miR-467g下调Runx-2表达抑制成骨前体细胞的分化和矿化

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.0827

中国组织工程研究 ›› 2018, Vol. 22 ›› Issue (16): 2483-2488.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.0827

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miR-467g下调Runx-2表达抑制成骨前体细胞的分化和矿化

常志强，张立峰，李鹏飞，马敏，郭军

内蒙古医科大学第二附属医院，内蒙古自治区呼和浩特市 010030

收稿日期:2017-12-07 出版日期:2018-06-08 发布日期:2018-06-08
通讯作者: 郭军，博士，副主任医师，内蒙古医科大学第二附属医院，内蒙古自治区呼和浩特市 010030
作者简介:常志强，男，1981年生，鄂尔多斯市达拉特旗人，汉族，2013年重庆医科大学毕业，博士，副主任医师，主要从事创伤骨科研究。
基金资助:
内蒙古医科大学科技百万工程(YKD2017KJBW(LH)037)

MiR-467g suppresses the osteogenic differentiation and mineralization of mouse preosteoblasts via down-regulation of Runx-2 expression

Chang Zhi-qiang, Zhang Li-feng, Li Peng-fei, Ma Min, Guo Jun

Second Affiliated Hospital of Inner Mongolia Medical University, Hohhot 010030, Inner Mongolia Autonomous Region, China

Received:2017-12-07 Online:2018-06-08 Published:2018-06-08
Contact: Guo Jun, M.D., Associate chief physicician, Second Affiliated Hospital of Inner Mongolia Medical University, Hohhot 010030, Inner Mongolia Autonomous Region, China
About author:Chang Zhi-qiang, M.D., Associate chief physicician, Second Affiliated Hospital of Inner Mongolia Medical University, Hohhot 010030, Inner Mongolia Autonomous Region, China
Supported by:
the Scientific and Technological Million Program of Inner Monglia Medical University, No. YKD2017KJBW(LH)037

摘要/Abstract

摘要：

文章快速阅读：

文题释义：
成骨前体细胞：成骨细胞根据分化的不同阶段通常可以分为间充质干细胞-未成熟的成骨前体细胞-成熟的成骨细胞-骨细胞。成熟的成骨细胞主要表达Osteocalcin，未成熟的成骨前体细胞主要表达表达Runx-2和Osterix，研究表明未成熟的成骨前体细胞功能非常活跃，其增殖和分化对骨再生非常重要。
Runx-2：是骨髓间充质干细胞成骨分化和骨发育所必需的关键因子，是成骨细胞分化早期最重要的标志基因。

摘要
背景：最新的研究发现miR-467g能抑制骨质再生，但其具体的作用和作用机制尚不明确。
目的：探索miR-467g 对小鼠成骨前体细胞成骨分化和矿化的影响及其机制。
方法：体外分离、培养C57小鼠成骨前体细胞，通过 Western-blot、实时定量PCR、碱性磷酸酶染色、茜素红染色等实验探索小鼠成骨前体细胞诱导分化过程中，成骨分化指标Runx-2、Osterix、Osteocalcin表达变化情况及碱性磷酸酶活性和矿化能力，以及miR-467g和它潜在靶基因Runx-2表达水平的变化；通过脂质体转染构建miR-467g高表达的小鼠成骨前体细胞，研究miR-467g对小鼠成骨前体细胞成骨分化的影响。利用荧光素酶实验检测miR-467g对Runx-2的靶向作用。
结果与结论：①分离培养的小鼠成骨前体细胞具有良好的体外增殖与分化能力；②miR-467g表达水平随小鼠成骨前体细胞诱导分化时间的增加而降低；③miR-467g 能够抑制小鼠成骨前体细胞成骨分化和矿化；④荧光素酶实验证实miR-467g直接靶向Runx-2；⑤结果提示：miR-467g 通过下调Runx-2抑制小鼠成骨前体细胞成骨分化和矿化。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程
ORCID: 0000-0003-2617-8838(常志强)

关键词: 成骨前体细胞, 组织构建, 成骨分化, 矿化, MiR-467g

Abstract:

