2-氨基乙基醚)四乙酸、0.35 g碳酸氢钠、0.56 g氯化钙使用细胞用水定容至1 L即得酶缓冲液。

后分散液配制(50 mL)：称取链霉蛋白酶17 mg；胶原酶17 mg使用EB酶缓冲液定容至50 mL得后分散液。

密度梯度分散液(100 mL)：称取28.7 g碘海醇溶液溶于100 mL 格氏平衡盐溶液中即得密度梯度分散液。

所有配制液均经0.45 µm滤膜过滤，4 ℃保存备用。

1.4.2 小鼠原代肝星状细胞的分离 体积分数3%过氧化氢水循环消毒管道约20 min，换用灭菌细胞用水循环20 min。预充前灌流液，注意排空管道内气泡，同时37 ℃水浴保持各灌流液温度。用3%戊巴比妥按0.01 mL/g腹腔注射麻醉小鼠，仰卧位固定四肢，剖开腹部暴露门静脉及下腔静脉，将24 G留置针插入门静脉，并用手术细线从门静脉下穿过用于固定留置针，将前灌流液50 mL以 5 mL/min的速度灌注肝脏，当肝脏充盈时剪断下腔静脉，充分灌注约10 min至肝脏变为均匀的土黄色；更换为1 g/L链霉蛋白酶溶液(50 mL)继续灌注约10 min，再更换为0.7 g/LⅣ型胶原酶溶液(50 mL)灌注约10 min(图1A)；灌流完毕后摘除肝脏置于无菌器皿中，剔除肝脏背膜及胆囊，轻柔撕碎肝脏组织，将肝组织移入分散液(40 mL)，37 ℃摇床消化10 min，用100 μm孔径的过滤肝组织悬液，随后加入体积分数20%胎牛血清2-5 mL终止消化。将细胞悬液37 ℃ 1 700 r/min离心5 min，弃上清取沉淀细胞，加入30 mL无血清DMEM 培养基重悬混匀后再次37 ℃、1 700 r/min离心5 min，弃上清，加入10 mL DMEM培养基、1.5 mL DNA 酶Ⅰ、8.5 mL密度梯度分散液混匀成细胞悬液，用移液枪缓慢铺10 mL格氏平衡盐溶液GBSS，24 ℃、12 000 r/min离心22 min。离心后可见细胞分层，吸取中间白膜层细胞(图1B)，加入无血清DMEM培养基，1 700 r/min离心5 min重复2次清洗细胞碎片，最终将细胞沉淀加入含体积分数20%胎牛血清的DMEM培养基培养。

1.4.3 原代肝星状细胞的培养 原代肝星状细胞以(3-6)×10⁸L^-1的浓度接种至培养皿，在37 ℃恒温、体积分数5% CO₂细胞培养箱培养，24 h首次换液(体积分数10%胎牛血清DMEM)，之后每48 h更换液1次，培养至第6代。

1.4.4 原代肝星状细胞的存活率鉴定用0.04%锥虫蓝染色，鉴定细胞存活率，普通光镜下未着色者为活细胞，细胞计数后统计细胞成活率。

1.4.5 原代肝星状细胞的纯度鉴定 流式细胞法检测原代肝星状细胞的细胞纯度。细胞经胰酶消化，1 000 r/min离心10 min，PBS洗2遍，PBS重悬细胞，分装至EP管(100 µL/管)，2 000 r/min，离心6 min，弃上清，加100 µL PBS重悬并分散细胞，加一抗(Desmin小鼠单克隆抗体，1∶100)孵育1.5 h，2 000 r/min，离心6 min，离心重复2遍，加100 µL PBS重悬并拍散细胞，加荧光标记的抗小鼠二抗(1∶1 000)，4 ℃避光孵育30 min。各管加1 mL PBS，2 000 r/min离心6 min，重复2遍。最后加0.5 mL PBS重悬，再用滤膜过滤除去细胞团以避免堵塞流式仪。

1.4.6 原代肝星状细胞的免疫荧光观测 将分离的原代肝星状细胞培养于放有细胞黏附片的24空板中，于7 d时收集细胞，40 g/L多聚甲醛固定10 min，体积分数0.5% Triton X-100 孵育透膜10 min，小鼠Desmin单克隆抗体(1∶200) 37 ℃避光1 h，用荧光标记的抗小鼠二抗室温下避光孵育 1 h，DAPI染核，抗荧光促灭封片剂封固，在荧光倒置微镜下观察并拍取照片。