BACKGROUND: Preliminary studies have found miR-467g inhibits bone regeneration, however, there is little information about the underlying mechanism.
OBJECTIVE: To explore the effect of miR-467g on osteogenic differentiation and mineralization of mouse preosteoblasts and the underlying mechanism.
METHODS: C57 mouse preosteoblasts were isolated and cultured in vitro. The expression levels of Runx-2, Osterix, and Osteocalcin, as well as alkaline phosphatase and mineralization activities were determined by western blot, real-time PCR, alkaline phosphatase and Alizarin red staining, respectively. miR-467g-overexpressed preosteoblasts were constructed to investigate the effect of miR-467g on osteogenic differentiation and mineralization of preosteoblasts by lipofection transfection. Dual luciferase reporter assay was used to identify whether the 3’UTR of Runx-2 mRNA was a binding target of miR-467g.
RESULTS AND CONCLUSION: The primary mouse preosteoblasts had a good osteogenic proliferation and differentiation ability in vitro. Expression level of miR-467g was decreased with the increase in osteogenic induction time. MiR-467g suppressed the osteogenic differentiation and mineralization of mouse preosteoblasts. Luciferase assay confirmed that miR-467g targeted Runx-2 directly. In summary, miR-467g can suppress the osteogenic differentiation and mineralization of mouse preosteoblasts via down-regulation of Runx-2 expression.

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

Key words: Osteoblasts, Genes, Cell Differentiation, Tissue Engineering

中图分类号:

R318

常志强，张立峰，李鹏飞，马敏，郭军. miR-467g下调Runx-2表达抑制成骨前体细胞的分化和矿化[J]. 中国组织工程研究, 2018, 22(16): 2483-2488.

Chang Zhi-qiang, Zhang Li-feng, Li Peng-fei, Ma Min, Guo Jun. MiR-467g suppresses the osteogenic differentiation and mineralization of mouse preosteoblasts via down-regulation of Runx-2 expression[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2018, 22(16): 2483-2488.

图/表（结果） 1

2.1 小鼠原代成骨前体细胞形态学观察培养24 h后可见细胞从组织块攀爬出、贴壁生长，细胞形态开始伸张开，呈梭形、三角形、多边形、有长短不一的突起，成簇状生长(图1A)。经反复传代，组织残块消失，细胞得到纯化，生长状况良好，均匀贴附于培养皿(图1B)。

2.2 小鼠原代成骨前体细胞分化能力和矿化能力原代细胞成骨诱导培养0，4，8，12，16 d后，通过Western-blot和钙化结节染色(茜素红法)检测成骨分化特异基因Runx-2、Osterix、Osteocalcin表达水平来观察提取的原代成骨前体细胞成骨分化能力和矿化情况。发现Runx2、Osterix、Osteocalcin的表达水平均随着诱导时间的增加而升高(图2A)，在诱导培养第8天开始出现大小不一的钙化结节，并随着诱导时间的增加而增多(图2B-D)。这些结果表明提取的小鼠原代成骨前体细胞具有优良的体外成骨分化能力和矿化能力。

2.3 小鼠成骨前体细胞成骨分化miR-467g和Runx-2表达通过qRT-PCR和Western-blot分别检测了miR-467g以及它的潜在靶基因Runx-2在诱导过程中的表达水平变化，发现miR-467g随诱导时间的增加而降低(图3)，Runx-2则升高(图2A)。

2.4 miR-467g抑制小鼠成骨前体细胞成骨分化为了探究miR-467g对小鼠成骨前体细胞向成骨细胞分化影响，首先通过脂质体转染构建miR-467g 高表达的细胞和对照细胞，然后诱导其向成骨分化，在分化的第8天，检测碱性磷酸酶活性和矿化情况，发现miR-467g高表达组相比于对照组，碱性磷酸酶活性明显降低(图4A，B)，钙化结节明显减少(图4C，D)。

此外，采用Western-blot检测两组细胞中骨分化标志物Runx-2、Osterix、Osteocalcin蛋白的表达。结果显示miR-467g高表达组相比于对照组Runx2、Osterix、Osteocalcin蛋白表达有明显降低(图4E)。这些结果表明miR-467g抑制了成骨前体细胞向成骨细胞的分化进程。

2.5 miR-467g直接靶向Runx-2 通过miRanda和Targetscan等在线软件发现miR-467g的潜在靶基因有 2 000多个，其中Runx-2与成骨分化关系最为密切。采用荧光素酶验证miR-467g是否直接靶向Runx-2，结果显示共转染Runx-2野生型的实验组的荧光素酶活性明显低于对照组，而共转染Runx-2突变型的实验组与对照组的荧光素酶活性无显著差异，这证实miR-467g可以直接作用于Runx-2(图5A)。采用miR-467g抑制剂进一步验证，结果显示转染miR-467g抑制剂组相对于抑制剂对照组小鼠成骨前体细胞有明显较高的Runx-2蛋白表达(图5B)。