1.4.7 PCR检测 将分离获取的细胞直接铺板，分别于3，5，7 d收集细胞，使用TOYOBO试剂盒提取RNA，使用NanoDrop分光光度计测定RNA浓度，并记录260/280 nm及230/280 nm波长吸光度的比值。

1.5 主要观察指标 ①原代肝星状细胞得率范围；②流式细胞检测肝星状细胞标志物Desmin阳性表达率；③原代肝星状细胞形态学变化；④免疫荧光检测肝星状细胞标志物Desmin表达情况；⑤PCR检测α-平滑肌肌动蛋白及Ⅰ型胶原蛋白的表达情况。

1.6 统计学分析 应用SPSS 18.0软件进行统计处理，计量资料以x(_)±s表示，P < 0.05为差异有显著性意义。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

讨论

由于肝星状细胞在肝脏中比例较少，并且小鼠体积较小，血管细，分离原代肝星状细胞的操作难度较大，难以满足大多实验的需求，为保证实验细胞用量，需多次分离多只小鼠，时间及经济成本较高。在过去的几十年中，对肝纤维化的发生机制及其转归的研究一直是医学界研究的重点，目前肝星状细胞已成为研究肝纤维化发生机制中最受重视的细胞^[21-22]。因此，体外分离足量、稳定且纯度高的肝星状细胞是体外研究的必备条件。目前大多数分离大鼠原代肝星状细胞进行研究，而越来越多的研究表明小鼠模型在疾病研究中有其独特的优势，如体内实验操作性更方便、饲养更经济、获得基因工程鼠更容易^[23-25]。但由于小鼠肝脏小、血管较细，其原代肝星状细胞分离的难度相对较大，且得率有限[(0.5-1.0)×10⁶个/肝)，难以满足体外实验需求^[25-28]。鉴于此，当前研究采用在体原位肝脏灌注结合密度梯度离心技术，在适当提高消化酶含量的前提下调整灌流及消化时间，使细胞得率大幅度提升，对于探讨各种致病因素引起肝脏纤维化发生的分子机制提供便利。

通过反复实验，发现提高小鼠原代肝星状细胞分离得率及纯度的主要技术条件包括：①灌流前保证各灌流液温度在37 ℃左右，确保胶原酶及蛋白酶在适宜温度充分发挥作用；②灌注时应避免气泡进入门静脉，导致灌注形成栓塞，影响灌注效果；③灌流液消化酶含量的选择。链霉蛋白酶可以选择性消化肝细胞^[11]。当前实验中发现链霉蛋白酶的浓度对肝星状细胞的得率影响较大，经过多次摸索，发现适当提高链霉蛋白酶含量可增加原代肝星状细胞纯度，实验最终确定使用的链霉蛋白酶浓度为1 g/L，比文献报道使用链霉蛋白酶浓度0.05-0.50 g/L要高^[29]。提示适当提高消化酶浓度可显著提高肝星状细胞得率，这可能与较高浓度的链霉蛋白酶能够使肝脏消化更加充分有关；④细胞分离液的选择。Nycodenz与Percoll均是较常用的细胞分离液，Percoll的黏滞度比Nycodenz要高。有实验比较了2种分离液分离原代肝星状细胞，发现Percoll易出现白色絮状物，而Nycodenz在细胞分离时梯度形成更为稳定，分离获得原代肝星状细胞的得率及纯度也较Percoll高，并且Nycodenz配制相当更简便^[30]；⑤由于肝星状细胞与Kuppfer细胞密度相近，因此密度梯度离心吸取中间层时应当避免吸到下层，以减少Kuppfer细胞的混入；⑥原代肝星状细胞的培养。原代肝星状细胞贴壁较快，4 h基本全部贴壁，因而接种的细胞数目甚为重要，原代肝星状细胞离体后需要适应体外环境，接种浓度太低或数量太少，将会减弱细胞自分泌和旁分泌细胞因子的刺激作用，影响细胞的正常生长。此外，建议细胞培养的前24 h采用含体积分数20%胎牛血清的培养液进行培养。

综上，该实验通过提高消化酶浓度、控制后分散液消化时间等方法较大幅度提高分离获得原代肝星状细胞的数量及纯度，为肝星状细胞活化及相应分子、生物学功能研究提供了重要的技术保障。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

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