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引言

骨组织是一种高度矿化而又维持着骨重构的组织，骨重构主要依靠成骨细胞和破骨细胞共同完成，二者一个促进成骨一个促进骨吸收，保持着动态平衡^[1-⁴^]。成骨细胞或者破骨细胞的正常增殖、分化与凋亡是维持骨组织稳态的关键^[^5-6^]，一旦平衡被打破，就容易导致骨质疏松症等多种骨代谢紊乱疾病^[7]。成骨细胞根据分化的不同阶段通常可以分为间充质干细胞-未成熟的成骨前体细胞-成熟的成骨细胞-骨细胞^[8-10]。成熟的成骨细胞主要表达Osteocalcin^[11]，未成熟的成骨前体细胞主要表达Runx-2和Osterix^[12-13]，研究表明未成熟的成骨前体细胞功能非常活跃，其增殖和分化对骨再生非常重要，研究成骨前体细胞增殖和分化的机制对预防骨质疏松症等骨量丢失性疾病具有重要意义^[¹⁴^-¹⁵^]。

越来越多的研究报道，miRNAs参与了骨重构，miRNAs可以调控成骨细胞或破骨细胞的增殖、分化、凋亡等过程，在骨代谢疾病中也发挥了重要作用，例如miR-144、miR-138、miR-125a-3p、miR-124、miR-33-5p等^[¹⁶^-²⁰^]，近期的研究发现miR-467g能抑制骨质再生^[²¹^]，但是其具体的作用机制尚不清楚。本研究通过miRanda和Targetscan等靶基因预测软件预测miR-467g的潜在靶基因，并筛选出与成骨分化关系密切基因，发现Runx-2是其中之一。而Runx-2是骨髓间充质干细胞成骨分化和骨发育所必需的关键因子，是成骨细胞分化早期最重要的标志基因^[^22-23^]。因此miR-467g有可能通过靶向抑制Runx-2的表达抑制成骨细胞分化成熟。

研究通过分离培养小鼠成骨前体细胞，采用成骨分化诱导培养体系诱导其向成熟的成骨细胞分化，通过实时定量PCR、Western-blot、碱性磷酸酶染色、茜素红染色、脂质体转染、荧光素酶等实验探索miR-467g对小鼠成骨前体细胞成骨分化和矿化的影响及作用机制。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

材料方法

1 材料和方法 Materials and methods

1.1 设计细胞分子生物学体外实验。

1.2 时间及地点实验于2016年3至12月在内蒙古医科大学基础医学院分子病理学实验室完成。

1.3 材料

实验动物：取新生24-48 h内C57小鼠的乳鼠12只，雌雄不限，由内蒙古医科大学动物实验研究中心提供。

实验用主要试剂：a-MEM培养基，EDTA-胰蛋白酶(美国Corning公司)，胎牛血清，青霉素，链霉素(美国Gibco公司)，Ⅰ-型胶原酶，地塞米松，β-甘油磷酸钠，维生素C(美国Sigma公司)，RNAiso for small RNA，One Step PrimeScript® miRNA cDNA Synthesis Kit，SYBR® Premix Ex Taq^TMⅡ，(大连宝生物工程有限公司)，U6(上海生工生物有限公司)，Dual-Luciferase Reporter System (上海浩然生物技术有限公司)，Lipofectamine® 2000 Transfection Reagent，Gene Tailor^TM Site-Directed Mutagenesis System试剂盒(美国Invitrogen公司)，碱性磷酸酶染色试剂盒(南京建成生物制品有限公司)，细胞茜素红(ALIZARIN RED S)钙染色试剂盒(上海杰美基因医药科技有限公司)。miR-467g模拟物和miRNA模拟物对照，miR-467g抑制剂和抑制剂对照(上海赛默飞世尔科技公司)，Runx-2、Osterix、Osteocalcin抗体(英国Abcam公司)，β-actin抗体和辣根过氧化物酶标记二抗(北京锐抗生物科技有限公司)，RIPA 裂解液，BCA蛋白浓度测定试剂盒(上海碧云天生物技术有限公司)。

1.4 实验方法

1.4.1 小鼠原代成骨前体细胞的提取、分离和培养将12只乳鼠浸泡于体积分数75%的乙醇5 min，在无菌条件下分离出乳鼠的颅盖骨，浸泡于含青霉素、链霉素的 0.01 mol/L PBS，剔除附着的结缔组织，用PBS重复清洗3次，将其置入盛有a-MEM培养基的培养皿中，剪成 0.5 mm×0.5 mm大小碎块，30-40块/皿，加入0.25%胰蛋白酶5 mL，置入孵箱中消化20 min，血清终止消化，弃上清液，加入0.1%Ⅰ型胶原酶3.0-4.0 mL，于37 ℃消化20 min，加入体积分数10%胎牛血清a-MEM培养基4 mL终止消化，低温离心机1 000 r/min离心5 min，弃去上清；重复用Ⅰ型胶原酶消化3次，弃去上清，将沉淀物转移入培养皿中，加入4 mL体积分数10%胎牛血清a-MEM培养基于培养箱中培养。48 h后换液，以后隔日换液1次^[24-26]。

1.4.2 成骨细胞的培养、纯化及传代在原代培养过程中，每48 h换液1次至细胞融合成单层，密度长至80%融合时，将原代培养细胞用0.25%胰酶消化，按1∶3的比例进行传代培养。采用差速贴壁法进行成骨细胞的纯化，取纯化后的细胞进行实验。

1.4.3 细胞转染与成骨诱导根据Lipofectamine 2000转染试剂盒操作说明进行转染实验，选取生长状态良好的小鼠成骨前体细胞接种到6孔板中，待细胞贴壁，增殖至面积的50%-60%，将miR-467g模拟物(miR-467g mimics)和miRNA模拟物对照(miR-control)、miR-467g抑制剂(anti-miR-467g)和抑制剂对照(anti-miR-control)，转染至小鼠成骨前体细胞，转染24 h后更换新鲜的培养液^[27-28]，并诱导其向成骨分化。成骨诱导培养基为含有50 mg/L维生素C、0.1 μmol/L地塞米松、10 mmol/L β-甘油磷酸钠的10%胎牛血清a-MEM培养液^[29-30]。

1.4.4 实时定量PCR(qRT-PCR)检测miR-467g表达收集提取诱导0，4，8，12，16 d细胞总miRNA，根据试剂盒操作说明进行反转录得到cDNA，以U6为内参基因进行实时定量PCR，对miR-467g进行相对定量，qRT-PCR数据分析采用比较Ct法，每个样本重复3次，并取平均值进行分析。

1.4.5 Western-blot 用RIPA裂解液于冰上裂解细胞，离心取上清，BCA法检测上清总蛋白浓度，加入适量 loading buffer 100 ℃加热裂解10 min，每次取10 μL制备的蛋白质样品经过SDS-PAGE、转膜、封闭、孵一抗、洗膜、孵二抗、洗膜、化学发光法成像显影。

1.4.6 碱性磷酸酶活性和矿化能力检测细胞接种方法同上，体积分数75%乙醇固定30 min，按碱性磷酸酶染色试剂盒要求进行染色，阳性细胞可见红褐色或灰褐色颗粒沉积在胞浆碱性磷酸酶活性部位，颜色深浅代表酶的活性^[31-32]。钙化结节染色(茜素红法)：细胞接种方法同上，弃培养基，用PBS冲洗2次，体积分数75%乙醇固定 30 min，蒸馏水冲洗3次，0.1%茜素红[茜素红-Tris-Hcl (pH 8.3)]染色，37 ℃，30 min，蒸馏水冲洗。低倍镜视野下观察矿化结节^[33-34]。

1.4.7 荧光素酶活性实验将Runx-2 3’UTR片段的PCR扩增产物克隆到pGL3质粒Xbal Ⅰ酶切位点，构建野生型pGL3-WT-Runx-2报告基因质粒。按照Gene Tailor^TM Site-Directed Mutagenesis System试剂盒说明书突变Runx-2 3’UTR上miR-467g结合位点，构建突变型pGL3-MUT-Runx-2 真核表达载体。取小鼠成骨前体细胞分别转染为以下4组：①Runx-2野生型质粒：对照组(野生型Runx-2质粒和miRNA模拟物对照)，实验组(野生型Runx-2质粒和miR-467g模拟物)；②Runx-2突变型质粒：对照组(突变型Runx-2质粒与miRNA模拟物对照)，实验组(突变型Runx-2质粒与miR-467g模拟物)。转染24 h后，收集细胞，用Dual-Luciferase Reporter System检测各组细胞的荧光素酶活性。

1.5 主要观察指标 ①观察小鼠成骨前体细胞分化过程Runx-2、Osterix、Osteocalcin、miR-467g的表达和矿化情况；②转染miR-467g模拟物与模拟物对照的小鼠成骨前体细胞诱导分化后细胞Runx-2、Osterix、Osteocalcin的表达和碱性磷酸酶活性、矿化情况；③转染miR-467g抑制剂与抑制剂对照的小鼠成骨前体细胞诱导分化后Runx-2的表达以及miR-467g对小鼠成骨前体细胞成骨分化的作用机制。

1.6 统计学分析采用SPSS 20.0软件进行统计分析，数据均以x(_)±s表示，两组间比较采用t 检验，多组间比较采用单因素方差分析，组间多重比较采用Bonferroni检验，P < 0.05认为差异有显著性意义。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

讨论

MicroRNAs(miRNA)是近年来发现的一类单链非编码

小分子RNA^[35-36]，通过抑制靶mRNA的翻译过程或降解靶

mRNA分子，介导基因转录后调控^[37-39]，在很多的病理生理过程中发挥重要作用，如心血管疾病、肿瘤的生长、免疫应答、炎症反应、浓毒症^[^40-45^]。越来越多的研究报道，miRNAs可以调控成骨细胞和破骨细胞增殖、分化、凋亡等过程^[¹⁷^，⁴⁶^-⁴⁹^]，例如miR-195通过靶向SMAD7促进人骨髓间充质干细胞成骨分化^[⁵⁰^]、miR-155通过下调BMP9/ Smad信号通路抑制间充质干细胞C3H10T1/2成骨分化^[⁵¹^]，miR-214通过直接靶向ATF4抑制成骨细胞活性及基质矿化^[⁵²^]。miR-21能抑制PDCD4基因的表达，减少PDCD4对c-Fos的抑制，从而促进破骨细胞分化^[⁵³^]。MiR-9718能通过抑制PIAS3表达促进NFATC1，MITF，c-Fos和NF-kB等转录因子表达，进而达到促进破骨细胞分化的作用^[⁵⁴^]。miRNAs在骨代谢疾病中也发挥了重要作用，例如Li等在2例极其罕见的少年骨质疏松身上发现miR-2861出现突变，并在小鼠骨质疏松模型上得进行验证，结果发现miR-2861通过抑制HDAC5与Runx-2结合促进了成骨细胞的分化^[⁵⁵^]。Wang等^[⁵⁶^]研究发现绝经后骨质疏松的女性患者外周血单核细胞的miRNAs表达谱与正常患者存在显著差异，miR-503显著下降而miR-133a显著上升。miR-467g是近期新发现一个与骨代谢关系密切的miRNA，目前关于它的研究报道比较少，最新的一个研究发现miR-467g能抑制骨质再生^[²¹^]，推测miR-467g可能对成骨细胞增殖分化存在抑制作用，但具体的作用和作用机制尚不清楚。本研究通过miRanda和Targetscan等在线软件发现骨髓间充质干细胞成骨分化和骨发育所必需的关键因子Runx-2是miR-467g潜在的靶基因，miR-467g可能通过靶向抑制Runx-2抑制成骨分化。

本研究首先通过Western-blot和钙化结节染色(茜素红法)检测成骨分化特异基因Runx-2、Osterix、Osteocalcin表达水平来观察原代细胞经成骨诱导培养后的成骨分化能力和矿化情况，其结果证实：第一，小鼠原代成骨前体细胞分离提取方法简单可靠，分离的原代细胞能在体外保留良好生长状态、体外增殖和成骨分化能力；第二，采用的成骨诱导培养体系能成功诱导成骨前体细胞向成骨细胞分化成熟并形成钙盐沉积，模拟了成骨细胞在体内的生理活性。接着研究通过qRT-PCR和Western-blot分别检测了miR-467g以及它的潜在靶Runx-2在诱导过程中的表达水平变化，结果发现Runx-2随诱导时间的增加而增加，而miR-467g则降低，说明在成骨分化过程中，miR-467g的表达受到抑制。然后通过脂质体转染构建高表达miR-467g的小鼠原代成骨前体细胞并进行成骨诱导培养，利用碱性磷酸酶和钙化结节染色以及成骨分化指标Runx-2、Osterix、Osteocalcin的表达检测miR-467g对成骨分化的作用，结果发现miR-467g能够抑制成骨前体细胞向成骨细胞分化成熟。最后通过荧光素酶实验证实miR-467g确实可以直接靶向Runx-2；而miR-467g抑制剂能有效逆转miR-467g对Runx-2表达的抑制作用进一步证明miR-467g通过直接靶向Runx-2，下调Runx-2的表达抑制了成骨分化。

成骨系统与破骨系统动态平衡是一个复杂的生理过程，也是骨代谢相关疾病发生发展的基本机制。通过研究miR-467g在小鼠成骨前体细胞分化的作用和作用机制，以期在分子水平干预成骨细胞的分化，对防止成骨与破骨稳态失衡，预防成骨发育障碍以及骨代谢紊乱相关疾病提供了新的线索和思路。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

miR-467g下调Runx-2表达抑制成骨前体细胞的分化和矿化

MiR-467g suppresses the osteogenic differentiation and mineralization of mouse preosteoblasts via down-regulation of Runx-2 expression

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